PLoS ONE: let-7 microRNA famiglia è selettivamente secreta nel extracellulare ambiente tramite Esosomi in una cella metastatico cancro gastrico Line

Estratto

Sfondo

Esosomi svolgono un ruolo importante nella cella-a comunicazione -cell, il targeting cellule per trasferire le molecole exosomal tra cui proteine, mRNA e microRNA (miRNA) da parte di un percorso di endocitosi-like. miRNA sono piccole molecole di RNA non codificante in media 22 nucleotidi di lunghezza che regolano numerosi processi biologici, tra cui patogenesi del cancro e mediano gene down-regolazione di mira mRNA per indurre la degradazione dell'RNA e /o interferendo con la traduzione. Recenti rapporti implicano che miRNA possono essere stabilmente rilevati nel plasma e nel siero che circola da miRNA sono confezionati da esosomi da proteggere dalla degradazione dell'RNA. Così, profiling miRNA exosomal hanno bisogno di chiarire la segnalazione intercellulare e scoprire un marcatore di malattia romanzo pure.

Metodologia /Principali risultati

Esosomi sono stati isolati da linee cellulari tumorali in coltura ed è stato convalidato la loro qualità da analisi di microscopia elettronica a trasmissione e western blotting. Una delle linee cellulari testate, una linea cellulare di carcinoma gastrico metastatico, AZ-P7A, ha mostrato la più alta resa di RNA nelle esosomi rilasciati e la forma distintiva nella morfologia. Inoltre, RNA sono stati isolati da cellule e terreni di coltura, e profili di queste tre frazioni miRNA sono stati ottenuti utilizzando l'analisi di microarray. Confrontando intensità di segnale dei dati di microarray e la successiva validazione con RT-PCR, abbiamo scoperto che let-7 famiglia miRNA era abbondante sia nel intracellulare e le frazioni extracellulare dalle cellule AZ-P7A, mentre la bassa metastatico AZ-521, il cellulare dei genitori linea di AZ-P7A, così come altre linee cellulari di cancro non ha mostrato tale propensione.

Conclusioni /Significato

l'arricchimento di let-7 famiglia miRNA nelle frazioni extracellulari, in particolare, nella exosomes dalle cellule AZ-P7A possono riflettere le loro caratteristiche oncogenici, tra cui tumori e delle metastasi. Dal momento che let-7 miRNA in genere svolgono un ruolo tumore soppressiva quanto mira oncogeni come RAS
e HMGA2
, i nostri risultati suggeriscono che le cellule AZ-P7A rilasciano let-7 miRNA tramite exosomes nella ambiente extracellulare da mantenerne la oncogenesi

Visto:. Ohshima K, K Inoue, Fujiwara a, Hatakeyama K, K Kanto, Watanabe Y, et al. (2010) Let-7 microRNA famiglia è selettivamente secreta nel extracellulare ambiente tramite Esosomi in un metastatico cancro gastrico linea cellulare. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Germania |

Ricevuto: 14 Aprile, 2010; Accettato: 10 settembre 2010; Pubblicato: 8 ottobre 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Il lavoro è stata sostenuta da una sovvenzione in collaborazione con tecnologia innovativa e di ricerca avanzata nel evolutiva Area (zona della città) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Le cellule secernono diversi tipi di piccole vescicole di membrana. Esosomi sono una delle vescicole con 30-100 nm di diametro e fisico-chimica distinta da altre vescicole secrete [1]. All'interno esosomi, prodotti genici cellulari, tra cui proteine, mRNA e microRNA (miRNA) sono confezionati e queste molecole possono essere trasferiti alle cellule riceventi per consegnare la loro segnalazione molecolare come ad esempio oncogenesi [2] - [4] e la risposta immunitaria [1], [ ,,,0],5]. Esosomi vengono rilasciati da molti tipi di cellule [6] che include cellule tumorali, cellule epiteliali e cellule ematopoietiche come reticolociti, linfociti T citotossici, cellule B virus trasformato Epstein-Barr, mastociti, cellule dendritiche e piastrine. esosomi secreti sono stati isolati e caratterizzati in vitro
da linee cellulari in coltura [7] insieme a in vivo
nei fluidi corporei [7] compreso il sangue [8], urine [9], la saliva [10], il liquido amniotico [11], e versamenti pleurici maligni [12]. Dal momento che osservata in molti tipi di cellule proliferanti, è ipotizzabile a esacerbare le cellule tumorali, come dimostra la loro maggiore presenza nel plasma e pleurico effusioni di pazienti con tumore [8], [12]. Questa maggiore presenza in non invasive fluidi corporei di pazienti affetti da cancro ha accelerato al profilo componenti molecolari nei exosomes per scoprire marcatori tumorali clinicamente utili e biomarcatori [3], [7], [13].

miRNA sono un classe di RNA non codificanti piccoli che sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica inibendo sia la stabilità e la traduzione di mRNA [14]. Recenti evidenze hanno dimostrato che le mutazioni miRNA o misexpression correlazione con vari tipi di cancro umani e indicano che alcuni miRNA possono funzionare come oncogeni o soppressori tumorali [15], [16]. Per analizzare RNA, è sempre considerare la loro stabilità dalla degradazione da RNasi. Recenti scoperte indicano che miRNA plasmatici endogeni in campioni di sangue sono stabilmente rilevabili in una forma che è resistente all'attività RNasi [17], testimonia l'identificazione dei miRNA nei fluidi corporei come il sangue [17] - [24], l'urina [25], e saliva [10], [26].

le cellule tumorali in coltura sono stati utilizzati per la ricerca di marcatori tumorali. In particolare, le proteine ​​che identificano e peptidi secreti nel mezzo di coltura ha sviluppato con approccio di proteomica basata su [27], [28]. Per quanto riguarda la firma molecolare negli esosomi, proteomica e analisi trascrittomica sono stati effettuati a rivelare tumorigenesi e identificare i candidati marker tumorali [2] - [4], [7], [29]. Qui, per identificare miRNA legato alla tumorigenesi e delle metastasi, abbiamo effettuato un'analisi approfondita miRNA in tre frazioni cellulari, comprese le cellule, esosomi e medie di cellule in coltura. Classifica dei dati di questi miRNA intracellulari ed extracellulari ottenuti mediante l'analisi microarray, abbiamo scoperto che la famiglia let-7 miRNA è ricco di tutte le frazioni di cellule AZ-P7A, una linea metastatico gastrico delle cellule tumorali, che produce la morfologia omogenea e condensato, e alto recupero tasso di miRNA exosomal. Questi risultati sono stati distinti da altre linee cellulari, tra cui linee di cellule del cancro del polmone (SBC-3, NCI-H69, e DMS53), linee di cellule di cancro del colon-retto (SW480 e SW620), e AZ-521, la linea cellulare dei genitori di AZ-P7A. Considerando che consentono-7 funzioni della famiglia di miRNA principalmente come geni soppressori tumorali [30] di indirizzare oncogeni come RAS
e ad alta mobilità gruppo A2 ( HMGA2
) [31], proponiamo che AZ -P7a cellule secernono selettivamente let-7 miRNA nell'ambiente extracellulare via esosomi per mantenere le loro propensioni cancerogeni e metastatici.

Risultati

Isolamento di esosomi da linee cellulari tumorali vari

esosomi sono prodotte da cellule interne per l'ambiente extracellulare tramite un percorso esocitosi simile [1]. Oltre ai fluidi corporei come siero e plasma dal sangue periferico [7], [8], exosomes si trovano nel mezzo di cellule in coltura [7], facilitando l'identificazione di molecole exosomal comprese le proteine, mRNA e miRNA per lo scopo per il loro uso clinico. Profiling tali molecole exosomal prodotte in cellule tumorali in coltura hanno portato alla scoperta di un marcatore candidato romanzo e l'antigene per la diagnostica del cancro e immunoterapia [7]. In questo studio, allo scopo di profilatura miRNA exosomal, abbiamo prima isolati exosomes da terreni di coltura di linee cellulari 46 cancro con vari tipi di tessuto, quali 8 per lo stomaco, 16 per il polmone, 5 per colon, 9 per il pancreas, 3 per la prostata e 5 per il seno. Dopo che le cellule sono state coltivate per 48 h, exosomes stati raccolti con una combinazione di centrifugazione successive e peso molecolare membrane cut-off, come descritto in Materiali e Metodi. La loro purezza delle frazioni exosomal è stata valutata mediante analisi di microscopia elettronica a trasmissione e western blotting. microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato strutture a membrana vescicolari a forma di tondo circa all'interno della dimensione di 100 nm di diametro. Tra tre linee cellulari, SBC-3, AZ-521, e AZ-P7A, è di interesse che la morfologia da cellule AZ-P7A era più omogeneo e condensato di altre cellule (Figura 1A). Immunoelectron microscopia ha mostrato che le particelle extracellulari isolati dal mezzo di coltura di cellule AZ-P7A avevano immunoreattività con un anticorpo contro CD63, una delle proteine ​​di membrana exosomal, sulle membrane capsulari (Figura 1B). La presenza di proteine ​​exosomal noti tra cui CD29 /β1-integrina, Aip1 /Alix e tumore suscettibilità gene 101 (Tsg101) è stato confermato da analisi Western Blot, mentre una proteina localizzata al reticolo endoplasmatico, Bip /GRP78, non era rilevabile (Figura 1C). Questo risultato indica che la contaminazione di materiale derivato da altri compartimenti cellulari delle frazioni exosomal era minimo. La resa di proteine ​​dalle cellule exosomal AZ-P7A era 10 volte superiore a quella di AZ-521 cellule; ~2.5 Proteine ​​mg sono stati ottenuti da 1 × 10 ^{8 celle AZ-P7A.}

Arricchimento di RNA exosomal derivate da cellule AZ-P7A

Dopo l'isolamento, RNA totale exosomal sono stati isolati da 46 linee di cellule in coltura. È interessante notare, le rese di RNA da cellule AZ-P7A erano molto superiori a quelli di altre cellule (Figura 2A). La distribuzione di lunghezza ha mostrato la presenza di grandi quantità di piccoli RNA in exosomes (pannello centrale, Figura 2B). Va notato che vi è una differenza significativa in totale esosomi e le exosomal livelli miRNA tra pazienti con adenocarcinoma polmonare e controlli [8]. linea cellulare AZ-P7A è stato istituito con ripetute inoculazione dei genitori AZ-521 cellule nei topi, ha provocato un elevato potenziale peritoneale-metastatico [32], [33]. Così, i rendimenti elevati sia di RNA e proteine ​​insieme con le caratteristiche morfologiche nelle cellule AZ-P7A possono essere attribuite alle loro elevate propensioni cancerogeni e metastatici. Dal momento che miRNA sono stati rilevati nei liquidi corporei privi di cellule [17] - [20], abbiamo anche effettuato isolamento diretto di RNA totale da terreno di coltura senza procedura per isolare esosomi. Le quantità di RNA totale da mezzi di coltura erano generalmente maggiori di quelle da exosomes (Figura 2A). Distribuzione RNA lunghezza dimostrato che le frazioni miRNA sono stati rilevati nella gamma da 10 a 40 nucleotidi di lunghezza in RNA preparati da terreno di coltura (pannello destro) e exosomes (pannello centrale) da cellule AZ-P7A (Figura 2B). Secondo il protocollo di fabbricazione per gli Bioanalizzatore, picchi con più di 40 lunghezza nucleotide contengono altri piccoli RNA compreso tRNA a 70~90, 5S RNA ribosomiale a 100, e 5.8S RNA ribosomiale a 150, come osservato nella frazione intracellulare (pannello di sinistra) . Questi risultati suggeriscono che possono esistere miRNA nel terreno di coltura di fuori della frazione exosomal anche se RNA si ritiene di essere protetti da RNasi ad essere confezionati in esosomi. In particolare, rispetto alle cellule aderenti, l'incremento dei rendimenti RNA è stato notevolmente maggiore nelle cellule (NCI-H69 e Lu-135) o cellule galleggiante con le popolazioni mix di galleggianti e cellule aderenti (Colo205), che possono essere riflesse dalla contaminazione di RNA capannone da cellule lisate che sono state continuamente lasciati in terreni di coltura.

miRNA profilatura mediante microarray analisi

profili Quieto a intracellulari ed extracellulari frazioni sono state determinate da analisi di microarray per sette linee di cellule di cancro, tra cui AZ- 521, AZ-P7A, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 e SW620. I campioni di terreni di coltura, nonché exosomes forniti segnali di ibridazione (Figura 3), che indica l'esistenza di miRNA in questi campioni. Fino ad oggi, l'analisi dei dati di microarray per miRNA tra i campioni, non sono state apportate metodi chiari per la normalizzazione di intensità del segnale dal momento che è difficile trovare un materiale standard interno adeguato [34]. Così, i dati di microarray miRNA sono stati analizzati in generale, senza la normalizzazione, assumendo che gli importi totali di RNA di ingresso sono costanti tra i campioni [34], [35]. In questo studio, dopo una media di dati microarray miRNA tra due repliche, abbiamo classificato miRNA secondo le loro intensità di segnale. Abbiamo scoperto che let-7 famiglia miRNA come let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7g, e let-7i sono stati rilevati con i segnali relativamente alti in tutto più delle frazioni intracellulari delle sette linee cellulari (Tabella 1, Figura 3). Tuttavia, nessuna o poca intensità di segnale per i miRNA let-7 sono stati rilevati nelle frazioni extracellulari tranne due frazioni extracellulare dalle cellule AZ-P7A e la cultura frazione media dalle cellule NCI-H69 (Tabella 1, Figura 3). In particolare, in entrambi i frazioni extracellulare dalle cellule AZ-P7A, tutti gli otto let-7 miRNA sono stati rilevati anche se il grado di let-7g era inferiore rispetto ad altri sette let-7 miRNA. Sulla base dei modelli distinti di let-7 livelli di miRNA tra le tre frazioni cellulari, abbiamo diviso le sette linee di cellule in tre gruppi (Figura 3) come segue; (1) AZ-P7A, le cellule che let-7 miRNA sono stati trovati in tutte le tre frazioni, (2) AZ-521 con SBC-3, DMS53, SW480 e SW620, le cellule che let-7 miRNA sono stati generalmente in solo frazioni intracellulari, (3) NCI-H69, cellule che consentono-7 miRNA sono stati trovati nelle frazioni intracellulari come pure nel mezzo di coltura in una certa misura.

RT-PCR analisi di intracellulare ed extracellulare let- 7 miRNA famiglia

Abbiamo quindi effettuato RT-PCR quantitativa per la let-7 famiglia di otto miRNA per convalidare i dati di microarray. let-7 miRNA sono stati prontamente individuati nelle frazioni intracellulari ed extracellulari dalle cellule AZ-P7A (Figura 4A) e AZ-521 cellule (Figura 4B). I livelli di let-7 miRNA per RNA di ingresso erano generalmente più alti nelle frazioni extracellulare dalle cellule AZ-P7A che da AZ-521 cellule. Per normalizzare i livelli di miRNA bersaglio ottenuti mediante RT-PCR, U6 snRNA è stato generalmente usato come controllo interno. Abbiamo osservato la presenza di U6 snRNA in tutte le tre frazioni da cellule AZ-P7A e AZ-521 cellule (Figura 4C) e poi confrontato i livelli di let-7 miRNA tra le corrispondenti frazioni di queste due linee cellulari. Dopo la normalizzazione, i livelli di let-7 miRNA tra cui let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, e let-7i in entrambe le frazioni di esosomi e terreni di coltura da AZ-521 cellule sono state abbassato rispetto a quelli da cellule AZ-P7A. Al contrario, non vi era nessuna grande differenza nei livelli intracellulari let-7 miRNA. Abbiamo poi confrontato il livello di exosomal let-7 bis da cellule AZ-P7A con quelli provenienti da altre linee di cellule di cancro, tra cui SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 e SW620, e abbiamo trovato che il livello let-7 bis solo dalle cellule SW620 era relativamente vicino (0,7 volte) per il livello da cellule AZ-P7A (Figura 4E). Si noti che il livello intracellulare di let-7a da cellule SW620 è circa 3,5 volte più abbondante che da cellule AZ-P7A. Sulla base di questi risultati, abbiamo ipotizzato localizzazione let-7a nelle frazioni di cellule e exosomes (Figura 5), ​​e condotto ulteriori analisi. Normalizzato dai livelli U6, abbiamo calcolato i livelli relativi di 7a let-confezionati in esosomi per i livelli di cellulare let-7 bis (Figura 4F). Come risultato, la quantità di exosomal let-7a era molto maggiore nelle cellule AZ-P7A che altri sei celle, suggerendo che le cellule AZ-P7A stati selettivamente e attivamente secreto let-7 miRNA famiglia nell'ambiente extracellulare tramite exosomes.

Discussione

Nel presente studio, abbiamo rivelato che la famiglia let-7 miRNA è stata secreta nell'ambiente extracellulare con i mezzi exosomal, che era specifico per una linea di cellule di cancro gastrico metastatico, AZ-P7A. let-7 famiglia miRNA nel umano è costituito da 10 sequenze di 13 precursori [30]. In generale, let-7 miRNA agiscono come un soppressore del tumore da oncogeni di targeting come RAS
e HMGA2
e let-7 miRNA sono inibiti in molti tumori da organi solidi [31]. cellule AZ-P7A possiedono una capacità metastatica con diffusione peritoneale in topi nudi [32], [33]. Quindi, proponiamo che il rilascio exosomal di let-7 miRNA nei risultati ambiente extracellulare in diminuzione di effetto anti-cancerogeno all'interno delle cellule, che portano a mantenere la loro oncogenesi e l'invasività. D'altra parte, let-7 miRNA giocano meno frequentemente una funzione oncogena, a causa di aumento di espressione ipometilazione nel locus let-7 [36] o destinata a caspasi-3 mRNA [37]. In questo caso, il rilascio exosomal di let-7 miRNA può provocare la trasformazione in cellule bersaglio, trasferendo le loro proprietà oncogeniche.

Nei pazienti con cancro del polmone, i livelli totali di esosomi e le loro miRNA incremento rispetto ai controlli [8 ]. È stato dimostrato che esosomi tumorali inducono meccanismo di fuga immunitaria nei tumori per apoptosi spontanea T cellulare [38] - [40]. In questo studio, abbiamo dimostrato la morfologia omogenea e l'arricchimento di RNA in esosomi da cellule AZ-P7A metastatici. Questo può essere riflessa dalla loro tumorigenicità.

miRNA sono molto stabili nel plasma sanguigno e siero da protetto da RNasi [17]. Così, rende i livelli di miRNA testati per la diagnosi clinica come marcatori tumorali e biomarcatori. Come è successo? Chin et al. hanno suggerito due ipotesi per l'origine dei miRNA su campioni di sangue circolante; può essere dovuto ad un risultato di morte delle cellule tumorali e lisi o rilascio da parte delle cellule tumorali nel microambiente extracellulare dei vasi sanguigni [19]. Al contrario di cellule aderenti, abbiamo osservato che la quantità di RNA totali in terreni di coltura erano relativamente superiori a quelli esosomi per celle con galleggiante proprietà come NCI-H69, Lu-135, e Colo205. Questo incremento probabilmente ha provocato la contaminazione del RNA dalle cellule morte in terreni di coltura.

Per la scoperta di marcatori e biomarcatori tumorali del sangue romanzo, omiche approcci tra cui la proteomica e trascrittomica sono condotte sia con l'analisi diretta di campioni di sangue o di applicazione di profiling in campioni di tessuto. Ci sono notizie contraddittorie se se i profili di miRNA e mRNA nel sangue sono in parallelo con il profilo del tumore. La firma dei miRNA exosomal riflette quella delle cellule tumorali provenienti in pazienti con adenocarcinoma del polmone [8] e il cancro al seno [41]. D'altra parte, Skog et al. hanno dimostrato che l'analisi di microarray per mRNA derivati ​​da cellule di glioblastoma ei corrispondenti exosomes rivelate mRNA rilevati esclusivamente in microvescicole, ipotizzando che mRNA sono localizzati ad una regione specifica del citoplasma [3]. Inoltre, Tanaka et al. hanno dimostrato che il livello di miR-92a diminuito nel plasma sanguigno di pazienti con leucemia acuta mentre la sua forte espressione è stato trovato in campioni di tessuto [24]. I nostri risultati su arricchimento selettivo di let-7 miRNA famiglia in AZ-P7A exosomes fit con quest'ultimo caso le cellule-derivati. A meno che le molecole target sono miRNA derivati ​​da cellule tumorali circolanti, suggerisce un'attenta indagine sono necessari per utilizzare i profili dei miRNA in campioni di tessuto per la rilevazione in campioni di siero o plasma
.

Dato che esosomi sono prodotti in cellule ematopoietiche e le cellule epiteliali , sangue circolante contiene esosomi derivati ​​da entrambi i tipi di cellule. In generale, per indagare profili exosomal di proteine, mRNA e miRNA nel siero e plasma, esosomi derivate da tumori con caratteristiche epiteliali sono separati da quelli da cellule ematopoietiche [8], [13]. Questa operazione viene eseguita mediante purificazione per affinità con anticorpi contro molecole come EpCAM che esprimono sulla superficie delle cellule epiteliali. I nostri risultati che ci sono stati simili livelli di let-7 famiglia miRNA tra exosomes e terreni di coltura di cellule AZ-P7A suggeriscono che questi livelli di miRNA possono essere misurati senza isolare esosomi da campioni clinici come siero e plasma.

conclusione, questo studio ha dimostrato che let-7 miRNA famiglia è ricca di esosomi da una linea cellulare di carcinoma gastrico metastatico, le cellule AZ-P7A. Dal momento che let-7 miRNA sono coinvolti nel processo di proliferazione [31], la loro secrezione exosomal può svolgere un ruolo importante nella tumorigenesi e delle metastasi.

Materiali e Metodi

Cell cultura

linee cellulari di cancro allo stomaco dell'uomo (AZ-521, MKN45, KATOIII, e NUGC-3), linee di cellule di cancro al polmone umano (SBC-3, LU-65, LU-135, e KNS-62), e le cellule tumorali pancreatiche umane ( Suit-2) sono stati acquistati da collezione giapponese di risorse biologiche di ricerca. cellule dello stomaco umano tumorali (SNU-1), le linee di cellule di cancro del polmone umano (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, e HCC827), le cellule umane di mesotelioma (MSTO-H211), del colon-retto linee cellulari tumorali umane (SW480, SW620, Colo205, LoVo, e HCT116, linee di cellule di cancro pancreatico umano (BxPC-3, ASPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, e Capan-2), linee di prostata umana di cellule di cancro (PC-3, SU145, e LNCaP), e linee di cellule di cancro al seno umano (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, e MDA-MB-231) sono stati acquistati da American Type Culture Collection. MKN28 (le cellule tumorali dello stomaco umano) e PSN-1 (umani cellule tumorali pancreatiche) sono stati acquistati da laboratori di Immuno-biologici e Raccolta europea della cultura cellulare, rispettivamente . linee di cellule di cancro dello stomaco umano, AZ-P7A [32], [33] e MKN45P [42] erano dono di Drs. Yutaka Yonemura e Yoshio Endo. Nelle cellule AZ-521 e AZ-P7A, non sono stati osservati i prodotti di RT-PCR per 14 retrovirus, tra cui HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, e ADV di tipo 1 (dati non riportati), escluse le infezioni da questi retrovirus in entrambe le linee cellulari . Le cellule sono state mantenute in terreno RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) supplementato con 10% siero bovino fetale inattivato al calore (Invitrogen), 100 U /ml di penicillina, e 0,1 mg /ml streptomicina.

Produzione e isolamento di esosomi

cellule aderenti sono state seminate a 150 mm-piatti al numero adeguato di cellule che vanno da 3 × 10 ^{6 a 1 × 10 7 cellule per piatto, mentre le cellule galleggianti sono stati inoculati in 75 cm 2-pallone a 2~2.5 × 10 7 cellule per pallone. Le cellule sono state coltivate in terreno RPMI-1640 completa di 25 ml e 50 ml per piatti e flaconi, rispettivamente, per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO _{2, lavate due volte con tampone fosfato salino (PBS), e incubate 48 h in fenolo terreno RPMI-1640 aneritro (Sigma-Aldrich) contenente 10% di siero fetale bovino inattivato al calore che è stato precedentemente impoverito contaminare microvescicole per centrifugazione notte a 100.000 xg. Esosomi sono stati isolati dal totale cellule che vanno da 6 × 10 7-3 × 10 8 celle come descritto in precedenza [29]. Brevemente, terreno di coltura è stato raccolto e centrifugato a 800 g per 5 min e ulteriori 2.000 g per 10 minuti per rimuovere le cellule sollevato. Il surnatante è stato sottoposto a filtrazione su membrana filtrante polietersulfone 0,1 micron pori (Corning) per rimuovere i detriti cellulari e grandi vescicole, seguito da concentrazione da 100.000 Mw membrane cut-off (CentriPlus-70, Millipore). Il volume del surnatante è stato ridotto da circa 250-500 ml a circa 30 ml. Il surnatante è stato quindi ultracentrifugato a 100.000 xg per 1 ora a 4 ° C con rotore 70Ti (Beckman Coulter). I pellets ottenuti sono stati risospesi in 6 ml di PBS e ultracentrifugati a 100.000 g per 1 ora a 4 ° C con rotore 100Ti (Beckman Coulter).}}

microscopia elettronica a trasmissione

Gli esosomi pellet, sono stati miscelati con pari quantità di preparato fresco glutaraldeide 2% in PBS, incubate overnight a 4 ° C, postfissati con 1% tetrossido di osmio in PBS a 4 ° C per 2 h, e disidratati in una serie graduata di etanolo. Dopo la disidratazione, i campioni sono stati trasferiti a ossido di propilene ed inclusi in resina epossidica Quetol 812 (Nisshin EM). Le sezioni ultrasottili sono stati tagliati con Ultracut UCT (LEICA), colorati con acetato di uranile e citrato di piombo, e osservati con il JEM-1230 Electron Microscope (JEOL). Immunoelectron analisi microscopica è stata eseguita secondo il metodo descritto da Xiao et al. [43] con piccole modifiche. In breve, esosomi sono state mescolate e inoculate con il mouse anti-umano di anticorpi CD63 monoclonale (catalogo n. Sc-51662, Santa Cruz) per 1 ora a temperatura ambiente. Il campione è stato lasciato cadere sulla superficie della membrana di una maglia in rame (collodio /carbonio rivestito 400 maglie, Nisshin EM) e incubate per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo lavaggio con PBS, immunogold capra coniugato anti-topo IgG (catalogo n. EM.GMHL15, BBInternational) diluito al 1:20 è stata abbandonata sulla membrana. La maglia di rame è stata lanciata nelle goccioline con la superficie della membrana affrontato giù a temperatura ambiente per 30 min. Dopo lavaggio con PBS, le gocce di acetato di uranile è stato messo sulla superficie maglia di rame e colorati a temperatura ambiente per 30 s. Esosomi con particelle di oro colloidale nere sulle membrane capsulari sono stati contrassegnati come positivo sotto il microscopio elettronico a trasmissione.

Western Blot

Cellule e frazioni exosomal sono state lavate, risospese in un tampone di lisi [7.5 M urea (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiourea (Sigma-Aldrich), 12,5% glicerolo (Wako), 50 mM Tris, 2.5% n-ottil-beta-D-glucoside (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- carbossietil) fosfina cloridrato (Sigma-Aldrich), 1,25 mM inibitore della proteasi (catalogo n. P2714, Sigma-Aldrich)], ed incubate per 1 ora a 4 ° C utilizzando il rotatore RT-50 (TAITEC). Dopo centrifugazione a 14.000 xg per 60 min a 4 ° C, il supernatante è stato raccolto e la concentrazione proteica è stata determinata dalla Protein Assay Kit Bradford (Bio-Rad). Una porzione di proteine ​​(10 mg) sono stati denaturato facendo bollire in tampone Laemmli, eseguito su 10% SDS-poliacrilammide, e trasferito a membrane PVDF Immobilon-P (0,45 micron di dimensione dei pori, Millipore). I blot sono stati bloccati per 1 h con 5% di latte secco non grasso in soluzione salina tamponata con Tris contenente Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl e 0,01% Tween 20). Dopo aver bloccato le membrane sono state incubate con ogni anticorpo primario o antisiero tra cui coniglio anti-Tsg101 siero (catalogo n. T5951, Sigma-Aldrich), capra siero anti-Aip1 /Alix (catalogo n. Sc-49268, Santa Cruz), monoclonale di topo anti-CD29 /β1-integrina (catalogo n. SC-610.468, BD Biosciences), e il mouse monoclonale anti-Bip /GRP78 (catalogo n. 610.979, BD Biosciences) a una diluizione di 1:200 per 1 ora a temperatura ambiente. I blot sono stati poi incubati con il corrispondente anticorpo secondario anti-IgG coniugato con perossidasi di rafano (Jackson Laboratories) alla diluizione di 1:2,000 per 1 ora a temperatura ambiente. proteine ​​specifiche sono state visualizzate utilizzando il sistema ECL (GE Healthcare) e il FUJIFILM luminescenti immagine Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Il peso molecolare della proteina è stata dedotta usando l'Protein Standards Precision Plus (Bio-Rad Laboratories).

Isolamento RNA

Per l'isolamento dell'RNA dal terreno di coltura, le cellule sono state seminate come descritto sopra. 48 ore dopo coltivate, terreno di coltura è stato raccolto e centrifugato a 800 g per 5 min e ulteriori 2.000 g per 10 min. Il surnatante è stato sottoposto a filtrazione su membrana filtrante polietersulfone 0,22 micron pori (Corning), seguito da concentrazione di 5.000 Mw membrane cut-off (Centricon Plus 70, Millipore). Il volume finale del sopranatante è stato di circa 10-20 ml di volume iniziale di 250-500 ml. Il surnatante è stato mescolato con un volume uguale di QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) e seguita la procedura per l'isolamento di RNA descritto di seguito. L'RNA totale è stato isolato dalle cellule, esosomi, o terreni di coltura utilizzando il kit miRNeasy Mini (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. Per rimuovere DNA genomico, 40 mg di RNA cellulare totale sono stati incubati con 40 unità di DNasi RQ1 RNase-free (Promega) a 37 ° C per 30 min in presenza di 40 unità di RNasin Inoltre RNase Inhibitor (Promega). Per RNA totale da exosomes e terreni di coltura, tutti gli importi dei prodotti grezzi sono stati trattati nello stesso procedimento, salvo che l'uso di 5 U DNasi. L'RNA è stato purificato utilizzando il kit di pulitura RNeasy MinElute (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. I campioni di RNA sono stati quantificati con uno spettrofotometro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) e valutati utilizzando il Agilent piccolo RNA Kit e Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

microarray analisi

Per miRNA profiling, 100 ng e 20 ng di RNA totale cellulari ed extracellulari, rispettivamente, erano fluorescenza-etichettato con il completo reagente Etichettatura miRNA e Kit Ibrida (Agilent Technologies) secondo il protocollo del produttore (Agilent miRNA microarray versione 2.2). L'analisi completa di miRNA è stata eseguita utilizzando il miRNA Microarray Kit umana (8 × 15 K) versione 3.0 (Agilent). segnali di ibridazione sono stati rilevati con il DNA microarray scanner (Agilent Technologies). Le immagini acquisite sono stati analizzati utilizzando la funzione software di estrazione e di dati Agilent analisi è stata effettuata utilizzando il software GeneSpring GX (Agilent Technologies). I dati discussi in questo manoscritto sono stati depositati nella espressione genica di NCBI Omnibus (GEO) e sono accessibili attraverso GEO serie numero di accesso GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

Reverse trascrizione (RT) e RT-PCR quantitativa per miRNA analisi

livelli quantitativi di miRNA sono stati determinati utilizzando real-time RT-PCR con i Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) per l'uomo let-7 bis (test ID 000.377), let-7b (test ID 002.619), let-7c (test ID 000.379), let-7d (test ID 002.283 ), let-7e (test ID 002.406), let-7f (ID saggio 000.382), let-7g (test ID 002.282), let-7i (test ID 002.221), e U6 snRNA (test ID 001.973) come controllo endogeno . Dieci ng di RNA totale sono stati sottoposti a trascrizione inversa con TaqMan® Universal PCR Master Mix Non AmpErase (Applied Biosystems) ed i rispettivi reagenti TaqMan® per geni bersaglio. RT-PCR è stata effettuata in un volume totale di 20 microlitri miscela di reazione secondo il protocollo del produttore. L'amplificazione è stata effettuata come segue: 95 ° C per 10 minuti, 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 60 s. I campioni sono stati analizzati in triplicato come replicare biologica o quadruplice come replicare tecnica. I livelli di miRNA sono stati definiti dal ciclo soglia (Ct), il metodo Ct comparativo, e la normalizzazione dal livello di U6 snRNA in ciascun campione. Fold aumenta o diminuisce in ogni livello miRNA di linee cellulari testate sono stati determinati con riferimento al livello di linea di cellule AZ-P7A.

Riconoscimenti

ringraziare i membri del Centro Research Institute Shizuoka cancro per i molti suggerimenti utili. Ringraziamo anche Drs. Yutaka Yonemura e Yoshio Endo per il regalo di linee cellulari AZ-P7A e MKN45P.

• PLoS ONE: Un Gene Expression Firma del Acquisita chemioresistenza al cisplatino e fluorouracile chemioterapia di combinazione in pazienti cancro gastrico
• PLoS ONE: ipossia-inducibile fattore 1α Determina cancro gastrico chemiosensibilità attraverso la modulazione di p53 e NF-kB