PLOS ONE: Låt-7 MicroRNA Familj selektivt utsöndras i den extracellulära miljön via exosomes i en magsäckscancer cellinje

Abstrakt

Bakgrund

exosomer spelar en viktig roll i cell-till-cellkommunikation, med inriktning på celler för att överföra exosomal molekyler inklusive proteiner, mRNA och mikroRNA (miRNA) av en endocytosis- liknande väg. miRNAs är små icke-kodande RNA-molekyler i genomsnitt 22 nukleotider i längd som reglerar många biologiska processer, inklusive cancer patogenes och förmedlar gen nedreglering genom att rikta mRNA för att inducera RNA nedbrytning och /eller störa översättning. Nya rapporter antyder att miRNA kan detekteras stabilt i plasma och serum eftersom miRNA förpackas av exosomes som skall skyddas från RNA nedbrytning. Således, profil exosomal miRNAs är i behov av att klargöra intercellulär signalering och upptäcka en ny sjukdom markör liksom.

Metodik /viktigaste resultaten

exosomes isolerades från odlade cancercellinjer och deras kvalitet validerades genom analyser av transmissionselektronmikroskopi och western blotting. En av de testade cellinjer, en magsäckscancer cellinje, AZ-P7a visade den högsta RNA avkastning i de frigjorda exosomes och distinkt form i morfologi. Dessutom har RNA isolerades från celler och odlingsmedia, och profiler av dessa tre miRNA fraktioner erhållna med användning av microarray analys. Genom att jämföra signalintensiteterna microarray uppgifter och efter validering med hjälp av RT-PCR-analys, fann vi att låta-7 miRNA familj var rikligt i både intracellulära och extracellulära fraktioner från AZ-P7a celler, medan låg metastatisk AZ-521, föräldracellen raden av AZ-P7a, liksom andra cancercellinjer visade ingen sådan benägenhet.

slutsatser /Betydelse

berikning av låt-7 miRNA familj i extracellulära fraktioner bestämt i exosomes från AZ-P7a celler kan återspegla deras onkogena egenskaper inklusive tumörbildning och metastas. Eftersom låt-7 miRNA spelar i allmänhet en tumör-undertryckande roll som inriktnings onkogener såsom RAS Mössor och HMGA2
våra resultat tyder på att AZ-P7a celler släpper låt-7 miRNA via exosomes i extracellulära miljön för att bibehålla sin onkogenes

Citation:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Låt-7 MicroRNA Familj selektivt utsöndras i den extracellulära miljön via exosomes i en magsäckscancer cellinje. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10.1371 /journal.pone.0013247

Redaktör: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland

Mottagna: 14 april, 2010. Accepteras: 10 september 2010. Publicerad: 8 october 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Arbetet stöddes av ett bidrag i samarbete med innovativ teknik och avancerad forskning i evolutionärt Area (stadsområde) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Celler utsöndrar olika typer av små membranvesiklar. Exosomer är en av de vesiklar med 30-100 nm diameter och fysikalisk-kemiskt distinkt från andra utsöndrade vesiklar [1]. Inuti exosomes, cellulära genprodukter inkluderande proteiner, mRNA och mikroRNA (miRNA) är paketerade och dessa molekyler kan överföras till mottagarceller att leverera deras molekylära signaleringen såsom onkogenes [2] - [4] och immunsvar [1], [ ,,,0],5]. Exosomer frigörs av många typer av celler [6], som omfattar tumörceller, epitelceller, och hematopoetiska celler såsom retikulocyter, cytotoxiska T-lymfocyter, Epstein-Barr-virustransformerade B-celler, mastceller, dendritiska celler, och blodplättar. Utsöndrade exosomer har isolerats och karakteriserats In vitro
odlade cellinjer [7] tillsammans med In vivo
i kroppsvätskor [7] inklusive blod [8], urin [9], saliv [10], fostervatten [11], och maligna pleurautgjutning [12]. Eftersom observerats i många prolifererande celltyper, är det tänkbart att förvärra tumörceller, vilket framgår av deras ökade närvaro i plasma och pleurautgjutning av patienter med cancer [8], [12]. Denna ökade närvaro i icke-invasiva kroppsvätskor från cancerpatienter har accelererat att profilera molekylära komponenter i exosomes för att upptäcka kliniskt användbara tumörmarkörer och biomarkörer [3], [7], [13].

miRNA är en klass av icke-kodande små RNA som är inblandade i post-translationell reglering av genuttryck genom att hämma både stabilitet och translation av mRNA [14]. Nya rön har visat att miRNA mutationer eller misexpression korrelerar med olika humana cancerformer och indikerar att vissa miRNA kan fungera som onkogener eller tumörsuppressorer [15], [16]. För att analysera RNA, är det alltid att fundera över sin stabilitet mot nedbrytning av RNas. Nya undersökningar visar att endogena plasma miRNA i blodprov är stabilt detekteras i en form som är resistent mot RNas aktivitet [17], framgår av identifiering av miRNA i kroppsvätskor såsom blod [17] - [24], urin [25], och saliv [10], [26].

Odlade cancerceller har använts för att söka efter tumörmarkörer. I synnerhet har identifiera proteiner och peptider som utsöndras i odlingsmediet som utvecklats av proteomik baserad strategi [27], [28]. När det gäller molekylär signatur i exosomes, har proteomik samt transkriptomik analyser utförts för att avslöja tumörbildning och identifiera tumörmarkör kandidater [2] - [4], [7], [29]. Här, för att identifiera miRNA i samband med tumörbildning och metastas, utförde vi omfattande miRNA analys i tre cellulära fraktioner inklusive celler, exosomes och medel från odlade celler. Ranking data för dessa intracellulära och extracellulära miRNA erhållits genom microarray analys, fann vi att låta-7 miRNA familj är rik på alla fraktioner från AZ-P7a celler, en magsäckscancer cellinje, som producerar homogen och kondenserad morfologi och hög återhämtning hastighet av exosomal miRNA. Dessa fynd var distinkt från andra cellinjer inkluderande lungcancer-cellinjer (SBC-3, NCI-H69, och DMS53), kolorektala cancercellinjer (SW480 och SW620), och AZ-521, den parentala cellinjen enligt AZ-P7a. Med tanke på att låta-7 miRNA familjen fungerar främst som tumörsuppressorgener [30] att rikta onkogener såsom RAS Mössor och hög mobilitet grupp A2 ( HMGA2
) [31], föreslår vi att AZ -P7a celler selektivt utsöndrar låt-7 miRNA i den extracellulära miljön via exosomes att behålla sina tumörogena och metastaserande böjelser.

Resultat

Isolering av exosomes från olika cancercellinjer

exosomer produceras från inre cellerna till den extracellulära miljön via en exocytos liknande reaktionsvägen [1]. I tillägg till kroppsvätskor, såsom serum och plasma från perifert blod [7], [8], exosomer finns i mediet av odlade celler [7], underlätta identifieringen av exosomal molekyler inkluderande proteiner, mRNA och miRNA för målet för deras kliniska användning. Profilering sådana exosomal molekyler som produceras i odlade cancerceller har lett till upptäcka en ny kandidat markör och antigen för cancerdiagnostik och immunterapi [7]. I denna studie, i syfte att profilerings exosomal miRNA, vi först isolerade exosomer från odlingsmedia av 46 cancercellinjer med olika vävnadstyper, som inkluderar 8 för magen, 16 för lung-, 5 för kolon, 9 för bukspottkörtel, 3 för prostata och 5 för bröst. Efter celler odlades under 48 timmar tillsattes exosomer uppsamlades med en kombination av på varandra följande centrifugering och molekylvikt cut-off-membran, såsom beskrivits i Material och Metoder. Deras renhet av exosomal fraktionerna bedömdes genom analyser av transmissionselektronmikroskopi och western blotting. Transmissionselektronmikroskopi visade rund formade vesikulära membranstrukturer ungefär inom storleken av 100 nm i diameter. Bland tre cellinjer, SBC-3, AZ-521, och AZ-P7a, är det av intresse att morfologin från AZ-P7a celler var mer homogen och kondenseras än andra celler (Figur 1A). Immunelektronmikroskopi visade att de extracellulära partiklar som isolerats från odlingsmediet av AZ-P7a celler hade immunoreaktivitet med en antikropp mot CD63, en av de exosomal membranproteiner, på kapsulära membran (Figur 1B). Närvaro av kända exosomal proteiner inkluderande CD29 /β1-integrin, AIP1 /Alix och tumör känslighet gen 101 (Tsg101) bekräftades genom western blot-analys, medan ett protein lokaliserat till endoplasmatiskt retikulum, Bip /Grp78, var odetekterbar (figur 1C). Detta resultat tyder på att kontaminering av material som härrör från andra cellulära fack i exosomal fraktionerna var minimal. Utbytet av exosomal proteiner från AZ-P7a cellerna var 10 gånger högre än den från AZ-521-celler; ~ 2,5 mg proteiner erhölls från 1 x 10 ^{8 AZ-P7a celler.}

Anrikning av exosomal RNA härrör från AZ-P7a celler

Efter isolering exosomal totala RNA isolerades från 46 odlade cellinjer. Interestingly, de RNA utbyten från AZ-P7a celler var mycket större än de från andra celler (Figur 2A). Fördelningen i längd visade närvaro av stora mängder av små RNA i exosomes (center panel, figur 2B). Det bör noteras att det finns en signifikant skillnad i total exosomes och exosomal miRNA nivåer mellan patienter med lung adenocarcinom och kontroller [8]. AZ-P7a cellinje bildades genom upprepad ympning av föräldra AZ-521-celler i möss, resulterade i hög peritoneal-metastatisk potential [32], [33]. Sålunda kan höga utbyten av både RNA och protein tillsammans med morfologiska kännetecken i AZ-P7a celler tillskrivas deras höga tumorigena och metastatiska propensities. Eftersom miRNAs har påvisats i cellfria kroppsvätskor [17] - [20], också genomförde vi direkt isolering av den totala RNA från odlingsmedium utan förfarandet för att isolera exosomes. Mängderna av den totala RNA från odlingsmedium var i allmänhet större än de från exosomes (Figur 2A). RNA fördelning i längd visade att miRNA fraktioner detekterades i intervallet från 10 till 40 nukleotid längd i RNA framställda från odlingsmedium (högra panelen) samt exosomes (center panel) från AZ-P7a celler (Figur 2B). Enligt tillverkarens protokoll för Bioanalyzer, toppar med längre än 40 nukleotid längd innehålla andra små RNA inklusive tRNA vid 70~90, 5S ribosomalt RNA vid 100, och 5.8S ribosomalt RNA vid 150, såsom observerats i den intracellulära fraktionen (vänster fält) . Dessa resultat tyder på att miRNAs kan existera i odlingsmediet utanför exosomal fraktionen även RNA tros vara skyddade från RNaser som packas i exosomes. Speciellt jämfört med vidhäftande celler, inkrementet av RNA-utbyten var anmärkningsvärt större i flytande celler (NCI-H69 och Lu-135) eller celler med mix populationer av flytande och vidhäftande celler (Colo205), som kan reflekteras av kontaminering av RNA shed från lyserade celler som har kontinuerligt kvar i odlingsmedia.

miRNA profilering av microarray analys

miRNA profiler i de intracellulära och extracellulära fraktioner bestämdes genom microarray analys för sju cancercellinjer inkluderande AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 och SW620. Prover från odlingsmedier samt exosomes som hybridiseringssignaler (Figur 3), vilket indikerar förekomsten av miRNA i dessa prover. Hittills, analysera microarray data för miRNA bland prover har inga tydliga metoder gjorts för normalisering av signalstyrka, eftersom det är svårt att hitta en lämplig intern standardmaterial [34]. Således har miRNA microarray uppgifter varit allmänt analyseras utan normalisering, förutsatt att de totala mängderna av ingångs RNA är konstant bland prov [34], [35]. I denna studie, efter medelvärdes miRNA microarray data mellan två replikat, rankas vi miRNA enligt deras signalintensiteterna. Vi fann att låta-7 miRNA familjen såsom låt-7a, låt-7b, låt-7c, låt-7d, låt-7e, låt-7f, låt-7g, och låt-7i detekterades med relativt höga signaler under större delen av de intracellulära fraktionerna från de sju cellinjer (Tabell 1, Figur 3). Men ingen eller liten signalnivåer för LET-7 miRNAs upptäcktes i de extracellulära fraktioner utom både extracellulära fraktioner från AZ-P7a celler och odlingsmedium fraktion från NCI-H69-celler (Tabell 1, Figur 3). Särskilt i de båda extracellulära fraktioner från AZ-P7a celler, hela åtta låt-7 miRNA upptäcktes även rang låt-7g var lägre än övriga sju låt 7 miRNA. Baserat på de distinkta mönster av Let-7 miRNA nivåer mellan de tre cellfraktioner, vi delat in sju cellinjer i tre grupper (Figur 3) enligt följande; (1) A-P7a, celler som gör-7 miRNAs påträffades i samtliga tre fraktioner (2) AZ-521 tillsammans med SBC-3, DMS53, SW480 och SW620 celler som gör-7 miRNA allmänhet återfinns i endast intracellulära fraktioner, (3) NCI-H69, celler som gör-7 miRNA hittades i de intracellulära fraktioner såväl som i odlingsmediet i viss utsträckning.

RT-PCR-analyser av intracellulära och extracellulära uthyrningsbar 7 miRNA familj

Vi sedan utförde kvantitativ RT-PCR för åtta låt-7 miRNA familj att validera microarray data. låt-7 miRNA ades lätt detekteras i de intracellulära och extracellulära fraktioner från AZ-P7a celler (Figur 4A) och AZ-521-celler (Figur 4B). Nivåerna av låt-7 miRNA per ingångs RNA var i allmänhet högre i de extracellulära fraktioner från AZ-P7a celler än från AZ-521 celler. För normalisering nivåerna av mål-miRNA erhållna genom RT-PCR har U6 snRNA varit allmänt används som en intern kontroll. Vi observerade förekomsten av U6 snRNA i alla tre fraktioner från AZ-P7a celler och AZ-521-celler (Figur 4C) och sedan jämförde nivåerna av Let-7 miRNA mellan motsvarande fraktionerna från dessa två cellinjer. Efter normalisering, nivåerna av Let-7 miRNA inklusive låt-7a, låt-7b, låt-7c, låt-7d, låt-7e, och låt-7i i både fraktioner av exosomes och odlingsmedia från AZ-521-celler sänks jämfört med de från AZ-P7a celler. Tvärtom, det var ingen stor skillnad i nivåerna av intracellulära låt-7 miRNA. Vi nästa jämförde graden av exosomal låt-7a från AZ-P7a celler med bidrag från andra cancercellinjer inklusive SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 och SW620, och fann att låta-7a endast nivå från SW620 celler var relativt nära (0,7 gånger) till nivån från AZ-P7a celler (Figur 4E). Det bör noteras att den intracellulära nivån av låt-7a från SW620 celler var ungefär 3,5 gånger rikligare än från AZ-P7a celler. Baserat på dessa resultat, vi trodde lokalisering av låt 7a i fraktionerna av celler och exosomes (Figur 5), och leds vidare analys. Normaliseras av U6 nivåer, vi beräknade relativa nivåerna av låt-7a förpackade i exosomes per nivåerna av cellulär låt-7a (Figur 4F). Som ett resultat, mängden av exosomal let-7a var mycket större i AZ-P7a celler än sex andra celler, vilket tyder på att AZ-P7a cellerna selektivt och aktivt utsöndrades let-7 miRNA familjen i den extracellulära miljön via exosomes.

Diskussion

i den aktuella studien visade vi att låta-7 miRNA familj utsöndras i den extracellulära miljön via exosomal transport, som var specifik för en magsäckscancer cellinje, AZ-P7a. låt-7 miRNA familjen i mänsklig består av 10 sekvenser från 13 prekursorer [30]. I allmänhet, låt-7 miRNA fungera som en tumörsuppressor genom inriktnings onkogener såsom RAS Mössor och HMGA2 Mössor och låt-7 miRNA nedregleras i många cancerformer från fasta organ [31]. AZ-P7a celler har en metastatisk förmåga med peritoneal spridning i nakna möss [32], [33]. Därför föreslår vi att exosomal frisättning av låt-7 miRNA i den extracellulära miljön resulterar i minskning av anti-tumörframkallande effekt i cellerna, vilket leder till att behålla sin onkogenes och invasiv. Å andra sidan, låt-7 miRNA spelar mindre ofta en onkogen funktion, på grund av att öka uttrycks genom hypometylering på låt-7 locus [36] eller inriktning kaspas-3-mRNA [37]. I detta fall kan exosomal frisättning av låt-7 miRNAs orsaka transformation i målceller genom att överföra sina onkogena egenskaper.

Hos patienter med lungcancer, öka den totala nivåer av exosomes och deras miRNA jämfört med kontroller [8 ]. Det har visats att tumör exosomes inducera immunflyktmekanism i cancer genom spontan T-cell apoptos [38] - [40]. I denna studie har vi visat homogen morfologi och anrikning av RNA i exosomes från metastatic AZ-P7a celler. Detta kan återspeglas av deras tumorigenicitet.

miRNAs är mycket stabila i blodplasma och serum sedan skyddas från RNaser [17]. Således gör det miRNA nivåer testas för klinisk diagnos som tumörmarkörer och biomarkörer. Hur går det till? Chin et al. har föreslagit två hypoteser för källan miRNA på cirkulerande blodprover; det kan bero på att ett resultat av tumörcelldöd och lyserar eller utsläpp av tumörceller in i den extracellulära mikromiljön av blodkärl [19]. Tvärtom till vidhäftande celler, observerade vi att mängden av den totala RNA i odlingsmedier var relativt sett högre än i exosomes för celler med flytande egendom såsom NCI-H69, Lu-135, och Colo205. Denna ökning ledde troligen i förorening av RNA från döda celler i odlingsmedia.

För upptäckten av nya blodtumörmarkörer och biomarkörer, omik närmar inklusive proteomik och transkriptomik genomförs antingen genom direkt analys av blodprover eller tillämpning profilering i vävnadsprover. Det finns motstridiga rapporter om så om profilerna för miRNA och mRNA i blodet är parallella med tumören profil. Undertecknandet av exosomal miRNA speglar det av ursprungstumörceller hos patienter med lung adenokarcinom [8] och bröstcancer [41]. Å andra sidan, Skog et al. har visat att microarray analys för mRNA som härrör från glioblastomceller och motsvarande exosomes avslöjade mRNA enbart detekteras i mikrovesiklar, spekulerar att mRNA är lokaliserade till en specifik region av cytoplasma [3]. Dessutom Tanaka et al. har visat att nivån av MIR-92a minskade i blodplasman av akuta leukemipatienter medan dess starkt uttryck återfanns i vävnadsproverna [24]. Våra resultat på selektiv anrikning av låt-7 miRNA familj i AZ-P7a celler härrörande exosomes passar med senare fallet. Såvida målmolekyler är miRNA härledda från cirkulerande tumörceller, antyder det noggranna undersökningar behövs för att använda miRNA profiler i vävnadsprover för detektering i serum- eller plasmaprover.

Eftersom exosomes produceras i hematopoietiska celler såväl som epitelceller cirkulerande blod innehåller exosomes härrör från båda typerna av celler. I allmänhet, för att undersöka exosomal profiler av proteiner, mRNA och miRNA i serum och plasma är exosomer härledda från tumörer med epiteliala egenskaper separeras från de från hematopoietiska celler [8], [13]. Detta utförs med hjälp av affinitetsrening med antikroppar mot molekyler såsom EpCAM som uttrycker på ytan av epitelceller. Våra resultat att det fanns liknande nivåer av låt-7 miRNA familj mellan exosomes och odlingsmedia från AZ-P7a celler tyder på att dessa miRNA nivåer kan mätas utan att isolera exosomes från kliniska prover, såsom serum och plasma.

Sammanfattningsvis visade denna studie att låta-7 miRNA familj är rik på exosomes från en magsäckscancer cellinje, AZ-P7a celler. Eftersom låt-7 miRNA är involverade i spridningsprocessen [31], deras exosomal sekre kan spela en viktig roll i tumörbildning och metastas.

Material och metoder

Cellodling

humana magen cancercellinjer (AZ-521, MKN45, KATOIII och NUGC-3), human lung cancercellinjer (SBC-3, Lu-65, Lu-135, och KNS-62), och humana pankreascancerceller ( Suit-2) köptes från japansk samling forsknings bioresurser. Human mage cancerceller (SNU-1), humana lungcancercellinjer (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, och HCC827), humana mesoteliom celler (MSTO-H211), humana kolorektala cancercellinjer (SW480, SW620, Colo205, LoVo, och HCT116, mänskliga pankreascancercellinjer (BxPC-3, ASPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 och Capan-2), human prostatacancercellinjer (PC-3, SU145, och LNCaP), och humana bröstcancercellinjer (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, och MDA-MB-231) köptes från American Type Culture Collection. MKN28 (human mage cancerceller) och PSN-1 (humana pankreascancerceller) köptes från Immuno-Biological Laboratories och Europeiska Insamling av cellodling, respektive . mänskliga magen cancercellinjer, AZ-P7a [32], [33] och MKN45P [42] var gåva från doktorerna. Yutaka Yonemura och Yoshio Endo. I AZ-521 och AZ-P7a celler har inga RT-PCR-produkter observer för 14 retrovirus inklusive HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, och ADV typ 1 (data ej visade), med undantag av infektion av dessa retrovirus i båda cellinjerna . Celler bibehölls i RPMI-1640-medium (Sigma-Aldrich) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin och 0,1 mg /ml streptomycin.

Produktion och isolering av exosomes

Vidhäftande celler såddes till 150 mm-rätter på lämpligt antal celler som sträcker sig från 3 x 10 ^{6-1 x 10 7 celler per fat, medan flytande celler ympades in i 75 cm 2-kolv vid 2~2.5 × 10 7 celler per flaska. Celler odlades i fullständigt RPMI-1640 medium med 25 ml och 50 ml för rätter och kolvar, respektive, under 24 h vid 37 ° C och 5% CO _{2, tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och inkuberades 48 h i fenolrött-fritt RPMI-1640-medium (Sigma-Aldrich) innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, som tidigare var uttömda förorenande mikrovesiklar av över natten centrifugering vid 100000 x g. Exosomer isolerades från de totala cellerna som sträcker sig från 6 x 10 7-3 x 10 8 celler såsom tidigare beskrivits [29]. I korthet sattes odlingsmediet uppsamlades och centrifugerades vid 800 x g under 5 min och ytterligare 2000 x g under 10 minuter för avlägsnande lyfts celler. Supernatanten utsattes för filtrering på en 0,1}}

• PLoS ONE: En Gene Expression Undertecknande av förvärvade Chemoresistance till cisplatin och Fluorouracil Kombination kemoterapi i Gastric Cancer Patients
• PLOS ONE: Hypoxi-inducerbara faktor 1α Bestämmer Gastric Cancer Chemosensitivity via Modulering av p53 och NF-κB