Plos ONE: Piruvat kinaze M2 igra dvojno vlogo v uredbi o ESPG /EGFR signaliziranje preko E-kadherina-odvisen način želodčnega raka Cells

Povzetek

Ozadje in cilji

aktivacijo EGFR in PKM2 izraz so ključnega pomena pri tumorigeneze. Aktivacija EGFR ureja PKM2 funkcije subcelično način predelku odvisni in spodbuja gensko transkripcijo in rast tumorjev. Poleg tega je PKM2 povečana pri poteh za EGFR povzroča v gliomom malignih bolezni. Vendar pa smo ugotovili, da lahko PKM2 urediti tudi aktivnost /EGFR signalne poti ESPG v želodcu rakavih celic. Naš namen je določiti biološke mehanizme za PKM2 pri urejanju gibljivost celic in invazijo.

Metode

Uporabili smo stabilno transfekciji s kratko Ostra RNA za stabilno utišati izražanje PKM2 v BGC823, SGC7901 in AGS želodca rakave celične linije. Učinki PKM2 in vitro so bili določeni z oceno migracijo celic in invazijo. Imunohistokemijsko analiza je bila uporabljena za raziskovanje odnosa med PKM2 in drugih proteinov.

Rezultati

Naši rezultati kažejo, da je rasklapanje od PKM2 zmanjšala aktivnost E-kadherina in izboljšal /EGFR signalno pot ESPG v želodčnih celičnih linijah BGC823 in SGC7901, ki so bili pozitivni na E-kadherina izražanja. Vendar pa v nediferenciran karcinom želodca celične linije AGS, ki nima E-kadherina ekspresije PKM2 spodbujali migracijo celic in invazijo. Imunohistokemične Analize so pokazale, da so bile stopnje E-kadherina izražanja, ERK1 /2 fosforilacije in citoplazemske PKM2 izražanja v korelaciji s seboj

Zaključek:.

PKM2 lahko igrajo različne vloge v različno diferenciranih želodca vrste raka celic, in to ugotovitev bi bila skladna s prejšnjo kliničnih raziskav. Rezultati naše raziskave kažejo, pomembno povezavo med PKM2 in E-kadherina med-EGFR spodbudila želodčni rak celic gibljivost in invazije

Navedba. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen il, Tan L, Liu JJ et al. (2013) Piruvat kinaze M2 igra dvojno vlogo v uredbi o ESPG /EGFR signaliziranje preko E-kadherina-odvisen način v želodcu rakavih celic. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542

Urednik: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonska

Prejeto: 7. februar 2013; Sprejeto: 20. maj 2013; Objavljeno: 28 junij 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z National Natural Science Foundation Kitajske (št 30971362, 81072013 & 91229201), temeljnih raziskovalnih skladov za srednjeevropskih univerz na Kitajskem (št 2010111082) in Ministrstvo za zdravje fundacije za državno Key Kliničnem oddelku. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

piruvat kinaza (PK) posreduje končno omejuje hitrost korak glikolize s katalizo defosforilacije za fosfoenolpiruvat (PEP) za piruvat, da dobimo eno molekulo ATP. Sesalske celice imajo štiri piruvat kinaze izoencimov (M1, M2, L in R), ki so selektivno izrazili v različnih vrstah celic in tkiv [1]. Pri sesalcih, je izooblika M1 (PKM1), izražena v večini odraslih tkivih. M2 izoforma (PKM2), alternativno spojeno varianta M1, ki je izražena v času razvoja zarodka [2]. Študije so pokazale, da rakave celice izključno izražajo PKM2 [3], [4]. PKM2 se je izkazalo, da je bistvenega pomena za aerobne glikolize v tumorjih (Warburg učinek). V preteklih letih so bile pomembne napredek na področju razumevanja delovanja in regulacije PKM2 kot piruvat kinaze in proteinske kinaze v rakave celice [5]. Nedavna študija je potrdila, da je PKM2 jo epidermalni rastni faktor inducirane (ESPG) premikanjem v jedru glioblastom celic, komunicira z beta-catenin in vodi do cyclinD1 izražanja, ki pospešuje celično proliferacijo in tumorigeneze [6]. Te ugotovitve kažejo na novo vlogo PKM2 kot transkripcijski coactivator. Vendar pa obstaja nekaj polemike glede specifičnosti in možnosti PKM2 kot cilj proti raku pri zdravljenju raka. Nedavna ugotovitev je pokazala, da je PKM2 izraz močno povezana z želodčno diferenciacijo raka. Diferencirane vrste raka iztisne več PKM2 beljakovin kot narediti nediferencirani narave. PKM2 je neugoden prognostični dejavnik pri raku Pečatnjak celic želodca [7]. Treba je biološka vloga PKM2 v različnih fazah diferenciacije in pri razvoju raka želodca je treba dodatno pojasniti.

Predhodne študije o PKM2 so se osredotočili na presnovo tumorja in rast tumorjev. Bilo je le nekaj poročil o tumorja metastaz. E-kadherina igra ključno vlogo pri ohranjanju epitelne integriteto in izguba E-kadherina vpliva na lepilno repertoar celice [8]. Predhodne študije [9] vitro kažejo, da je izguba E-kadherina V karcinom humanih celičnih linijah, povezano s slabo diferenciacijo in fibroblastoid morfologijo. Aktiviranje ESPG odvisni od EGFR so poročali, da se inhibira v E-kadherina oprijema odvisni način, ki inhibira ligand odvisne aktivacije različnih receptorjev tirozin kinaz [10]. Naša raziskava je pokazala, da je rasklapanje od PKM2 zmanjšala aktivnost E-kadherina in izboljšal /EGFR signalno pot ESPG v celičnih linijah BGC823 je in SGC7901, ki so bili pozitivni na E-kadherina izražanja. Vendar pa v nediferenciran karcinom želodca celične linije AGS, ki nima E-kadherina ekspresije PKM2 spodbujali migracijo celic in invazijo. Cilj te raziskave je bil osvetliti delovanje in mehanizem PKM2 glede na celično gibljivost v različno diferenciranih celičnih linijah.

Materiali in metode

Cell Culture, pogoji in Transfekcija

želodčni rak humane celične linije BGC823 (slabo diferencirano glede na ponudnika) in SGC7901 (zmerno diferencirano) smo kultivirali v RPMI 1640 medija (Hyclone, Logan, UT, ZDA). Celična linija AGS (nediferencirani) smo kultivirali v F12K mediju. Vse celice smo gojili v mediju, ki vsebuje 10% fetalnega govejega seruma (FBS) (Gibco, Detroit, MI, ZDA) in 100 IU /ml penicilin-streptomicina pri 37 ° C v 5% CO _{2 navlaženi atmosferi. Človeško želodčni rak celične linije AGS je bil odrejen iz American Type Culture Collection (ATCC, ZDA), in želodčni rak humanih celičnih linijah SGC7901 in BGC823 so bili pridobljeni iz Kitajske Centra za Type Culture Collection (Shanghai, Kitajska). SGC7901, BGC823 in AGS celice smo transfektirali z siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) ali PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plazmida z uporabo FuGENE HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromicina (0,1 ug /ml) smo uporabili za selekcioniranje za stabilno transficirane klonov. Izražanje PKM2 proteina so ugotavljali blot analizo Western z uporabo protitelesa proti PKM2 za potrditev zmožnosti konstruktov, da inhibira ekspresijo ciljnega gena; Te poskuse smo ponovili trikrat. Celične kulture bile narejene mirovnim da jih raste do konfluentnosti in medij je bil nadomeščen s svežo medij, ki vsebuje 0,5% seruma 1 dan. ESPG s 100 ng /ml končne koncentracije uporabimo za stimulacijo celic. ESPG je bil pridobljen iz signalizacijo med celicami tehnologijo.}

Stabilno rasklapanje za PKM2 in Over-izražanja PKM2

A plazmid vsebuje zaporedje interference RNA, ki usmerjeno na PKM2 gena v BGC823 je SGC7901 in AGS celice zgrajeno. Smisel oligo za sekvenco siPKM2 je 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', in protismiselno oligo je 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, SGC-7901 in AGS celice smo transfektirali z pcPUR + U6-siPKM2 ali pcPUR + U6-siRenilla (kontrola) in izbrali puromicin odporen na klonov. Western blot analiza je bila opravljena za potrditev zatiranje PKM2. Plazmid, ki vsebuje PKM2 cDNA sekvenco smo dobili iz Invitrogen. BGC-823, so SGC-7901 in AGS celice transfekciji s pcDNA6.0-PKM2 ali pcDNA6.0-mock (kontrola) in izbrali blasticidin odpornih klonov. Western blot analiza je bila opravljena za potrditev izraz PKM2.

Protein Pridobivanje in Western Blot Analiza

Celice smo ponovno suspendirali v lize pufru, ki vsebuje koktajl zaviralcem proteaze, in pridobljeni proteine ​​ločimo s pomočjo 8-10% SDS-PAGE gelov. beta-tubulin smo uporabili kot kontrolo obremenitve. Protitelesa proti E-kadherina in p-E-kadherina so bili pridobljeni iz Epitomics. Fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-PLCγ1 (Tyr783), fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfo-c-CBL (Tyr700) in fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) protitelesa so bili pridobljeni iz signalizacijo med celicami tehnologijo.

RNA ekstrakcija, Reverse Transcription in Real-time PCR

Total RNA je bila vzeta z TRIzola reagenta (Invitrogen, CA, ZDA). Vzorci so bili nato obdelamo z DNaze 15 minut pri sobni temperaturi in RNA smo nadalje očistili z uporabo RNA čistilno kit (Qiagen, CA, ZDA). Obratno prepisovanje (RT) reakcijo v prvi sklop sintezo cDNA smo izvedli z reverzno transkriptazo (Bio-Rad) z 2 ug celotne RNA. Kvantitativna analiza RT-PCR smo izvedli z ABI 7500 (Applied Biosystems), in ravni genov izraz za vsak posamezen vzorec smo normalizirali na GAPDH. Srednja relativna izražanje genov smo določili in razlike so bile izračunane z uporabo 2 ^{-ΔΔCt način agaroznem gelu. RT-PCR primerji sekvence so bile: smisla 5'TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'in 5'- nezaznavnih GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' na N-kadherina; Občutek 5'- CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'in protismiselno 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3 "za E-kadherina; Občutek 5'- TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'in protismiselno 5'GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3 "za MMP7; Občutek 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'in protismiselno 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3 "za GAPDH.}

Cell Proliferation Vsebnost

Celica proliferacijo smo merili z uporabo mobilnega štetje Komplet 8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Kumamoto, Japonska), v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko smo celice zasejali v štirih 96 vdolbinami z gostoto 2 x 10 ^{3 celic /jamico. Ena plošča je bila sprejeta ob istem času vsak dan po tem, ko se celice upoštevali vdolbinic. Absorbanco smo merili s mikroploščnem čitalniku pri valovni dolžini 450 nm. Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih.}

Transwell Invasion in celjenje ran Testi

transwell invasion teste smo izvedli z 8,0-um-por vložki v 24-dobro transwell ploščo. V kleti je membrana je hidrirani s 500 p.L seruma RPMI 1640 ali F12K srednje 30 minut pred uporabo. Za invazijo testu, so želodčni rak celičnih linij dodali zgornjo komoro transwell z 0,5 mg /ml tip kolagen l (BD Bioscience, San Jose, CA) obložena filtrov. RPMI 1640 ali F12K medij z 10% fetalnega govejega seruma in 1% vsakega antibiotik dodamo na spodnji komori. BGC in 7901 celice smo inkubirali 36 ur. Je AGS Celice inkubiramo 24 ur. Vdrla celice so bile količinsko po encijana vijolično obarvanje. Vsak poskus smo izvedli v trojniku in podatki so bili izraženi kot povprečne vrednosti. Analizni-celjenje ran smo izvedli v 6 vdolbinami. Tumorske celice v mediju, ki vsebuje 10% FBS zasejemo v 6 vdolbinami (Corningovimi, CA). Celične kulture bile narejene mirovnim da jih raste do konfluentnosti in medij je bil nadomeščen s svežo medij, ki vsebuje 0,5% seruma 1 dan. Rane na enoplastni so bile narejene s sterilnimi nasveti pipete. Potem smo ESPG s 100 ng /ml končne koncentracije uporabljen za stimulacijo celic. Celice smo nato sprali s PBS in osveži z medijem, ki vsebuje 10% FBS. Fotografije so bile posnete pri 0 in 24 h. Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih

Etika Izjava

Ta študija je odobril Odbor za etiko (št: 20081012). V bolnišnici Zhongshan povezan z Xiamen University, Xiamen, Fujian Province, Kitajska, in smo pridobili pisne izjave soglasje vseh udeležencev, ki sodelujejo v tej študiji.

Priprava tkiva Vzorci

Tumor vzorci tkiva, so bili zbrani iz 15 različnih bolnikov z rakom na želodcu, ki so doživeli kurativno resekcijo v bolnišnici Zhongshan, Xiamen University, Xiamen, Kitajska. Neodvisna serija ustreza sosednja noncancerous tkiva od 15 istih bolnikov zberemo ob istem času. Vsi osebki tkiva zberemo in razdelimo na dva dela takoj po tumorja. En del zberemo v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C, dokler RNK in proteinsko ekstrakcijo. Drugi del je bil določen v 4% formaldehidu in vgrajeni v parafin za histološko analizo (Hematoxylin eozin in IHC barvanja). Vsi osebki so potrdili patološko diagnozo (histopatološke diagnoze temelji na merilih WHO). Vsi eksperimentalni primeri so bili združeni v Mednarodne zveze proti raku tumor-Node-metastaze (TNM) sistema počivališču (revidiran leta 2002)-ing accord.

Imunohistokemija

Štiri-mikronsko-debele parafinske oddelke so bili bodisi obarvali s hematoksilinom in eozinom (H &E) ali analiziramo za PKM2, p-ERK1 /2 in E-kadherina izražanja ga imunohistokemijo. Imunohistokemija je bila izvedena v skladu s postopki, ki jih priporoča proizvajalec. Reakcije smo prikazali uporabo diaminobenzidine kot kromogenega substrata. Oddelki so jih nasprotno uporabo Hematoxylin in nato očisti in nameščena. Srednja gostota (IOD /območje) je bila odkrita v različnih pozitivnih območjih 15 človeških želodca vzorcih raka uporabljajo Image-Pro Plus opreme.

bile statistične analize

Statistične analize izvajajo z uporabo SPSS V13. 0 (SPSS, Inc.) programske opreme. Neodvisna-Vzorce T testiranja in analize korelacije smo uporabili za primerjavo podatkov. Vse vrednosti so izražene kot sredstvo ± SD. Razlike so bile upoštevane statistično značilne na P
. ≪ 0,05

Rezultati

Izčrpavanje PKM2 predstavljenih Cell migracije in invazije v BGC823 in SGC7901 celice z ESPG stimulacijski

izraz PKM2 beljakovin v želodcu raka celičnih linij BGC823 je SGC7901 in AGS ovrednotili z Western analizo blot. Te celične linije so pokazali visoko stopnjo PKM2 izražanja. Nato so bile določene stabilne želodca linije rakava celica s spremenjenim PKM2 izražanja s pomočjo interference RNA (PKM2 rasklapanje) v celicah BGC823, SGC7901 in AGS. Kot je prikazano na sliki. 1A, so bile določene na celičnih linij BGC823, SGC7901 in AGS z PKM2 razgradljiv. Opazili smo, da je širjenje zmanjšal v celicah BGC823 in AGS ko je PKM2 osiromašeni (sl. 1B). Ti rezultati so v skladu s predhodnimi študijami.

Da bi preučili vpliv PKM2 na celični migraciji in invazije, ki delajo, smo dobro uveljavljeno ran-zdravilne in transwell testi, da so značilni za odziv celic motiliteto v BGC823 in SGC7901 celic . Sotočje plast celic smo najprej inkubirali preko noči v mediju, je bila uvedena praske rana, medij, ki vsebuje najbolj primeren odmerek sklada (100 ng /ml) dodamo za spodbujanje migracije in po 24 urah (opazili odstotek rane tesnjenje Slika S1). Vdrla Celice smo količinsko 36 ur po tem, ko je bil ESPG (100 ng /ml) dodamo k spodnji komori. Rezultati kažejo, da je zdravljenje BGC823-sipk in SGC7901-sipk celic z ESPG po praskam rane in v transwell znatno povečala stopnjo celjenje ran (sl. 1 C, D) in napad (sl. 1 E, F) v primerjavi s kontrolno celic.

Izčrpavanje PKM2 Zmanjšana E-kadherina Expression in Enhanced dejavnosti ESPG /EGFR nadaljnjega signalnih poti PLC-γ1 in ERK1 /2

za preiskuje mehanizem sprememb v celični migraciji in invazije po rasklapanje za PKM2 smo analizirali izražanje članov Ca ^{2 + -dependent celične adhezije molekule družino in metaloproteinaze. Ugotovili smo, da so stopnje izraženosti E-kadherina proteinske zmanjšal BGC823 in SGC7901 celic, ko je PKM2 izraz zmanjša (sl. 2A).}

Stopnja E-kadherina mRNA in fosforilacija E-kadherina so bili določeni v BGC823 in SGC7901 celice z izčrpavanja PKM2, da oceni, ali je opaziti razliko v E-kadherina izražanja prišlo pred ali post-translacijsko. Ugotovili smo navzdol ureditev E-kadherina mRNA in povečano fosforilacijo, kar povzroči endocitozo med E-kadherina V-PKM2 osiromašenega celic (sl. 2A, B). Prav Ugotovili smo, da je nivo izražanja N-kadherina proteina v celičnih linijah BGC823 in SGC7901 povečala, ko je bila porabljena PKM2 (sl. 2A).

Cell migracije in invazije večinoma ureja EGFR aktivnostjo. Analizirati, ali je EGFR sodeluje pri migraciji in invazije BGC823 in SGC7901 celice so te celice zdravijo z ESPG, ki se veže na EGFR in aktivira signalne poti na nižji stopnji. Zdravljenje ESPG posledico fosforilacijo EGFR in naknadno aktivacijo PLCγ1, AKT in ERK1 /2 poti (sl. 2C). Ugotovili smo, da γ1 imeli PLC višjo raven aktivnosti v-PKM2 osiromašeni celicah kot v un osiromašeni celic po bodisi kratkoročno ali dolgoročno (24 h) inkubaciji z ESPG. Vendar pa ni bilo opazno razliko v AKT aktivnosti med-PKM2 osiromašeni celic in un-osiromašenega celic. PLCγ je ključni regulator celični migraciji dolvodno od RTK signalizacijo [11]. Fosforilacija na tirozin ostanka 783 od PLCγ1 je bistvenega pomena za njegovo aktivacijo [12]. Aktivacija PLCγ1 izboljšano celično gibljivost, in ta učinek opazili pri rana praske in transwell testih, kot je navedeno na sliki. 1C.

dostavo raziskali vpliv na EGFR liganda za izražanje MMP uporabo RT-PCR v BGC823-sipk in SGC7901-sipk celic v primerjavi s svojimi kontrolnimi celicami. Zdravljenje z EGFR ligandom, EGF, izboljšano ekspresijo MMP na nivoju transkripcije v BGC823 in SGC7901 celic. Vendar pa ni bilo očitne razlike v stopnji izraženosti MMP2 in MMP9 med-PKM2 osiromašenega celic in njihovih kontrolnih celicah (podatki niso prikazani). MMP7 izraz je bil reguliran in-PKM2 osiromašeni celic z zdravljenjem ESPG (sl. 2D). poti so ERK /MAPK igrajo ključne vloge v EGFR-liganda povzroča MMP7 izražanja. Poleg tega je opaziti očitno povečanje ERK1 /2 aktivnosti, ko 0 h in 24 h zdravljenja z ESPG, PKM2 osiromašeni celic.

Izčrpavanje PKM2 oslabljenega gibljivost AGS celic in funkcionalni Spremembe po reševanje PKM2 v želodca rakave celične linije

izraz E-kadherina beljakovin v želodcu raka celičnih linij BGC823, SGC7901 in AGS je bila ocenjena z Western blot analizo. V celične linije BGC823 in SGC7901 izraziti E-kadherina. V nasprotju s tem, AGS celice nimajo E-kadherina izraz (sl. 3A).

Da bi preučili vpliv PKM2 rasklapanje na celični migraciji in invazije v AGS celicah, ki delajo, smo dobro uveljavljeno ran-zdravljenje in transwell testi za značilni za celično gibljivost. Sotočje plast celic smo najprej inkubirali preko noči v mediju, je bila uvedena rana praske, dodamo medij, ki vsebuje ESPG (100 ng /ml) za spodbujanje migracije in po 24 urah opazili odstotek ran tesnjenje. Vdrla celice v transwell testu smo kvantificirali 24 ur po tem, ko je bil ESPG (100 ng /ml) dodamo k spodnji komori. Na naše presenečenje smo ugotovili, da je obravnavanje AGS-sipk celic z ESPG po nič rane in v transwell občutno zmanjšala hitrost rane tesnjenje in invazijo v primerjavi s kontrolno celic (sl. 3B, C). Bilo je vidno razlike med BGC823 /SGC7901 in AGS celic.

Za dodatno ponazoritev vloge PKM2 v celico gibljivost, smo storil PKM2 reševanje poskusov. taked smo stabilno transfektirali metodo, s pomočjo prekomerno ekspresijo plazmida vektor pcDNA6.0-mock in pcDNA6.0-PKM2 ukvarjati z BGC823 in AGS celic, ki stabilna rasklapanje PKM2. Izraz p-EGFR, E-kadherina bilo prikazano v PKM2 reševanje poskusov (sl. 3D). Opazili smo, da, ko je izraz PKM2 izterjati, je fosforilacijo EGFR bistveno zmanjša BGC823 celicah in se je v AGS celicah. Poleg tega je bila celica gibljivost BGC823 celic zmanjšala in AGS celice upadla po PKM2 reševanje (sl. 3E). Da bi pojasnili mehanizem teh razlik, smo nato analizirali aktivnost /EGFR signalnih poti ESPG.

PKM2 Enhanced dejavnosti ESPG /EGFR nadaljnjega signalnih poti v AGS celic in je bila povezana s ERK aktivnosti v želodcu rak osebki

za analizo, ali je EGFR lahko sodelujejo v migracije in invazije AGS celic, so te celice zdravijo z ESPG, ki se veže na EGFR in aktivira signalne poti na nižji stopnji. Zdravljenje ESPG posledico fosforilacijo EGFR in naknadno aktivacijo EGFR poti nadaljnjih, vključno PLCγ1 in ERK1 /2 poti (sl. 4A). Ugotovili smo, da so aktivnosti PLCγ1 in ERK1 /2 večja v celicah, kjer PKM2 niso izčrpane kot v-PKM2 osiromašenega celic po bodisi krajše ali daljše (24 h) inkubaciji z ESPG. Ta rezultat je nasprotje tega, kar so opazili pri BGC823 in SGC7901 celic; V AGS celicah, PKM2 prišel v poštev kot spodbuda in spodbujati migracije celic in invazijo. Bomo naslednjič raziskovali MMP7 izraz pomočjo RT-PCR v AGS-sipk celic in kontrolnih celic. Zdravljenje z ESPG izboljšano MMP7 izražanja na nivoju transkripcije v AGS-pu6 celic, ne pa v AGS-sipk celic (sl. 4B). Dejavnost ERK1 /2 je očitno večji v AGS-pu6 celic v primerjavi z AGS-sipk celic po 0 h in 24 h zdravljenja z ESPG (sl. 4A).

Naslednja izvedli imunohistokemični (IHK) analize preuči E-kadherina izraz, PKM2 lokalizacije in ERK1 /2 fosforilacijo v serijskih oddelkih 15 človeških želodca vzorcih raka z uporabo protiteles s potrjenimi posebnosti. Slika 4C prikazuje, da so bili nivoji E-kadherina izražanja ERK1 /2 fosforilacije in citoplazemska PKM2 izražanja povezana drug z drugim. Poleg tega smo opazili visoke stopnje ERK1 /2 fosforilacijo v jedru rakavih celic brez E-kadherina izražanja. Na območjih ERK1 /2 fosforilacije, smo ugotovili tudi višjo raven PKM2 izražanja. Vendar pa nismo našli fosforilacijo ERK1 /2 področjih pozitivnim E-kadherina izražanja (sl. 4C). Analiza korelacije med PKM2, E-kadherina in P-ERK1 /2 je bila izvedena s pomočjo Image-Pro Plus programske opreme (sl. 4D). Srednja gostota (IOD /območje) je bil posnet na različnih pozitivnih območjih 15 človeških želodca vzorcih raka. Našli smo pomembno povezanost med PKM2 in E-kadherina v E-kadherina pozitivnih območjih. Poleg tega je pomembna korelacija med PKM2 in p-ERK1 /2, E-kadherina negativnih območjih.

Pogovor

invazivne in metastatskega stopnja napredovanja raka povezana s slabo klinično prognozo in predstavlja najbolj mogočna ovira za uspešno zdravljenje. Cell gibljivost in invazivnost so opredeljujejo značilnosti malignih tumorjev, ki omogočajo tumorske celice, da se selijo v sosednje tkivo ali z omejevanjem klet membran in zunajcelične matrike. Celične gibljivosti je pri fizioloških procesov popravila ran in organogenezo in patološkem postopku tumorske invazije [13] potrebno. Invazivne tumorske celice označen s dysregulated celične gibljivosti v odgovor na ekstracelularne signale iz rastnih faktorjev in citokini. Človeški tumorji izražajo visoko raven rastnih faktorjev in njihovih receptorjev, in več vrst malignih celic, se zdi, da kažejo autocrine- ali parakrin spodbujati rast. Med najbolj raziskanih sistemov faktor receptorjev rasti je družina EGF receptor [14]. Signali iz ekstracelularnem miljeju narekujejo celično motiliteto. Številni dejavniki rasti, vključno z ligandi, ki delujejo preko epidermalni rastni faktor receptor (EGFR), okrepi celično gibljivost [15]. Vsaj dve različni znotrajcelične signalne poti so potrebni za EGFR posredovano celično gibljivost: na poti, ki uporabljajo PLC y in MAP kinaze. PLC γ aktivnost je bila predlagana za izboljšanje celic gibljivost z mobilizacijo-aktinskih spreminjanje beljakovin iz neaktivnega membrano povezana lokalizacije na aktivni sub-membrane citoskeletnim locale [16]. V ERK MAP kinaze prenašajo signale jedra kakor tudi signale, ki uravnavajo celične matrične povezave.

Cadherins obsegajo veliko družino oprijema celica-celica molekul, ki vključujejo klasične, desmosomal in atipičnih cadherins. E-kadherina, ki se odraža predvsem v epitelijskih celic, je adhezija proteina, ki je kodiran z genom in funkcij CDH1 v različnih postopkih, vključno z razvojem, celovitost tkiv, celični migraciji, morfologija in polarnosti [17], [18] [19]. E-kadherina je tudi zaviralnih katerega izraz je pogosto zmanjša ali utišani, in njegovo ponovno izraz lahko povzroči morfološke povratna [20], [21]. Aktiviranje ESPG odvisni od EGFR so poročali, da se inhibira v E-kadherina oprijema odvisni način, ki inhibira ligand odvisne aktivacije različnih receptorja tirozin kinaz. N-kadherina, kot promotorja invazijo, ki se pogosto molekul. Izraz N-kadherina v epitelijskih celicah povzroči spremembe v morfologiji v fibroblastic fenotipa, zaradi česar celice bolj gibljivega in invazivne. Nedavne raziskave kažejo, da imajo rakave celice navzgor regulirano N-kadherina poleg izgube E-kadherina. Ta sprememba v kadherina izražanja se imenuje "kadherina stikalo".

opazili smo navzdol ureditev E-kadherina mRNA in povečano fosforilacije, kar povzroči endocitozo med E-kadherina, in-PKM2 osiromašeni celic. Prav Ugotovili smo, da je N-kadherina raven proteina izražanje v celični liniji BGC823 povečala, ko je bila porabljena PKM2. Rasklapanje za PKM2 spodbujati migracije celic in invazijo v BGC823 in SGC7901 celice s stimulacijo ESPG. Povečana aktivnost EGFR je ključni dejavnik pri določanju gibljivost celic in invazivnosti BGC823 in SGC7901 celic. Domnevali smo, da navzdol ureditev E-kadherina izražanja izboljšano fosforilacijo EGFR in aktiviranih signalnih poti v smeri toka, ki vključujejo PLCγ1 in ERK1 /2. PLC aktiviranje γ pospešuje celično gibljivost in ERK1 /2 aktivnost pa ima ključno vlogo pri MMP7 izražanja.

Matrix metaloproteinaz (MMP), so bili vpleteni v invaziji raka in metastaz zaradi svoje ekstracelularnega matriksa (ECM) -proteolytic dejavnost [22]. MMP-7 so poročali, da se proizvaja želodčnih celic karcinoma in je bistveno povezana z agresivnimi patoloških fenotipov raka želodca [23]. MMP-7 lahko aktivirate pro-MMP-1, ima močne stromelizin podobno dejavnost in degradira netopnega elastina, kolagena tipa IV, laminin-1, fibronektin, proteoglikan in želatine [24]. poti so ERK /MAPK igrajo ključne vloge v-ESPG povzroča MMP7 izražanja [25].

E-kadherina je celično adhezijo glikoprotein značilna za prvič v humanih celičnih linijah, ki jih Shimoyama et al [26]. Njegova vloga pri razvoju raka želodca, je bila prvič opredeljena guilfordskega et al [27]. Obstaja pomembna povezava med stopnjo E-kadherina izražanja in stopnjo diferenciacije tumorja, kot tudi histološki tip skladu z Lauren in razvrstitev WHO. Bolniki z E-kadherina pozitivni tumorji imajo bistveno boljše stopnje preživetja 3- in 5-letno kot bolniki s E-kadherina negativnimi tumorji [28]. Dedni difuzna rak želodca (HDGC) je redka avtosomno dominantna sindrom, ki je v veliki meri pripisati reproduktivnih mutiranje v CDH1 gena, povezanega z zgodnjo nastopom, histološko difuzna, pečat-ring tip celic raka želodca [29], [30].

Lim JY et al so poročali, da je bil PKM2 izraz močno povezana z želodčno diferenciacijo raka. Diferencirane vrste raka iztisne več PKM2 beljakovin kot v nediferenciranih vrste; V nasprotju s tem pa je večja PKM2 izraz povezana s krajšim splošnim niso odvisni preživetja fazi raka pečat obroči celic. PKM2 izraz je lahko neugoden prognostični dejavnik za mobilne karcinomov pečat obroči, ki jim primanjkuje E-kadherina [7]. Ti rezultati so v skladu z našim raziskav v želodcu rakavih celic. BGC-823, SGC-7901 in celične linije AGS so različno diferencirane vrste. E-kadherina izraz obstaja v SGC-7901 in BGC-823 celične linije; V nasprotju s tem so AGS celice pridobljene iz malignega želodca adenokarcinomom tkiva in nimajo E-kadherina-posredovano celično adhezijo [31]. Opazili smo, da je rasklapanje od PKM2 spodbujati migracije in vdor SGC-7901 in BGC-823 celičnih linij, ampak zatreti te lastnosti v celične linije AGS. Druga skupina je poročala, da je piruvat tip kinaza M2 povečana pri raku debelega črevesa in rasklapanje za PKM2 zatrl širjenje in prenos raka debelega črevesa RKO celic [32]. Vemo, da RKO celice nimajo izraz E-kadherina [33]. Imunohistokemični analizi (IHK) kaže, da so bile stopnje E-kadherina izražanja ERK1 /2 fosforilacije in citoplazemska PKM2 izražanja povezana drug z drugim. Ugotovili smo visoko stopnjo ERK1 /2 fosforilacijo v jedru rakavih celic brez E-kadherina izražanja, vendar z visoko stopnjo PKM2 izražanja.

smo hipotezo, da PKM2 oslabi celično gibljivost in napad, ko je E-kadherina prisotna. Ta nova funkcija PKM2 lahko igrajo vlogo pri reverzibilno inhibicijo celične gibljivosti in invazije v zgodnjih fazah raka želodca, ko so celice pozitivne na E-kadherina izražanja. Med napredovanja tumorja, pomanjkanje ali zelo nizko izražanje E-kadherina povzroči agresivno funkcijo PKM2 v tumor. Biološka vloga PKM2 pri razvoju teh tumorjev je treba dodatno pojasniti.

Podpora Informacije
sliki S1.
izraz EGFR beljakovin v želodcu raka celičnih linij BGC823, SGC7901 in AGS je bil ovrednoten z Western analizo blot. AGS celice so pokazali višjo stopnjo EGFR izražanja od ostalih dveh celičnih linij. Ni bistvene razlike med BGC823 in SGC7901 celic (Slika S1A). BGC-pu6 celice in BGC-sipk celice so zdravili z različnimi odmerki ESPG. Po 40 minutah smo zaznali stopnjo fosforilacije za EGFR. Našli smo najvišjo stopnjo fosforilacije v odmerku 100 ng /ml (slika S1B). Zato smo se odločili, da odmerek 100 ng /ml kot najbolj primernega kandidata. Transwell eksperiment je pokazala tudi večjo sposobnost, da prodre v martrigel v BGC823 celic (Slika S1C)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF)

• Plos ONE: Genetske variante v epidermisu Growth Factor Receptor poti, Geni in tveganje za požiralnika ploščatoceličnega karcinoma in želodca raka v kitajski Prebivalstvo
• Plos ONE: majhna molekula R1498 kot dobro prenaša in oralno aktiven kinaze za karcinomom jetrnih celic in želodca zdravljenje raka s pomočjo ciljanja angiogenezo in mitoza Poti