PLoS ONE: Pyruvaat Kinase M2 speelt een dubbele rol op de verordening van de EGF /EGFR Signalering via E-cadherine-afhankelijke manier bij maagkanker Cells

De abstracte

Achtergrond en Doelstellingen

EGFR activering en PKM2 expressie zijn rol in het ontstaan ​​van tumoren. EGFR activering reguleert PKM2 functies in een subcellulair compartiment afhankelijke wijze en bevordert gentranscriptie en tumorgroei. Bovendien wordt PKM2 opgereguleerd in EGFR-geïnduceerde routes in glioma maligniteiten. Echter, we vonden dat PKM2 ook de activiteit van de EGF /EGFR signaleringsroute bij maagkanker cellen kunnen regelen. Ons doel was om de biologische mechanismen voor het PKM2 bij het reguleren van de cel beweeglijkheid en invasie te definiëren.

Methods

We gebruikten stabiele transfectie met korte hairpin RNA stabiel geluid van de expressie van PKM2 in de BGC823, SGC7901 en AGS maagkanker cellijnen. De effecten van PKM2 in vitro werd bepaald door het bepalen van celmigratie en invasie. Immunohistochemische analyse werd gebruikt om de relatie tussen PKM2 en andere eiwitten te ontdekken.

Resultaten

De resultaten geven aan dat de knockdown van PKM2 verlaagde de activiteit van E-cadherine en versterkte de EGF /EGFR signaling pathway in de maag cellijnen BGC823 en SGC7901 dat positief voor E-cadherine waren. In de ongedifferentieerde gastrische carcinoma cellijn AGS, waarbij E-cadherine mist, PKM2 bevorderd celmigratie en invasie. Immunohistochemische analyse toonde dat de niveaus van E-cadherine, ERK1 /2 fosforylering en cytoplasmatische PKM2 expressie werden gecorreleerd met elkaar overig

Conclusie:.

PKM2 kunnen verschillende rollen spelen in verschillend gedifferentieerde maag typen kankercellen, en deze bevinding zou in overeenstemming met de klinische onderzoek. De resultaten van onze studie blijkt een belangrijke schakel tussen PKM2 en E-cadherine tijdens de EGFR gestimuleerde maagkanker cel beweeglijkheid en invasie

Visum:. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) pyruvaat kinase M2 speelt een dubbele rol op de verordening van de EGF /EGFR Signalering via E-cadherine-afhankelijke manier bij maagkanker Cells. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10.1371 /journal.pone.0067542

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Ontvangen: 7 februari 2013; Geaccepteerd: 20 mei 2013; Gepubliceerd: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 30971362, 81072013 & 91.229.201), Fundamenteel Onderzoek der fondsen voor de centrale universiteiten in China (nr 2010111082) en het ministerie van Volksgezondheid Stichting State Key klinische afdeling. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

pyruvaat kinase (PK) bemiddelt de finale snelheidsbeperkende stap van de glycolyse door het katalyseren van de defosforylering van fosfoenolpyruvaat (PEP) aan pyruvaat om één molecuul ATP opleveren. Zoogdiercellen vier pyruvaat kinase iso- enzymen (M1, M2, L en R), die selectief worden uitgedrukt in verschillende soorten cellen en weefsels [1]. Bij zoogdieren wordt het M1 isovorm (PKM1) uitgedrukt in de meeste volwassen weefsels. M2 isovorm (PKM2), een alternatief gesplitste variant van M1 is die tijdens embryonale ontwikkeling [2]. Studies hebben aangetoond dat kankercellen uitsluitend uitdrukken PKM2 [3], [4]. PKM2 is aangetoond dat essentieel is voor de aërobe glycolyse in tumoren (Warburg effect) te zijn. Door de jaren heen hebben aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van de functie en regulatie van PKM2 als pyruvaat kinase en proteïne kinase in kankercellen [5]. Een recente studie bevestigde dat de PKM2 geïnduceerd door epidermale groeifactor (EGF) transloceert in de kern van glioblastoma cellen interageert met β-catenine en leidt tot cyclinD1 expressie, die proliferatie en tumorigenese bevordert cel [6]. Deze bevindingen wijzen op een nieuwe rol voor PKM2 als een transcriptie coactivator. Er zijn echter enkele controverse over de specificiteit en potentieel van PKM2 als een anti-kanker doelwit bij kankertherapie. Een recente bevinding bleek dat PKM2 expressie sterk gecorreleerd is met maagkanker differentiatie. Gedifferentieerde vormen van kanker te uiten meer PKM2 eiwit doen dan de ongedifferentieerde Ones. PKM2 was een negatieve voorspellende factor bij zegelring cel maagkanker [7]. De biologische rol van PKM2 differentiatie in verschillende fasen en in de ontwikkeling van maagkanker verder worden toegelicht.

Vorige studies over PKM2 gericht op tumormetabolisme en tumorgroei. Er zijn slechts een paar rapporten over tumormetastase geweest. E-cadherine speelt een cruciale rol bij het handhaven van epitheliale integriteit en het verlies van E-cadherine beïnvloedt de kleefstof repertoire van een cel [8]. Eerdere studies [9] in vitro hebben aangetoond dat het verlies van E-cadherine in humane carcinoma cellijnen wordt geassocieerd met een slechte differentiatie en een fibroblastoïde morfologie. De EGF-afhankelijke activering van de EGFR is beschreven dat kan worden geremd bij een E-cadherine-adhesie afhankelijke manier, waarbij de ligand afhankelijke activatie van verschillende receptortyrosinekinasen [10] remt. Ons onderzoek toonde aan dat de knock-down van PKM2 verminderde de activiteit van E-cadherine en verbeterde de EGF /EGFR signaling pathway in de cellijnen BGC823 en SGC7901 dat positief voor E-cadherine waren. In de ongedifferentieerde gastrische carcinoma cellijn AGS, waarbij E-cadherine mist, PKM2 bevorderd celmigratie en invasie. Het doel van deze studie was om de functie en het mechanisme van PKM2 ophelderen betreffende celbeweeglijkheid in verschillend gedifferentieerde cellijnen.

Materialen en Werkwijzen

Celkweek Voorwaarden en transfectie

de menselijke maagkanker cellijnen BGC823 (slecht gedifferentieerde, volgens de provider) en SGC7901 (matig gedifferentieerd) werden gekweekt in RPMI 1640 medium (HyClone, Logan, UT, USA). De AGS-cellijn (ongedifferentieerde) werd gekweekt in F12K medium. Alle cellen werden gekweekt in medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) en 100 IU /ml penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een 5% CO _{2 vochtige atmosfeer. De menselijke maagkanker cellijn AGS werd besteld bij de American Type Culture Collection (ATCC, USA), en de menselijke maagkanker cellijnen SGC7901 en BGC823 werden verkregen van China Centrum voor Type Culture Collection (Shanghai, China). SGC7901, BGC823 en AGS cellen werden getransfecteerd met de siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) of PU6 plasmide (pcPUR + U6-siRenilla) via HD FuGENE (Roche, Indianapolis, IN). Puromycine (0,1 ug /ml) werd gebruikt om te screenen op stabiel getransfecteerde klonen. De expressie van de PKM2 eiwit werd onderzocht met Western blot analyse met een antilichaam tegen PKM2 het vermogen van de constructen voor de expressie van het doelwitgen te remmen valideren; Deze experimenten werden driemaal herhaald. Celkweken werden ruststroom door ze te groeien tot confluentie gemaakt, en het medium werd vervangen door vers medium met 0,5% serum gedurende 1 dag. EGF met 100 ng /ml eindconcentratie werd gebruikt voor celstimulatie. EGF werd verkregen van Cell Signaling Technology.}

Stable Knockdown van PKM2 en Overexpressie van PKM2

Een plasmide dat een RNA interferentie sequentie die de PKM2 gen BGC823 gerichte, SGC7901 en AGS cellen was gebouwd. De sense oligo voor de siPKM2 sequentie was 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', en de antisense oligo was 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, SGC-7901 en AGS cellen werden getransfecteerd met pcPUR + U6-siPKM2 of pcPUR + U6-siRenilla (controle) en geselecteerd als puromycine-resistente klonen. Western blot analyse werd uitgevoerd om de PKM2 onderdrukking bevestigen. Een plasmide dat PKM2 cDNA sequentie werd verkregen van Invitrogen. BGC-823, SGC-7901 en AGS cellen werden getransfecteerd met pcDNA6.0-PKM2 of pcDNA6.0-mock (controle) en geselecteerd als blasticidine-resistente klonen. Western blot analyse werd uitgevoerd om de expressie te bevestigen PKM2.

Eiwitextractie en Western blotanalyse

De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer die een proteaseremmer cocktail, en de geëxtraheerde eiwitten werden gescheiden met 8-10% SDS-PAGE gels. P-tubuline werd gebruikt als beladingscontrole. Antilichamen tegen E-cadherine en p-E-cadherine werden verkregen van Epitomics. De fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-PLCγ1 (Tyr783), fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfo-c-CBL (Tyr700) en fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) antilichamen werden verkregen van Cell Signaling Technology.

RNA-extractie, reverse transcriptie en real-time PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met de TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA). De monsters werden vervolgens behandeld met DNase gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en het RNA werd verder gezuiverd onder gebruikmaking van een RNA cleanup kit (Qiagen, CA, USA). De reverse transcriptie (RT) reactie van de eerste streng cDNA-synthese werd uitgevoerd met reverse transcriptase (Bio-Rad) met 2 ug totaal RNA. Kwantitatieve RT-PCR-analyse werd uitgevoerd met de ABI 7500 (Applied Biosystems) en het gen expressieniveaus voor elk monster werden genormaliseerd naar GAPDH. De gemiddelde relatieve genexpressie bepaald en verschillen werden berekend met de 2 ^{-ΔΔCt Werkwijze agarose gelelektroforese. De RT-PCR-primersequenties waren als volgt: sense 5'- TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'en 5'- GTCATATGGTGGAGCTGTGGG antisense-3' voor N-Cadherin; sense 5'- CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'en 5'- AGGATGGTGTAAGCGATGGC antisense-3' voor E-cadherine; sense 5'- TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'en 5'- GCGTTCATCCTCATCGAAGT antisense-3' voor MMP7; sense 5'- CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'en 5'-antisense CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' voor GAPDH.}

Cell Proliferation Assay

celproliferatie werd gemeten met de Cell Counting kit-8 (DOJINDO, Kamimashiki gun, Kumamoto, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden de cellen uitgezaaid in vier 96-wells platen bij een dichtheid van 2 x 10 ^{3 cellen /putje. Eén plaat werd afgesloten op dezelfde tijd elke dag nadat de cellen waren gehecht aan de putjes. De absorptie werd gemeten met een microplaat reader bij een golflengte van 450 nm. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.}

Transwell Invasie en wondgenezing Assays

De transwell invasie assays werden uitgevoerd met 8,0 um porie-inserts in een 24-well plaat Transwell. Het basaalmembraan is gehydrateerd met 500 gl serumvrij RPMI 1640 of F12K medium 30 min vóór gebruik. Voor de invasie assay werden de maagkanker cellijnen aan de bovenste kamer van een Transwell aangevuld met 0,5 mg /ml collageen type l (BD Bioscience, San Jose, CA) gecoate filters. RPMI 1640 of F12K-medium met 10% foetaal runderserum en 1% van elk antibioticum aan de onderste kamer toegevoegd. BGC en 7901 cellen werden gedurende 36 uur. De AGS cellen werden gedurende 24 uur. De binnenvallende cellen werden gekwantificeerd na Gentiaan violet kleuring. Elk experiment werd in triplo uitgevoerd en de gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde waarden. De wondgenezing assay werd uitgevoerd in 6-well platen. Tumorcellen in medium met 10% FBS werden uitgezaaid in 6-wells platen (Corning). Celkweken werden ruststroom door ze te groeien tot confluentie gemaakt, en het medium werd vervangen door vers medium met 0,5% serum gedurende 1 dag. Wonden in de monolaag werden met steriele pipet tips. Vervolgens EGF met 100 ng /ml eindconcentratie werd gebruikt voor celstimulatie. De cellen werden daarna gewassen met PBS en ververst met medium dat 10% FBS. Foto's werden genomen op 0 en 24 uur. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud

Ethics Verklaring

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie (No: 20.081.012). Aan de Zhongshan ziekenhuis aangesloten bij Xiamen University, Xiamen, Fujian Province, China, en we verkregen schriftelijke toestemming verklaringen van alle deelnemers aan deze studie.

Voorbereiding van weefselmonsters

Tumor weefselmonsters werden verzameld uit 15 verschillende maagkanker patiënten die een curatieve resectie ondergingen in het Zhongshan ziekenhuis, Xiamen University, Xiamen, China. Een onafhankelijke reeks corresponderende aangrenzende goedaardige weefsels 15 van dezelfde patiënten werden verzameld op hetzelfde moment. Alle weefselmonsters werden verzameld en verdeeld in twee delen onmiddellijk na resectie van de tumor. Een deel werd verzameld in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot RNA en eiwitextractie. Het andere deel werd gefixeerd in 4% formaldehyde en ingebed in paraffine voor histologische analyse (hematoxyline eosine en IHC kleuring). Alle monsters werden bevestigd door pathologische diagnose (de histopathologische diagnose was gebaseerd op de WHO-criteria). Alle experimentele gevallen werden gegroepeerd-vol gens de International Union Against Cancer Tumor-Node-metastase (TNM) staging-systeem (herzien in 2002).

Immunohistochemie

Vier-micron-dikke paraffine secties werden ofwel gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E) en geanalyseerd op PKM2, p-ERK1 /2 en E-cadherine door immunohistochemie. Immunohistochemie werd uitgevoerd volgens de procedures die door de fabrikant werden aanbevolen. De reacties werden gevisualiseerd met behulp diaminobenzidine als chromogeen substraat. De secties werden tegengekleurd met behulp van hematoxyline en daarna opgeruimd en gemonteerd. De gemiddelde dichtheid (IOD /gebied) werd ontdekt in verschillende positieve gebieden van de 15 menselijke maagkanker monsters met behulp van Image-Pro Plus software.

Statistische analyses

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS v13. 0 (SPSS, Inc.) software. The Independent-Samples T Test en correlatie analyse werden gebruikt om de gegevens te vergelijken. Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelden ± SD. De verschillen werden beschouwd als statistisch significant bij P
. ≪ 0.05

Resultaten

Uitputting van PKM2 Bevorderd Cell Migratie en invasie in BGC823 en SGC7901 Cellen met EGF stimulatie

de expressie van het eiwit in de PKM2 maagkanker cellijnen BGC823, SGC7901 en AGS werd geëvalueerd met behulp van Western blot analyse. Deze cellijnen vertoonden een hoog PKM2 expressie. Dan, stabiele maagkanker cellijnen met een veranderde PKM2 expressie werden vastgesteld met behulp van RNA-interferentie (PKM2 knock-down) in de BGC823, SGC7901 en AGS-cellen. Zoals getoond in Fig. 1A, de BGC823, SGC7901 en AGS cellijnen met PKM2 knockdown werden opgericht. We zagen dat de proliferatie was verlaagd bij de BGC823 en AGS cellen na PKM2 werd verarmd (fig. 1B). Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere studies.

Om het effect van PKM2 op mobiele migratie en invasie te onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt gerenommeerde wondgenezing en transwell assays aan de cel beweeglijkheid respons in de BGC823 en SGC7901 cellen te karakteriseren . Een confluente laag cellen werd eerst overnacht geïncubeerd in medium, een kras wond werd geïntroduceerd, medium met de geschikte dosis van EGF (100 ng /ml) werd toegevoegd aan migratie stimuleren en het percentage wond afdichting werd waargenomen na 24 uur ( figuur S1). De binnendringende cellen werden gekwantificeerd 36 uur na EGF (100 ng /ml) aan de onderste kamer toegevoegd. De resultaten geven aan dat de behandeling van BGC823-sipk en SGC7901-sipk cellen met EGF na een kras wond en de transwell sterk toegenomen snelheid van wondgenezing (fig. 1 C, D) en invasie (fig. 1 E, F) vergeleken met die van de controle cellen.

Uitputting van PKM2 Verminderde E-cadherine expressie en verbeterde de werkzaamheden van de EGF /EGFR Downstream signaalroutes PLC-γ1 en ERK1 /2

Om de onderzoeken mechanisme van de veranderingen in celmigratie en invasie na de knockdown van PKM2 analyseerden we de expressie van leden van de Ca ^{2 + afhankelijke celadhesiemoleculen familie en metalloproteinasen. We vonden dat E-cadherine eiwit expressieniveaus werden afgenomen BGC823 en SGC7901 cellen bij PKM2 expressie werd gereduceerd (Fig. 2A).}

De hoogte van E-cadherine-mRNA en de fosforylering van E-cadherine werd vastgesteld BGC823 en SGC7901 cellen met PKM2 uitputting om te beoordelen of het waargenomen verschil in de E-cadherine opgetreden pre- of post-translationeel. We observeerden de neerwaartse regulatie van E-cadherine-mRNA en verhoogde fosforylering, waarbij de endocytose van E-cadherine induceert, in PKM2 uitgeputte cellen (Fig. 2A, B). We vonden ook dat de expressie niveau van de N-cadherine eiwit werd verhoogd in de BGC823 en SGC7901 cellijnen toen PKM2 werd uitgeput (Fig. 2A).

Mobiele migratie en invasie worden grotendeels gereguleerd door de EGFR activiteit. Om te analyseren of de EGFR betrokken is bij de migratie en invasie van BGC823 en SGC7901 cellen werden deze cellen behandeld met EGF, dat bindt aan de EGFR activeert en de stroomafwaartse signaleringsroutes. De behandeling EGF resulteerde in de fosforylering van de EGFR en de daaropvolgende activering van de PLCγ1, AKT en ERK1 /2 cascade (fig. 2C). We vonden dat PLC γ1 had een hoger activiteitenniveau in-PKM2 uitgeputte cellen dan in-un uitgeputte cellen na ofwel een korte of lange (24 uur) incubatie met EGF. Er was geen duidelijk verschil in activiteit tussen de AKT-PKM2 cellen uitgeputte en niet-uitgeputte cellen. PLCy is een belangrijke regulator van de cel migratie stroomafwaarts van RTK signalering [11]. Fosforylering op tyrosine residu 783 van PLCγ1 is cruciaal voor de activering [12]. PLCγ1 activatie verhoogde celmotiliteit en dit effect werd waargenomen in de wond kras en transwell assays, zoals waargenomen in Fig. 1C.

Vervolgens onderzochten we het effect van een EGFR ligand op de expressie van MMP gebruikt RT-PCR-BGC823 sipk en SGC7901 sipk-cellen in vergelijking met hun respectievelijke controlecellen. Behandeling met het EGFR ligand EGF, verhoogde de expressie van MMP's op het niveau van transcriptie in BGC823 en SGC7901 cellen. Echter, er waren geen duidelijke verschillen in de expressieniveaus van MMP2 en MMP9 tussen PKM2-uitgeputte cellen en de controlecellen (gegevens niet getoond). MMP7 expressie is opgereguleerd in PKM2 uitgeputte cellen met EGF behandeling (Fig. 2D). De ERK /MAPK trajecten spelen cruciale rol in EGFR-ligand geïnduceerde MMP7 expressie. Verder is een duidelijke toename van de ERK1 /2 activiteit werd waargenomen na 0 uur en 24 uur van de behandeling met EGF in-PKM2 uitgeputte cellen.

Uitputting van PKM2 Verzwakte de beweeglijkheid van AGS cellen en de functionele veranderingen na het redden van PKM2 bij maagkanker cellijnen

de expressie van E-cadherine eiwit in de maag kankercellijnen BGC823, SGC7901 en AGS werd beoordeeld met Western blotanalyse. De BGC823 en SGC7901 cellijnen E-cadherine. Daarentegen AGS cellen missen E-cadherine (Fig. 3A).

Om het effect van PKM2 knockdown op celmigratie en invasie in AGS cellen onderzoeken, gebruikten we gevestigde wondgenezing en transwell assays karakteriseren de cel beweeglijkheid. Een confluente laag cellen werd eerst overnacht geïncubeerd in medium, een wond kras werd geïntroduceerd, medium met EGF (100 ng /ml) werd toegevoegd aan migratie stimuleren en het percentage wond afdichting werd waargenomen na 24 uur. De binnenvallende cellen in de transwell assay gekwantificeerd 24 uur na EGF (100 ng /ml) aan de onderste kamer toegevoegd. Tot onze verrassing vonden wij dat de behandeling van AGS-sipk cellen met EGF na de wond kras en de transwell aanzienlijk verlaagde de snelheid van wond afdichting en invasie in vergelijking met die van de controlecellen (fig. 3B, C). Er waren opvallende verschillen tussen de BGC823 /SGC7901 en AGS-cellen.

Om de rol van PKM2 in cel beweeglijkheid verder toe te lichten, hebben we de PKM2 redden experimenten. We Taked stabiel getransfecteerde methode met behulp van over-expressie plasmide vector pcDNA6.0-mock en pcDNA6.0-PKM2 om te gaan met BGC823 en AGS cellen die stabiel knockdown PKM2. De expressie van p-EGFR, E-cadherine worden getoond in de PKM2 redden experimenten (fig. 3D). We hebben vastgesteld dat wanneer de uitdrukking PKM2 teruggewonnen, de fosforylering van EGFR aanzienlijk verminderd BGC823 cellen en toegenomen AGS cellen. Bovendien cel beweeglijkheid van BGC823 cellen werd verminderd en AGS cellen werden afgenomen na PKM2 redden (Fig. 3E). Om het mechanisme van deze verschillen te verduidelijken, dan analyseerden we de activiteit van de EGF /EGFR signaleringsroute.

PKM2 Verbeterd de werkzaamheden van de EGF /EGFR Downstream signaalwegen in AGS cellen en werd gecorreleerd met ERK activiteit in de maag kanker Specimens

om te analyseren of de EGFR betrokken kan zijn bij de migratie en invasie van AGS cellen werden deze cellen behandeld met EGF, dat bindt aan de EGFR activeert en de stroomafwaartse signaleringsroutes. EGF-behandeling resulteerde in de fosforylering van de EGFR en de daaropvolgende activering van de EGFR stroomafwaartse paden, zoals de PLCγ1 en ERK1 /2 cascade (Fig. 4A). We vonden dat de activiteiten van PLCγ1 en ERK1 /2 groter in cellen waarin PKM2 niet verbruikt is dan bij de met PKM2 uitgeputte cellen na ofwel korte of lange (24 uur) incubatie met EGF werden. Dit resultaat is het tegenovergestelde van wat werd waargenomen met de BGC823 en SGC7901 cellen; in AGS cellen, PKM2 kwam in het spel als een stimulans en bevorderd cel migratie en invasie. Vervolgens onderzochten we MMP7 expressie middels RT-PCR in AGS-sipk cellen en de controlecellen. De behandeling met EGF verhoogde MMP7 expressie op het niveau van transcriptie in AGS-PU6 cellen, maar niet in AGS-sipk cellen (Fig. 4B). De activiteit van ERK1 /2 was duidelijk hoger in AGS-PU6 cellen in vergelijking met AGS-sipk cellen na 0 uur en 24 uur behandeling met EGF (Fig. 4A).

We next uitgevoerd immunohistochemische (IHC) analyses onderzoekt E-cadherine, PKM2 lokalisatie en ERK1 /2 fosforylering in seriële secties van 15 menselijke maagkanker monsters met behulp van antilichamen met gevalideerde specificiteiten. Figuur 4C toont aan dat de niveaus van E-cadherine, ERK1 /2 fosforylering en cytoplasmatische PKM2 expressie werden met elkaar gecorreleerd. Daarnaast zagen we een hoge ERK1 /2 fosforylering in de kern van kankercellen zonder E-cadherine. In gebieden van ERK1 /2 fosforylering, vonden we ook hogere niveaus van PKM2 expressie. Maar, we hebben niet de fosforylering van ERK1 /2 te vinden in gebieden die positief voor E-cadherine (Fig. 4C). Een correlatieanalyse tussen PKM2, E-cadherine en P-ERK1 /2 werd uitgevoerd onder toepassing van Image-Pro Plus software (Fig. 4D). De gemiddelde dichtheid (IOD /oppervlak) werd opgenomen in verschillende positieve gebieden van 15 menselijke maagkanker monsters. We vonden een significante correlatie tussen PKM2 en E-cadherine in E-cadherine-positieve gebieden. Bovendien was er een significante correlatie tussen PKM2 en p-ERK1 /2 E-cadherine-negatieve gebieden.

Discussie

De invasieve en metastatische fase van kankervooruitgang correleert met een slechte klinische prognose en vertegenwoordigt de meest formidabele barrière voor een succesvolle behandeling. Celmotiliteit en invasiviteit de bepalende kenmerken van kwaadaardige tumoren, die tumorcellen in staat te migreren naar aangrenzende weefsels of door vermindering basaalmembranen en extracellulaire matrices. Celmotiliteit is vereist voor de fysiologische processen van wondheling en organogenese en het ziekteproces van tumorinvasie [13]. Invasieve tumorcellen worden gekenmerkt door ontregelde celbeweeglijkheid in respons op extracellulaire signalen van groeifactoren en cytokines. Menselijke tumoren tot expressie hoge niveaus van groeifactoren en hun receptoren, en vele typen kwaadaardige cellen blijken autocrine- of paracriene gestimuleerde groei vertonen. Een van de meest onderzochte groeifactor receptor systemen is de EGF-receptorfamilie [14]. Signalen van de extracellulaire milieu dicteren celmotiliteit. Veel groeifactoren, zoals de liganden die werken via de epidermale groeifactor receptor (EGFR), verbeteren celmotiliteit [15]. Ten minste twee verschillende intracellulaire signaalroutes zijn vereist voor EGFR gemedieerde motiliteit: de paden gebruikmaking PLC γ en de MAP kinase route. PLC γ activiteit is de motiliteit van cellen door middel van het mobiliseren van actine modificerende eiwitten van een inactief membraangebonden lokalisatie te verbeteren om een ​​actieve sub-membraan cytoskelet locale [16]. De Erk MAP kinasen zenden signalen naar de nucleus en signalen die celmatrix verbindingen regelen.

cadherins omvatten een grote familie van intercellulaire adhesiemoleculen die de klassieke, desmosomale en atypische cadherins omvatten. E-cadherine, dat voornamelijk tot expressie in epitheelcellen, is een adhesie-eiwit dat wordt gecodeerd door het CDH1 gen en functies in meerdere processen, zoals ontwikkeling, weefselintegriteit, celmigratie, morfologie en polariteit [17], [18], [19]. E-cadherine is ook een tumor suppressor waarvan de expressie wordt vaak verminderd of tot zwijgen gebracht, en de re-expressie kan morfologische reversion [20], [21] veroorzaken. De EGF-afhankelijke activering van de EGFR is beschreven dat kan worden geremd bij een E-cadherine-adhesie afhankelijke manier, waarbij de ligand afhankelijke activatie van verschillende receptortyrosinekinasen remt. N-cadherine, als een invasie promoter, vaak opgereguleerd. De expressie van N-cadherine in epitheelcellen induceert veranderingen in morfologie van een fibroblast fenotype, waardoor de cellen beweeglijker en invasieve. Recente studies tonen aan dat kankercellen opgereguleerd N-cadherine naast het verlies van E-cadherine. Deze verandering in cadherine wordt de "cadherine switch".

We zagen een neerwaartse regulatie van E-cadherine-mRNA en verhoogde fosforylering, waarbij de endocytose van E-cadherine induceert, in PKM2 uitgeputte cellen. We vonden ook dat de N-cadherine eiwit expressie niveau werd verhoogd in de BGC823 cellijn toen PKM2 werd uitgeput. De knock-down van PKM2 bevorderd cel migratie en invasie in BGC823 en SGC7901 cellen met EGF stimulatie. Een verhoogde activiteit van het EGFR is de kritische factor bij het bepalen van de cel motiliteit en invasiviteit van BGC823 en SGC7901 cellen. Onze hypothese was dat de down-regulatie van E-cadherine verbeterde de fosforylering van de EGFR en geactiveerd de stroomafwaartse signaalwegen, die PLCγ1 en ERK1 /2 omvatten. PLC γ activatie verhoogt celmotiliteit en ERK1 /2 activiteit speelt een cruciale rol in MMP7 expressie.

Matrix metalloproteïnasen (MMP's) zijn betrokken bij kanker en metastase door hun extracellulaire matrix (ECM) -proteolytic activiteit [22]. MMP-7 heeft naar verluidt door gastrische carcinoomcellen en significant geassocieerd met de agressieve pathologische fenotypen van maagkanker [23]. MMP-7 kan pro-MMP-1 activeert, een sterke stromelysine-achtige activiteit en degradeert onoplosbaar elastine, collageen type IV, laminine-1, fibronectine, proteoglycanen en gelatinen [24]. De ERK /MAPK routes cruciale rol spelen in EGF-geïnduceerde expressie MMP7 [25].

E-cadherine is een cel-adhesie glycoproteïne kenmerk voor het eerst in menselijke cellijnen door Shimoyama et al [26]. Haar rol maag kankerontwikkeling werd eerst gedefinieerd door Guilford et al [27]. Er is een significante correlatie tussen de mate van E-cadherine en van de functie van tumor differentiatie, evenals de histologische type volgens de Laurén en WHO classificaties. Patiënten met E-cadherine-positieve tumoren significant betere 3- en 5-jaarsoverleving dan patiënten met E-cadherine-negatieve tumoren [28]. Erfelijke diffuse maagkanker (HDGC) is een zeldzame autosomaal dominant syndroom dat is grotendeels te danken aan kiemlijn mutaties en deleties in de CDH1 gen geassocieerd met een vroeg begin, histologisch diffuse, zegelring celtype maagkanker [29], [30].

Lim JY et al gemeld dat PKM2 expressie was sterk gecorreleerd met maagkanker differentiatie. Gedifferentieerde vormen van kanker te uiten meer PKM2 eiwitten dan de ongedifferentieerde soorten; in tegenstelling, is hoger PKM2 expressie gecorreleerd met een kortere totale overleving onafhankelijk van het podium in zegelring cel kankers. PKM2 expressie kan een prognostische factor voor zegelring cel carcinomen, waarbij E-cadherine ontberen [7]. Deze resultaten zijn in overeenstemming met het onderzoek bij maagkanker cellen. De BGC-823, SGC-7901 en AGS cellijnen zijn verschillend gedifferentieerde types. E-cadherine bestaat in de SGC-7901 en BGC-823 cellijnen; Daarentegen werden de AGS cellen afkomstig van maligne weefsel maagdarmkanker en missen-E-cadherine-gemedieerde celadhesie [31]. We zagen dat de knock-down van PKM2 bevorderde de migratie en invasie van de SGC-7901 en BGC-823 cellijnen, maar onderdrukt deze eigenschappen in de AGS cellijn. Een andere groep heeft gemeld dat pyruvaat kinase Type M2 is opgereguleerd in colorectale kanker en de knockdown van PKM2 onderdrukt de proliferatie en migratie van colonkanker RKO-cellen [32]. We weten dat RKO cellen missen de expressie van E-cadherine [33]. Immunohistochemische analyse (IHC) toont aan dat de niveaus van E-cadherine, ERK1 /2 fosforylering en cytoplasmatische PKM2 expressie werden met elkaar gecorreleerd. We hebben een hoge ERK1 /2 fosforylering in de kern van kankercellen zonder E-cadherine maar met een hoog PKM2 expressie.

We veronderstellen dat PKM2 verzwakt celmotiliteit en invasie als E-cadherine is aanwezig. Deze nieuwe functie PKM2 kan een rol spelen bij de reversibele remming van celmotiliteit en invasie in de vroege stadia van maagkanker wanneer cellen zijn positief voor E-cadherine. Tijdens de progressie van de tumor, een gebrek aan of zeer lage expressie van E-cadherine induceert een agressieve werking van PKM2 in de tumor. De biologische rol van PKM2 bij de ontwikkeling van deze tumoren verder worden toegelicht.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
De expressie van de EGFR eiwit in de maag kankercellijnen BGC823, SGC7901 en AGS werd geëvalueerd met behulp van Western blot analyse. AGS cellen vertoonden een hogere EGFR-expressie dan de andere twee cellijnen. Er is geen significant verschil tussen BGC823 en SGC7901 cellen (figuur S1A). BGC-PU6 cellen en BGC sipk-cellen werden behandeld met verschillende doseringen van EGF. Na 40 minuten gedetecteerd we het niveau van fosforylering van EGFR. We vonden de hoogste fosforylering in de dosis van 100 ng /ml (Figuur S1B). Daarom kozen we de dosis van 100 ng /ml als meest geschikte kandidaat. De transwell experiment toonde ook de sterkere vermogen om de martrigel dringen in BGC823 cellen (figuur S1C)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF)

• PLoS ONE: genetische varianten in epidermale groeifactor receptor Pathway genen en risicofactoren van Esophageal plaveiselcelcarcinoom en maagkanker in een Chinese bevolking
• PLoS ONE: Small Molecule R1498 als een goed verdragen en oraal actieve Kinase Inhibitor voor hepatocellulaire carcinoom en maagkanker Behandeling via Targeting Angiogenese en Mitose Pathways