PLoS ONE: Piruvato kinazės M2 vaidina dvigubą vaidmenį reglamento EGF /EGFR signalizacijos elektroniniu cad priklausomu būdu skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

fone ir tikslai

EGFR aktyvavimo ir PKM2 išraiška yra priemonė Tumorigenesis. EGFR aktyvacijos reguliuoja PKM2 funkcijas pavienių ląstelių tyri- mas skyriaus priklausomu būdu ir skatina genų transkripciją ir naviko augimą. Be to, PKM2 yra aktyvinama į EGFR sukeltos stažuočių glioma piktybinių navikų. Tačiau mes nustatėme, kad PKM2 taip pat gali reguliuoti EGF /EGFR signalinio kelio skrandžio vėžio ląstelių aktyvumą. Siekėme nustatyti biologinius mechanizmus PKM2 reguliuojant ląstelių judrumą ir invazija.

Metodai

dirba stabiliai transfekcijq su trumpu segtukas RNR stabiliai nutildyti iš PKM2 išraišką BGC823, SGC7901 ir AGS skrandžio vėžio ląstelių linijos. Į PKM2 poveikis in vitro buvo nustatomas įvertinant ląstelių migraciją ir invazija. Imunohistocheminis analizė buvo naudojama tiriant tarp PKM2 ir kitų baltymų santykį.

Rezultatai

Mūsų rezultatai rodo, kad PKM2 nokdaunas sumažino E-cad veiklą ir stiprinti EGF /EGFR signalizacijos kelias skrandžio ląstelių linijų BGC823 ir SGC7901, kurie buvo teigiamas E-cad išraiška. Tačiau nediferencijuotos skrandžio karcinoma ląstelių linijos AGS, kurioje trūksta El cad išraišką, PKM2 skatinamas ląstelių migraciją ir invazija. Imunohistocheminiais analizė parodė, kad e-cad išraiškos, ERK1 /2 fosforilinimo ir citoplazmos PKM2 išraiškos lygis buvo susijęs su kitu

Išvada:.

PKM2 gali vaidinti skirtingus vaidmenis kitaip diferencijuota skrandžio vėžio ląstelių tipų, ir ši išvada būtų suderinama su ankstesnės klinikinius tyrimus. Mūsų tyrimo rezultatai rodo, svarbų ryšį tarp PKM2 ir E-cad metu EGFR stimuliuojama skrandžio vėžio ląstelių judrumui ir invazijos

nurodomoji dalis:. Wangas LY Liu YP Chen LG Chen ilas, Tan L Liu JJ, ir kt. (2013) Piruvato kinazės M2 vaidina dvigubą vaidmenį reglamento EGF /EGFR signalizacijos elektroniniu cad priklausomu būdu skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 8 (6): e67542. Doi: 10,1371 /journal.pone.0067542

redaktorius: Hiromu Suzuki, Saporas medicinos universitetas, Japonija

Įstojo: vasario 7, 2013; Priėmė: Gegužės 20, 2013 m Paskelbta: Birželis 28, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 30971362, 81072013 & 91229201), pagrindinių mokslinių tyrimų fondų Centrinės universitetų Kinijoje (Nr 2010111082) ir sveikatos apsaugos ministerija fondo valstybės Key Clinical departamento. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

piruvato kinazės (PK) tarpininkauja galutinį greitį ribojantis žingsnis glikolizės katalizuodamas iš fosfoenolpiruvato (PEP) dephosphorylation į piruvato duoti vieną molekulę ATP. Žinduolių ląstelės turi keturis piruvato kinazės izofermentų (M1, M2, L, ir R), kurie yra pasirinktinai išreikštas skirtingų tipų ląstelių ir audinių [1]. Žinduolių, M1 izoforma (PKM1), yra išreiškiamas daugeliu suaugusių audiniuose. M2 izoformos (PKM2), alternatyviai mRNR variantas M1, išreiškiama per embriono vystymosi [2]. Tyrimai nustatė, kad vėžio ląstelės tik išreikšti PKM2 [3], [4]. PKM2 buvo įrodyta, kad būti svarbu aerobikos glikolizės į navikus (Warburg efektas). Bėgant metams, reikšmingi patobulinimai buvo atlikti suprasti funkciją ir reguliavimą PKM2 kaip piruvato kinazės ir baltymų kinazės vėžinių ląstelių [5]. Neseniai atliktas tyrimas patvirtino, kad PKM2 sukelia epidermio augimo faktoriaus (EGF) lėšos translocates į glioblastomos ląstelių branduoliuose, sąveikauja su beta-kateninai ir veda prie cyclinD1 išraiškos, kuris skatina ląstelių proliferaciją ir tumorigenezei [6]. Šie duomenys atskleidžia romano vaidmenį PKM2 kaip transkripcijos coactivator. Tačiau, yra keletas nesutarimų dėl tokio konkretumo ir potencialą PKM2 kaip priešvėžinis tikslą vėžio terapija. Neseniai išvada parodė, kad PKM2 išraiška yra stipriai koreliuoja su skrandžio vėžio diferenciacijos. Diferencijuoti rūšių vėžio išreikšti daugiau PKM2 baltymų nei padaryti nediferencijuotą tie. PKM2 buvo neigiamas prognozinis veiksnys antspaudo žiedas ląstelių skrandžio vėžio [7]. reikia toliau išaiškinta biologinė vaidmuo PKM2 skirtingose ​​diferenciacijos etapus ir skrandžio vėžio vystymąsi.

Ankstesni tyrimai dėl PKM2 sutelktas į naviko metabolizmo ir naviko augimą. Yra buvę tik keli pranešimai apie naviko metastazių. El cad vaidina svarbų vaidmenį išlaikant epitelio vientisumo, o E-cad praradimas paveikia lipnia repertuarą į [8] ląstelę. Ankstesni tyrimai [9] in vitro parodė, kad E-cad nuostoliai žmogaus karcinoma ląstelių linijų yra susijęs su prasta diferenciacijos ir fibroblastoid morfologijos. EGF-priklauso nuo aktyvavimo EGFR buvo pranešė, kurios turi būti inhibuojamos į E-cad sukibimo-priklausomu būdu, kuris slopina ligando-priklauso aktyvavimą įvairių receptoriaus tirozino kinazės [10]. Mūsų tyrimai parodė, kad PKM2 nokdaunas sumažino E-cad veiklą ir stiprinti EGF /EGFR signalizacijos kelią į ląstelių linijų BGC823 ir SGC7901 kad buvo teigiami E-cad išraiška. Tačiau nediferencijuotos skrandžio karcinoma ląstelių linijos AGS, kurioje trūksta El cad išraišką, PKM2 skatinamas ląstelių migraciją ir invazija. Šio tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti, funkciją ir mechanizmą PKM2 atsižvelgiant į mobilųjį judrumo skirtingai diferencijuotų ląstelių linijų.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra, sąlygos ir transfekcijq

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas BGC823 (blogai diferencijuota, atsižvelgiant į paslaugų teikėjo) ir SGC7901 (vidutiniškai diferencijuotas) buvo auginamos RPMI 1640 terpė (HyClone Logan, UT, JAV). AGS ląstelių linija (nediferencijuotos) buvo kultivuojamas F12K terpėje. Visos ląstelės buvo auginamos terpėje, turinčioje 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) (Gibco, Detroitas, MI, JAV) ir 100 TV /ml penicilino-streptomicino 37 ° C temperatūroje, 5% CO _{2 temperatūroje drėgnoje atmosferoje. Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija "AGS buvo įsakyta iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (ATCC, JAV) ir žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų SGC7901 ir BGC823 buvo gauti iš Kinijos centro tipas kultūros kolekcija (Šanchajus, Kinija). SGC7901, BGC823 ir AGS ląstelės buvo pernešta su siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) arba PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plazmidžių naudojant FuGENE HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromicino (0,1 mikrogramų /ml) buvo naudojamas atrinkti stabiliai transfekuotų klonų. Priemonės, kuriomis PKM2 baltymo ekspresija buvo tiriama su Western Blot analizę, naudojant antikūną prieš PKM2 bazėmis siekiant patvirtinti konstruktais, sugebėjimo inhibuoti tikslinį genų ekspresiją; šie eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. Ląstelių kultūros buvo pagamintas nejudamas auginant juos iki susiliejimo, ir vidutinės buvo pakeistas su šviežia terpėje, turinčioje 0,5% serumas 1 dieną. EGF su 100 ng /ml galutinė koncentracija buvo naudojamas ląstelių stimuliavimu. EGF buvo gautas iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos.}

Stabilus triuškinantis iš PKM2 ir per išraiška PKM2

plazmidės sudėtyje yra RNR interferencijos seka, kad tikslinę į PKM2 genu BGC823, SGC7901 ir AGS ląstelės buvo pastatyti. Ta prasme, oligo už siPKM2 seka buvo 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', ir priešprasminis oligo buvo 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, SGC-7901 ir AGS ląstelės buvo pernešta su pcPUR + U6-siPKM2 ar pcPUR + U6-siRenilla (kontrolės) ir pasirinkta kaip puromicino atsparus klonai. Vakarų dėmė analizė buvo atlikta siekiant patvirtinti PKM2 kritimą. Plazmidė, kurių sudėtyje yra PKM2 kDNR seka buvo gauta iš Invitrogen. BGC-823, SGC-7901 ir AGS ląstelės buvo pernešta su pcDNA6.0-PKM2 ar pcDNA6.0-maketas (kontrolė) ir pasirinkta kaip blasticidin atsparių klonai. Western Blot analizė buvo atliekama siekiant patvirtinti PKM2 išraiška.

Baltymų ekstrahavimas ir Vakarų dėmė analizė

Ląstelės buvo resuspenduotas lizės buferiniame tirpale, kuriame yra proteazės inhibitoriaus kokteilį, ir išimtos baltymai buvo atskirtos naudojant 8-10% SDS-PAGE geliai. beta-tubulino buvo naudojamas kaip krovimo valdymu. Antikūnai prieš E-cad ir p-E-cad buvo gauti iš Epitomics. PHOSPHO-EGFR (Tyr1068), PHOSPHO-PLCγ1 (Tyr783), PHOSPHO-AKT (Ser473), PHOSPHO-gab1 (Tyr627), PHOSPHO-C-CBL (Tyr700) ir PHOSPHO-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) antikūnai buvo gauti iš ląstelių Signalizacijos technologijos.

RNR gavyba, atvirkštinės transkripcijos ir Realaus laiko PGR

viso RNR išskirta naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, CA, JAV). tada mėginiai buvo gydomi DNaze 15 min kambario temperatūroje, ir RNR buvo toliau gryninamas naudojant RNR valymo rinkinys (Qiagen, CA, USA). Atvirkštinio transkripcijos (RT), reakcija pirmą-kryptis sintezei buvo atliekama naudojant atvirkštinės transkriptazės (Bio-Rad) su 2 mikrogramai visos RNR. Kiekybinis RT-PGR analizė buvo atlikta su ABI 7500 (Applied Biosystems), ir genų ekspresijos, lygius kiekvienam atskiro mėginio buvo normalizuojamas GAPDH. Vidutinė santykinė genų ekspresijos nulėmė ir skirtumai buvo apskaičiuoti naudojant 2 ^{-ΔΔCt metodą agarozės gelio elektroforezės. RT-PGR pradmenų sekas buvo taip: jausmas 5'-TGTGGGAATCCGACGAATG-3 "ir antiprasmiq 5'-GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3" už N-cad; jausmas 5'-CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 "ir Priešprasminis 5'-AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3" E-cad; jausmas 5'-TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 "ir Priešprasminis 5'-GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3" už MMP7; jausmas 5'-CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 "ir Priešprasminis 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3" už GAPDH.}

ląstelių proliferaciją Analizės

ląstelių proliferacija buvo matuojamas naudojant Mobilusis skaičiavimas komplektas-8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Kumamoto, Japonija), pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai, ląstelės buvo pasėjamos keturių 96-duobučių lėkštelėse esant 2 × 10 ^{3 ląstelių tankio /duobutėje. Vienas plokštelė buvo paimtas tuo pačiu metu kiekvieną dieną po to, kai ląstelės buvo laikytis į šulinėlius. Absorbcija buvo matuojamas su mikroplokštelės skaitytuvą, esant 450 nm bangos ilgiui. Visi eksperimentai buvo atliekami tris kartus.}

Transwell invazija ir žaizdų gijimą Bandymai

transwell invazija tyrimai buvo atliekami su 8,0-mkm-porų intarpais 24 šulinėlių transwell plokštės. Rūsyje membrana yra hidratuota su 500 pL serumo neturinti RPMI 1640 arba F12K vidutinės 30 min prieš naudojimą. Už invazijos testą, skrandžio vėžio ląstelių linijas, buvo pridėta prie viršutinės kameroje yra transwell su 0,5 mg /ml tipo kolageno L (BD biologijos, San Chosė, CA) -coated filtrus. RPMI 1640 arba F12K vidutinės su 10% vaisiaus galvijų serumo ir 1% kiekvienam antibiotikui buvo įtraukta į apatinę kamerą. BGC ir 7901 ląstelės buvo inkubuojamos 36 valandas. MAA ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas. Invazija ląstelės buvo kiekybiškai po gencijonų violetine dažymo. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus, ir duomenys buvo išreikštas vidutinės vertės. Žaizda gijimo tyrimas buvo atliktas 6-duobučių lėkštelėse. Auglio ląstelės į terpę, turinčią 10% FBS buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse (Corning, CA). Ląstelių kultūros buvo pagamintas nejudamas auginant juos iki susiliejimo, ir vidutinės buvo pakeistas su šviežia terpėje, turinčioje 0,5% serumas 1 dieną. Žaizdos monosluoksnio buvo su sterilia pipete patarimų. Tada EGF su 100 ng /ml galutinė koncentracija buvo naudojamas ląstelių stimuliavimu. Po to ląstelės buvo plaunamas PBS ir atnaujinami terpėje, turinčioje 10% FBS. Nuotraukos buvo imtasi 0 iki 24 h. Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais

Etika pareiškimas

Šis tyrimas patvirtino Etikos komiteto (Nr: 20.081.012). Tuo Zhongshan ligoninė susijęs su Siameno universitetas, Xiamen, Fujian Province, Kinija, ir mes gauti raštišką sutikimą ataskaitas iš visų dalyvių, dalyvaujančių šiame tyrime.

paruošimas audinio mėginiai

vėžinių audinių mėginiai buvo surinkti iš 15 skirtingų skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kuriems buvo atlikta gydomoji rezekcija tuo Zhongshan ligoninė, Xiamen universitetas, Siamenas, Kinija. Nepriklausoma serija atitinkamų gretimų noncancerous audinius nuo 15 tų pačių pacientų buvo surenkamos ne tuo pačiu metu. Visi audinio pavyzdžiai buvo surinkti ir padalintas į dvi dalis iš karto po to, kai buvo atlikta naviko rezekcija. Viena dalis buvo surinkti į skysto azoto ir saugomi -80 ° C temperatūroje, kol RNR ir baltymų ekstrahuojant. Kita dalis buvo nustatyta 4% formaldehido ir įdėta į parafiną ir histologiniai analizė (hematoksilinu eozino ir IHC dažymo). Visi egzemplioriai buvo patvirtinta patologinės diagnozės (toliau histopatologinė diagnozė buvo pagrįsta PSO kriterijus). Visi eksperimentiniai atvejai

imunohistocheminis

Keturių mikronų storio parafino skyrius buvo sugrupuoti Accord-mas į Tarptautinį Sąjungos kovos su vėžiu naviku limfmazgius metastazių (TNM) sustojimo sistemos (persvarstytą 2002 m). buvo arba tamsintas hematoksilinu ir eozinu (H & E) arba analizuojamas PKM2, p-ERK1 /2 ir E-cad išraiškos imunohistocheminiu. Imunohistocheminis buvo atlikta pagal tokias procedūras, kurios buvo rekomendavęs gamintojas. Reakcijos buvo vizualizuojama naudojant diaminobenzidinas kaip chromogeninės substrato. Skyriai buvo counterstained naudojant hematoksilinu ir tada išvalytas ir sumontuoti. Vidutinis tankis (DAP /sritis) buvo aptikta įvairių teigiamų srityse 15 žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių naudojant Vaizdo-Pro Plus programinė įranga.

Statistinės analizės

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS v13. 0 (SPSS Inc.) programinė įranga. Nepriklausomų imčių t testas ir koreliacinė analizė buvo naudojamas palyginti duomenis. Visos vertės yra išreiškiamos priemonėmis ± SD. buvo laikomi Skirtumai statistiškai reikšmingi, P
. < 0,05

Rezultatai

išeikvojimas PKM2 Paaukštintas ląstelių migraciją ir invazija į BGC823 ir SGC7901 Ląstelės su EGF stimuliavimas

iš PKM2 baltymų ekspresija skrandžio vėžio ląstelių linijų BGC823, SGC7901 ir AGS buvo įvertintas naudojant Vakarų dėmė analizė. Šios ląstelių linijos parodė aukšto lygio PKM2 išraiška. Tada stabilios skrandžio vėžio ląstelių linijas su pakitusiu PKM2 išraiška buvo nustatytas RNR interferencijos (PKM2 triuškinantis) Atsižvelgiant BGC823, SGC7901 ir AGS ląsteles. Kaip parodyta Fig. 1A, buvo nustatyti BGC823, SGC7901 ir AGS ląstelių linijos su PKM2 triuškinantis. Mes nustatėme, kad proliferacija sumažėjo per BGC823 ir AGS ląstelių po PKM2 buvo išeikvoti (1B pav.). Šie rezultatai sutampa su ankstesnių tyrimų.

Jei išnagrinėti PKM2 poveikį ląstelių migracijos ir invazija, mes darbuotojai, nusistovėjęs žaizdų gijimo ir transwell tyrimai apibūdinti ląstelių judrumą atsakymo BGC823 ir SGC7901 ląstelių , Susiliejantis sluoksnis ląstelių pirmą kartą buvo inkubuojami per naktį terpėje, įbrėžimams žaizda buvo įvesta, terpėje, turinčioje tinkamiausią dozę EGF (100 ng /ml) buvo įtraukta į skatinti migracijos ir buvo stebima žaizdos sandarinimo procentinė dalis po 24 h ( S1 paveiksle). Invazija ląstelės buvo kiekybiškai 36 h po to, EGF (100 ng /ml) buvo įtraukta į apatinę kamerą. Rezultatai rodo, kad BGC823-sipk ir SGC7901-sipk ląstelių su EGF šių įbrėžimams žaizdos ir į transwell gydymas žymiai padidino žaizdų gijimą norma (1 pav. C, D) ir invazija (1 pav. E, F) palyginti su kontrolinių ląstelių.

išeikvojimas PKM2 Sumažėjęs El cad išraiška ir Glaudesnis EGF /EGFR Pasroviui signalo perdavimo kelių PLC-γ1 ir veiklos ERK1 /2

Jei ištirti mechanizmas pokyčius ląstelių migracijos ir invazijos po to, kai PKM2 triuškinantis, mes išanalizavo narių Ca išraišką ^{2 + -dependent ląstelių adhezijos molekulės šeimos ir metaloproteinazes. Mes nustatėme, kad El-cad baltymo ekspresija koncentracija sumažėjo BGC823 ir SGC7901 ląstelės, kai PKM2 išraiška buvo sumažintas (pav 2A.).}

E-cad mRNR lygis ir E-cad fosforilinimas buvo nustatyti BGC823 ir SGC7901 ląstelių PKM2 išeikvojimo įvertinti, ar pastebėtas skirtumas E-cad išraiškos įvyko prieš arba po translationally. Mes pastebėtas žemyn reguliavimą E-cad mRNR ir padidėjusio fosforilinimo, kuri indukuoja E-cad Endocitozė, į PKM2-išeikvoti ląstelių (. 2A pav B). Mes taip pat nustatė, kad raiškos lygis N-cad baltymų buvo išaugo BGC823 ir SGC7901 ląstelių linijų, kai PKM2 buvo išeikvoti (2A pav.).

ląstelių migracija ir invazija yra iš esmės reguliuoja EGFR veiklos. Išanalizuoti, ar EGFR dalyvauja migracijos ir invazijos BGC823 ir SGC7901 ląsteles, šios ląstelės buvo gydomi EGF, kuri jungiasi su EGFR ir aktyvuoja pasroviui signalines kelius. EGF gydymas lėmė dėl EGFR fosforilinimo ir vėliau aktyvavimo PLCγ1, AKT ir ERK1 /2 keliai (pav. 2C). Mes nustatėme, kad PLC γ1 turėjo aukštesnio lygio aktyvumo PKM2-išeikvoti ląstelių nei JT-išeikvoti ląstelių po arba trumpą ar ilgą (24 h) inkubacijos su EGF. Tačiau nebuvo ryškus skirtumas AKT veiklos tarp PKM2-išeikvoti ląstelių ir JT nusodrintojo ląsteles. PLCγ yra pagrindinis reguliatorius ląstelių migracijos pasroviui RTK signalo [11]. Fosforilinimo nuo tirozino liekanos 783 iš PLCγ1 yra labai svarbus jo aktyvavimą [12]. PLCγ1 aktyvacijos sustiprintas ląstelių judrumą ir šis poveikis buvo pastebėtas žaizda įbrėžimams ir transwell tyrimus, kaip tai pažymėjo pav. 1C.

Kitas tyrė EGFR ligando poveikį nuo MMP naudojant RT-PCR BGC823-sipk ir SGC7901-sipk ląstelių, lyginant su jų atitinkamų kontrolinių ląstelių išraiška. Gydymas su EGFR ligando, EGF, sustiprino MMP raišką tuo transkripcijos lygio BGC823 ir SGC7901 ląsteles. Tačiau nebuvo jokių akivaizdžių skirtumų raiškos lygių MMP2 ir MMP9 tarp PKM2-išeikvoti ląstelių ir jų kontrolės ląstelių (duomenys neparodyti). MMP7 išraiška buvo iki-reguliuojami PKM2-išeikvoti ląstelių su EGF gydymo (pav. 2d). Į ERK /MAPK keliai žaisti kritinių vaidmenis EGFR ligandų sukeltos MMP7 išraiška. Be to, akivaizdus padidėjimas ERK1 /2 veikla buvo pastebėta po 0 h ir 24 h gydymo EGF PKM2-išeikvoti ląsteles.

išeikvojimas PKM2 susilpnintų iš AGS ląstelių judrumą bei po Gelbėjimas PKM2 funkcinė keitimai skrandžio vėžio ląstelių linijas

Elektroninės cad baltymų skrandžio vėžio ląstelių linijų BGC823, SGC7901 ir AGS išraiška buvo įvertintas Vakarų blot analizė. Į BGC823 ir SGC7901 ląstelių linijos išreikšti E-cad. Priešingai, AGS ląstelių stoka El cad išraišką (3A pav.).

Jei išnagrinėti PKM2 triuškinantis poveikį ląstelių migracijos ir invazijos AGS ląstelių, mes darbuotojai, nusistovėjęs žaizdų gijimas ir transwell tyrimai iki apibūdinti ląstelių judrumą. Susiliejantis sluoksnis ląstelių pirmą kartą buvo inkubuojami per naktį terpėje, žaizda įbrėžimams buvo įvesta, terpę, turinčią EGF (100 ng /ml) buvo įtraukta į skatinti migracijos ir buvo stebima žaizdos sandarinimo procentinė dalis po 24 h. Invazija ląstelės transwell tyrimo buvo kiekybiškai 24 h po to, EGF (100 ng /ml) buvo įtraukta į apatinę kamerą. Mūsų nuostabai, mes nustatėme, kad iš AGS-sipk ląstelių gydymas su EGF po žaizdos nulio ir į transwell žaizdos sandarinimo ir invazijos normą pastebimai sumažėjo, palyginti su kontrolinių ląstelių (pav. 3B, C). Nebuvo įtartini skirtumai tarp BGC823 /SGC7901 ir AGS ląsteles.

Jei toliau iliustruoja PKM2 vaidmenį ląstelių judrumui, mes padarė PKM2 gelbėti eksperimentus. Mes taked stabiliai perkeltų metodą naudojant per išraiškos plazmidės vektorius pcDNA6.0-maketas ir pcDNA6.0-PKM2 susidoroti su BGC823 ir AGS ląstelių, kurios stabilios nokdaunas PKM2. P-EGFR, E-cad išraiška buvo parodyta PKM2 gelbėti eksperimentų (pav. 3D). Mes pastebėjo, kad kai PKM2 išraiška atsigavo, EGFR fosforilinimo gerokai sumažintas BGC823 ląsteles ir padidėjo AGS ląsteles. Be to, ląstelių judrumas iš BGC823 ląstelių sumažėjo ir AGS ląstelės buvo atmestas po PKM2 gelbėti (3e pav.). Paaiškinti šiuos skirtumus mechanizmą, mes tada analizavo "EGF /EGFR signalinio kelio aktyvumą.

PKM2 Glaudesnis EGF /EGFR Pasroviui Signalizacijos kelius AGS ląstelių veiklą ir koreliavo su ERK aktyvumas skrandžio Vėžys Mėginiai

Jei išanalizuoti, ar EGFR gali būti įtraukti į migraciją ir invazijos į AGS ląsteles, šios ląstelės buvo gydomi EGF, kuri jungiasi su EGFR ir aktyvuoja pasroviui signalines kelius. "EGF gydymas lėmė dėl EGFR fosforilinimo ir vėliau aktyvavimo tolesniems EGFR kelius, įskaitant PLCγ1 ir ERK1 /2 keliai (pav. 4A). Mes nustatėme, kad PLCγ1 ir ERK1 /2 veikla buvo didesnis ląsteles, kur PKM2 nebuvo išeikvoti negu PKM2-išeikvoti ląstelių po arba trumpą ar ilgą (24 h) inkubacijos su EGF. Šis rezultatas yra tai, kas buvo pastebėta su BGC823 ir SGC7901 ląstelių priešais; į AGS ląsteles, PKM2 atėjo į žaidimą kaip stimulas ir skatinama ląstelių migraciją ir invazija. Mes šalia ištirti MMP7 išraišką naudojant RT-PCR AGS-sipk ląstelių ir kontrolės ląstelių. Gydymas EGF sustiprintas MMP7 išraiškos prie transkripcijos į AGS-pu6 ląstelių lygyje, bet ne AGS-sipk ląstelių (pav. 4b). Iš ERK1 /2 veikla buvo akivaizdžiai didesnis AGS-pu6 ląstelių, lyginant su AGS-sipk ląstelių po 0 h ir 24 h gydymo EGF (. 4A pav).

Kitas atliekamas imunohistocheminis (IHC) analizes išnagrinėti El cad išraišką, PKM2 lokalizavimą ir ERK1 /2 fosforilinimo serijos skyriuose 15 žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių, naudojant antikūnus su patvirtintomis ypatumus. 4C paveiksle matyti, kad e-cad išraiškos, ERK1 /2 fosforilinimo ir citoplazmos PKM2 išraiškos lygis buvo susijęs su kitu. Be to, mes nustatėme, aukšto lygio ERK1 /2 fosforilinimo į vėžinių ląstelių branduolio be E-cad išraiška. Tose srityse, ERK1 /2 fosforilinimo, mes taip pat nustatė aukštesnius lygius PKM2 išraiška. Tačiau, mes ne rasti ERK1 /2 fosforilinimo srityse teigiamų E-cad išraiškos (4c pav.). Koreliacijos tarp PKM2, E-cad ir P-ERK1 /2 analizė buvo atliekama naudojant vaizdo Pro Plus programinė įranga (Pav. 4d). Vidutinis tankis (DAP /sritis) buvo užfiksuotas įvairių teigiamų srityse 15 žmogaus skrandžio vėžio egzempliorių. Mes nustatėme reikšmingą koreliaciją tarp PKM2 ir E-cad E-cad-teigiamas srityse. Be to, ten buvo reikšminga koreliacija tarp PKM2 ir p-ERK1 /2 E-cad-neigiamas srityse.

Diskusijos

invazinės ir metastazavusiu vėžio progresavimo stadija yra susijęs su prasta klinikinės prognozės ir atstovauja labiausiai didžiulis barjeras sėkmingai gydyti. Mobilusis judrumas ir invaziškumo yra lemiantys piktybinių navikų, kurie leidžia navikines ląsteles migruoti į gretimuose audiniuose arba sumažinus rūsio membranas ir ekstraceliuliniu matricas. Ląstelių judrumas yra reikalingas fiziologinių procesų žaizdų gijimui ir organogenezės metu, bei už patologiniam procesui naviko invazijos [13]. Invaziniai naviko ląstelės yra būdingas dysregulated ląstelių judrumui reaguojant į ekstraląstelinio signalus iš augimo faktoriais ir citokinais. Žmogaus navikai išreikšti aukšto lygio augimo faktorių ir jų receptoriai, ir daugelio tipų piktybinių ląstelių atsiranda eksponuoti autocrine- arba paracrine-skatino augimą. Tarp labiausiai gerai-tirtų augimo faktoriaus receptoriaus sistemų yra EGF receptoriaus šeimos [14]. Signalai iš tarpląstelinio aplinkoje diktuoti ląstelių judrumą. Daugelis augimo faktoriai, įskaitant ligandų, kurie veikia per epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR), didinti ląstelių judrumą [15]. Bent du skirtingi viduląstelinių signalų keliai reikalingi EGFR tarpininkaujant ląstelių judrumui: į kelius panaudojant PLC gama ir žemėlapyje kinazės kelią. PLV γ aktyvumas buvo pasiūlyta sustiprinti ląstelių judrumą per aktino-pakeisti baltymų mobilizacijos nuo neaktyvios membrana susijusių lokalizacija aktyvaus sub-membrana Citoskeletas locale [16]. Į ERK MAP kinazės perduoti signalus į branduolį, taip pat signalus, kurie reguliuoja ląstelių matricos jungtis.

Cadherins sudaro didelę šeimą mobilųjį ląstelių adhezijos molekulių, kurios apima klasikinę, desmosomal ir netipinių cadherins. E-cad, kuris yra išreikštas visų pirma epitelinių ląstelių, yra adhezinė baltymas, kuris yra koduojama CDH1 geno ir funkcijų keliomis procesų, įskaitant vystymosi, audinių vientisumą, ląstelių migracija, morfologija, ir poliškumo [17], [18], [19]. El cad taip pat yra naviko slopintuvas, kurio išraiška yra dažnai sumažinamas arba nutildyti, o jos naujo išraiška gali sukelti morfologinius sugrįžta [20], [21]. EGF-priklauso nuo aktyvavimo EGFR buvo pranešė, kurios turi būti inhibuojamos į E-cad sukibimo-priklausomu būdu, kuris slopina ligando-priklauso aktyvavimą įvairių receptoriaus tirozino kinazės. N-cad, kaip invazijos promotoriaus, dažnai aktyvinama. N-cad išraiška epitelio ląstelių skatina pokyčius morfologijos iki fibroblastų fenotipo, padaryti ląstelės daugiau judrių ir invazinės. Naujausi tyrimai rodo, kad vėžio ląstelės turi iki reguliuojama N-cad papildomai prie E-cad praradimo. Tai cad raiškos kaitos vadinamas "cad jungiklis".

pastebėjo žemyn reguliavimą E-cad mRNR ir padidėjusio fosforilinimo, kuri indukuoja E-cad Endocitozė, į PKM2-išeikvoti ląsteles. Mes taip pat nustatė, kad N-cad baltymų ekspresijos lygis padidėjo BGC823 ląstelių linijos, kai PKM2 buvo išeikvoti. Iš PKM2 nokdaunas skatinamas ląstelių migraciją ir invazija į BGC823 ir SGC7901 ląsteles EGF stimuliacijos. Padidėjęs aktyvumas EGFR yra lemiamas veiksnys nustatant ląstelių judrumą ir invaziškumo iš BGC823 ir SGC7901 ląsteles. Mes iškėlė hipotezę, kad žemyn reguliavimas E-cad išraiškos sustiprino EGFR fosforilinimo ir aktyvuota tolesnius signalines kelius, kurie apima PLCγ1 ir ERK1 /2. PLV γ aktyvacijos pagerina ląstelių judrumą ir ERK1 /2 veikla vaidina lemiamą vaidmenį MMP7 išraiška.

Matrix metaloproteinazes (MMPs) buvo susijęs vėžio invazijos ir metastazių, nes jų tarpląsteliniame (ECM) -proteolytic veikla [22]. MMP-7 buvo pranešė, kad pateikti pagal skrandžio karcinoma ląstelių ir yra reikšmingai susijęs su agresyvių patologinių fenotipų skrandžio vėžio [23]. MMP-7 gali aktyvuoti PRO-MMP-1, turi stiprų stromelizino panašūs veiklą ir pablogina netirpių elastino, IV tipo kolageno, lamininas-1, fibronektiną, proteoglikanų ir želatinos [24]. Į ERK /MAPK keliai žaisti kritinių vaidmenis EGF sukeltas MMP7 išraiška [25].

El cad yra ląstelių sukibimą glikoproteinas būdingas pirmą kartą žmogaus ląstelių linijų Shimoyama et al [26]. Jos vaidmuo skrandžio vėžio išsivystymo pirmą kartą buvo apibrėžta Guilford et al [27]. Yra reikšminga koreliacija tarp E-cad išraiškos laipsnį ir naviko diferenciacijos laipsnio, taip pat histologinis tipas, atsižvelgiant į LAUREN ir PSO klasifikaciją. Pacientai, sergantys El cad-teigiamas navikai žymiai geresnius 3 ir 5 metų išgyvenimo negu pacientams, kuriems El cad-neigiamas navikų [28]. Paveldima difuzinis skrandžio vėžys (HDGC) yra retas autosominiu dominuojanti sindromas, kuris iš esmės yra priskirtini gemalo mutacijų ir trynimų į CDH1 geno, susijusio su išankstinio pradžios, histologiškai difuzinis, antspaudo žiedas ląstelių tipas skrandžio vėžio [29], [30].

Lim JY kt pranešė, kad PKM2 išraiška buvo stipriai koreliuoja su skrandžio vėžio diferenciacijos. Diferencijuoti rūšių vėžio išreikšti daugiau PKM2 baltymų nei nediferencijuotose tipų; priešingai, didesnis PKM2 išraiška koreliuoja su trumpesniu Bendras išgyvenamumas nepriklausomai nuo etapo antspaudo žiedus ląstelių vėžio. PKM2 išraiška gali būti neigiamas prognostinis faktorius antspaudo žiedus ląstelių karcinomos, kurie neturi E-cad [7]. Šie rezultatai atitinka mūsų tyrimų skrandžio vėžio ląsteles. BGC-823, SGC-7901 ir AGS ląstelių linijos yra kitaip diferencijuoti tipų. El cad išraiška egzistuoja Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ir BGC-823 ląstelių linijų; Priešingai, AGS ląstelės buvo kilęs iš piktybinio skrandžio adenokarcinoma audinio ir trūksta El cad tarpininkaujant ląstelių sukibimą [31]. Mes pastebėjo, kad PKM2 nokdaunas skatinama migracijos ir invazija į SGC-7901 ir BGC-823 ląstelių linijas, tačiau slopino šias savybes į AGS ląstelių linija. Kita grupė pranešė, kad piruvato kinazės tipas P2 yra aktyvinama į gaubtinės žarnos vėžio, o PKM2 nokdaunas slopino platinimu ir migracijos gaubtinės žarnos vėžio RKO ląstelių [32]. Mes žinome, kad RKO ląstelės trūksta E-cad [33] išraiška. Imunohistocheminis (IHC) analizė rodo, kad e-cad išraiškos, ERK1 /2 fosforilinimo ir citoplazmos PKM2 išraiškos lygis buvo susijęs su kitu. Mes nustatėme, aukšto lygio ERK1 /2 fosforilinimo vėžio ląstelių branduoliuose be El-cad išraiška, bet su aukšto lygio PKM2 išraiška.

hipotezę, kad PKM2 slopina ląstelių judrumą ir invazija, kai El-cad yra pateikti. Šis romanas funkcija PKM2 gali vaidinti tam tikrą vaidmenį grįžtamojo slopinimo ląstelių judrumui ir invazijos į ankstyvosiose stadijose skrandžio vėžio, kai ląstelės yra teigiamas E-cad išraiška. Per naviko progresavimo, iš nebuvimas ar labai maža išraiška E-cad skatina agresyvų funkciją PKM2 į naviko. toliau turi būti išaiškinta biologinė vaidmuo PKM2 į šių navikų vystymosi.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle. Viesbutis The iš EGFR baltymų ekspresija skrandžio vėžio ląstelių linijų BGC823, SGC7901 ir AGS buvo įvertintas naudojant Vakarų dėmė analizė. AGS ląstelės parodė, aukštesnio lygio EAFR nei kitų dviejų ląstelių linijų. Nėra esminio skirtumo tarp BGC823 ir SGC7901 ląstelių (S1A pav). BGC-pu6 ląstelės ir BGC-sipk ląstelės buvo gydomi įvairių dozių EGF. Po 40 minučių mes nustatėme, kad fosforilinimo lygis EGFR. Mes nustatėme, aukščiausio lygio fosforilinimo į 100ng /ml (S1B paveikslas) dozę. Todėl mes nusprendėme, kad 100ng /ml dozę kaip tinkamiausią kandidatą. Transwell eksperimentas taip pat parodė, stipresnį įsiskverbimą į martrigel į BGC823 ląstelių (S1C paveikslas)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF)

• PLoS ONE: genetiniai variantai epidermio augimo faktoriaus receptoriaus kelią genų ir rizikos stemplės suragėjusių ląstelių karcinoma ir skrandžio vėžio kinų Population
• PLoS ONE: maža molekulė R1498 kaip gerai toleruojamas ir veiklus išgertas kinazės inhibitorius už kepenų vėžio ir skrandžio vėžiui gydyti per Nukreipimas Angiogenezė o mitozės Pathways