PLoS One: piruvát-kináz M2 kettős szerepe a rendelet az EGF /EGFR jelátvi- E-Cadherint-függő módon a gyomorrák sejtek

absztrakt katalógusa

Háttér és célkitűzések katalógusa

EGFR aktiváló és PKM2 kifejezés használatára a tumorogenezisben. EGFR aktiválását szabályozza PKM2 funkciókat szubcelluláris rekesz-függő módon és elősegíti gén transzkripcióját és a tumor növekedését. Ezen túlmenően, PKM2 felülszabályozott EGFR-indukált útjainak glioma rosszindulatú betegségekben. Ugyanakkor azt találtuk, hogy PKM2 is szabályozza a tevékenységét az EGF /EGFR jelátviteli mechanizmus gyomor rákos sejtekben. Célunk az volt, hogy meghatározza a biológiai mechanizmusok PKM2 szabályozásában sejtek mozgékonyságát és inváziós. Katalógusa

Módszerek

alkalmazott stabil transz rövid hajtű RNS stabilan elhallgattassa a kifejezés PKM2 a BGC823, SGC7901 és AGS gyomorrák sejtvonalakon. A hatások a PKM2 in vitro határoztuk meg értékelésekor a sejtmigráció és invázió. Az immunhisztokémiai analízis segítségével tárja fel a kapcsolatot között PKM2 és más fehérjék. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Eredményeink azt mutatják, hogy a kiütése PKM2 csökkentette az aktivitást az E-cadherin és a fokozott EGF /EGFR jelátviteli a gyomor sejtvonalak BGC823 és SGC7901 hogy pozitív volt az E-cadherin expresszió. Azonban a differenciálatlan gyomor karcinóma sejtvonal AGS, amely nélkülözi az E-cadherin expresszió PKM2 mozdítani sejt migrációt és inváziót. Immunhisztokémiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a szintek az E-cadherin expresszió, ERK1 /2 foszforiláció, és citoplazmatikus PKM2 expresszió korrelációban állnak egymással.

Következtetés:

PKM2 játszhat különböző szerepeket különbözőképpen differenciált gyomor rákos sejttípus, és ez a megállapítás összhangban lenne a korábbi klinikai kutatások. A vizsgálati eredmények azt mutatják fontos kapocs PKM2 és E-cadherin alatt EGFR-stimulált gyomorrák sejtek mozgékonyságát és inváziós. Katalógusa

Citation: Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) piruvát kináz M2 kettős szerepe a rendelet az EGF /EGFR jelátvi- E-Cadherint-függő módon a gyomorrák sejtek. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542 katalógusa

Szerkesztő: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japán katalógusa

Beérkezett: február 7, 2013; Elfogadva: 20. május 2013; Megjelent: június 28, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 30971362, 81072013 & 91229201), Fundamental Research alapok a közép egyetemek Kínában (No. 2010111082) és az egészségügyi Minisztérium Alapítvány állam legfontosabb Klinikai Tanszék. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

piruvát kináz (PK) közvetíti a végső sebességmeghatározó lépés a glikolízis által katalizálja defoszforilációja a foszfo (PEP) a piruvát, így egy molekula ATP. Emlős sejtek négy piruvát-kináz izoenzimek (M1, M2, L és R), melyek szelektíven expresszálódik a különböző típusú sejtek és szövetek [1]. Emlősökben az M1 izoforma (PKM1) van kifejezve a legtöbb felnőtt szövetekben. Az M2 izoforma (PKM2), egy alternatív összekapcsolódás variánsa M1, expresszálódik az embrionális fejlődés során [2]. A vizsgálatok azt találták, hogy a rákos sejtek kizárólag kifejezni PKM2 [3], [4]. PKM2 kimutatták, hogy esszenciális az aerob glikolízis daganatok (Warburg hatás). Az évek során a jelentős fejlesztések történtek megértésében a funkció és szabályozás PKM2 mint egy piruvát-kináz és protein kináz a rákos sejtekben [5]. Egy nemrégiben készült tanulmány megerősítette, hogy a PKM2 által kiváltott epidermális növekedési faktor (EGF) transzlokálódik a sejtmagba glioblasztóma sejtek, kölcsönhatásba lép a β-catenin és vezet a cyclinD1 expresszióját, amely elősegíti a sejtek szaporodását és a tumorgenezis [6]. Ezek az eredmények azt igazolták új szerepet PKM2 transzkripciós koaktivátor. Azonban vannak bizonyos ellentmondások kapcsolatos sajátosságait és potenciálját PKM2 mint egy anti-rák cél a rákterápiában. Egy nemrégiben megállapítása során kiderült, hogy PKM2 kifejezés erősen korrelál gyomorrák differenciálás. Differenciált ráktípusok expressz több PKM2 fehérjét tartalmaz, mint ezt a differenciálatlan is. PKM2 volt rossz prognosztikai faktor pecsétgyűrű sejtes gyomorrák [7]. A biológiai szerepe PKM2 különböző differenciálódás fázisok és a fejlesztés a gyomorrák tovább kell tisztázott.

A korábbi vizsgálatok tekintetében PKM2 összpontosítottak tumor anyagcsere és a tumor növekedését. Voltak csak néhány jelentéseket tumor áttétek. E-cadherin kritikus szerepet játszik fenntartásában epithelialis integritás, és a veszteség az E-cadherin befolyásolja a ragasztó repertoár egy sejt [8]. Korábbi tanulmányok [9] in vitro kimutatták, hogy a veszteség az E-cadherin humán karcinóma sejtvonalakban társul gyenge differenciálódás és egy fibroblasztoid sejtek morfológiáját. Az EGF-függő aktiválása az EGFR leírták, hogy gátolja az E-cadherin adhézió-függő módon, amely gátolja a ligandum-dependens aktiválását különböző receptor tirozin-kinázok [10]. A kutatások kimutatták, hogy a kiütése PKM2 csökkentette az aktivitást az E-cadherin és fokozott az EGF /EGFR jelátviteli útvonal a sejtvonalakban BGC823 és SGC7901 hogy pozitív volt az E-cadherin expresszió. Azonban a differenciálatlan gyomor karcinóma sejtvonal AGS, amely nélkülözi az E-cadherin expresszió PKM2 mozdítani sejt migrációt és inváziót. A vizsgálat célja az volt, hogy feltárja a funkció és mechanizmusa PKM2 tekintetében sejtmozgás eltérő differenciált sejtvonalak. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture, feltételek és Transzfekció katalógusa

az emberi gyomor rákos sejtvonalak BGC823 (rosszul differenciált szerint a szolgáltató) és SGC7901 (mérsékelten differenciált) tenyésztettünk RPMI 1640 tápközegben (Hyclone, Logan, UT, USA). Az AGS sejtvonal (differenciálatlan) tenyésztünk F12K közegben. Minden sejteket tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) és 100 NE /ml penicillin-sztreptomicin, 37 ° C-on, 5% CO _{2 nedvesített atmoszférában. Az emberi gyomor rákos sejtvonalat AGS rendelték az American Type Culture Collection (ATCC, USA), és a humán gyomor rákos sejtvonal SGC7901 és BGC823 kaptuk Kínából Központ Type Culture Collection (Shanghai, Kína). SGC7901, BGC823 és AGS sejteket transzfektáltunk a siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2), vagy a PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plazmid FuGENE HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromicinnel (0,1 ng /ml) használtunk szűrésére stabilan transzfektált klónok. A kifejezés a PKM2 fehérje vizsgáltuk Western-blot analízissel elleni antitest alkalmazásával PKM2, hogy érvényesítse a képességét, a konstrukciók, hogy gátolja a megcélzott gén expresszióját; Ezekben a kísérletekben háromszor megismételtük. Sejttenyészetek készült nyugalmi által egyre őket összefolyásig, és a táptalajt friss közeggel helyettesítjük, amely 0,5% szérumot 1 napig. EGF 100 ng /ml végső koncentráció használtunk sejt stimuláció. EGF kaptuk a Cell Signaling Technology.}

Stabil kiütése PKM2 és a túlzott expressziója PKM2

Egy plazmidot tartalmazó RNS-interferencia-szekvenciát, hogy a célzott a PKM2 gén BGC823, SGC7901 és AGS sejtek épített. A szensz oligo a siPKM2 szekvencia 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', és az antiszensz oligo volt 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. A BGC-823, SGC-7901 és AGS sejteket transzfektáltunk pcPUR + U6-siPKM2 vagy pcPUR + U6-siRenilla (kontroll), és a kiválasztott, mint puromicin-rezisztens klónok. Western-blot analízist végeztünk, hogy erősítse meg a PKM2 elnyomás. Egy plazmidot tartalmazó PKM2 cDNS-szekvenciát kaptuk az Invitrogen. A BGC-823, SGC-7901 és AGS sejteket transzfektáltunk pcDNA6.0-PKM2 vagy pcDNA6.0-mock (kontroll), és a kiválasztott, mint blaszticidin-rezisztens klónok. Western-blot analízist végeztünk, hogy erősítse meg a PKM2 kifejezést.

Protein Extraction és Western blot analízissel

sejteket újra szuszpendáljuk lízis-pufferben tartalmazó proteázinhibitor-koktél, és az extrahált fehérjék alkalmazásával elkülönítettük 8-10% -os SDS-PAGE géleken. P-tubulin használtunk terhelési kontrollként. Elleni antitestek E-kadherin és p-E-cadherin kaptuk Epitomics. A foszfor-EGFR (Tyr1068), foszfor-PLCγ1 (Tyr783), foszfor-AKT (Ser473), foszfor-Gab1 (Tyr627), foszfor-c-kobalamin (Tyr700) és foszforilált ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) antitestek kaptuk a Cell Signaling Technology.

RNS kivonás, reverz transzkripció és a valós idejű PCR

Teljes RNS-t extraháltunk a TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA). A mintákat ezután DN-áz 15 percig szobahőmérsékleten keverjük, és az RNS-t tovább tisztítottuk egy RNS Cleanup készlet (Qiagen, CA, USA). A reverz transzkripció (RT) reakciót az első szál cDNS szintézisét végeztük reverz transzkriptáz alkalmazásával (Bio-Rad), 2 ug össz-RNS-t. Kvantitatív RT-PCR-analízist végeztünk az ABI 7500 (Applied Biosystems), és a gén expressziós szintek minden egyes egyedi minta normalizáltuk GAPDH. Az átlagos relatív génexpresszió meghatároztuk és különbségeket kiszámítottuk a 2 ^{-ΔΔCt módszer agaróz gél elektroforézissel. Az RT-PCR-primer szekvenciák a következők voltak: szensz 5'TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'és antiszensz 5'GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' N-cadherin; értelemben, 5'CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'és antiszensz 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' az E-cadherin; értelemben, 5'TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'és antiszensz 5'GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' az MMP7; értelemben, 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'és antiszensz 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' GAPDH.}

Cell Proliferation Assay

A sejtproliferációt mértük a sejtszámlálás Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki Gun, Kumamoto, Japán) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Röviden, a sejteket szélesztettünk négy 96 lyukú lapokra, a sejtsűrűség 2 × 10 ^{3 sejt /lyuk. Egy lemezt kivettük ugyanabban az időben minden nap után a sejtek tapadt a lyukakba. Az abszorbanciát mérjük mikrolemez-leolvasóval hullámhosszon 450 nm-en. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztük.}

Transwell invázió és sebgyógyulás Assay

transwell inváziós vizsgálati eljárást végeztünk 8,0-um pórusú lapkák egy 24-lyukú transwell lemez. Az alapmembrán hidratáljuk 500 ul szérummentes RPMI 1640 vagy F12K táptalaj 30 percig a felhasználás előtt. Az inváziós vizsgálati eljárás, a gyomor rákos sejtvonalak adtunk a felső kamrába a Transwell 0,5 mg /ml-es típusú kollagén L (BD Bioscience, San Jose, CA) bevont szűrőket. RPMI 1640 vagy F12K táptalaj, 10% magzati borjúszérummal és 1% az egyes antibiotikum oldatot adtunk az alsó kamrába. A BGC és 7901 sejteket inkubáltunk 36 órán át. Az AGS sejteket 24 órán keresztül inkubáltuk. A betörő sejtek mennyiségét után enciánibolya festés. Mindegyik kísérletet három ismétléssel végeztük, és az adatokat az átlag értékeket. A sebgyógyító assay-t 6 lyukú lemezeken. A tumorsejteket tartalmazó közegben 10% FBS-t oltottunk 6 mérőhelyes lemezekre (Corning, CA). Sejttenyészetek készült nyugalmi által egyre őket összefolyásig, és a táptalajt friss közeggel helyettesítjük, amely 0,5% szérumot 1 napig. Sebek az egyrétegű készült steril pipetta hegyeket. Ezután EGF 100 ng /ml végső koncentráció használtunk sejt stimuláció. A sejteket ezután PBS-sel mostuk, és felfrissítettük közegben, amely 10% FBS-t. Fényképeket készítettünk a 0 és 24 óra. Minden kísérletet három példányban. Katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Ez a tanulmány által jóváhagyott Etikai Bizottsága (No: 20081012), a Zhongshan Kórház kapcsolatban Xiamen University, Xiamen, Fujian tartomány, Kína, és kaptunk írásos beleegyezése nyilatkozatokat minden résztvevő részt vesz ebben a vizsgálatban. katalógusa

Előkészítő szövetminta katalógusa

a daganatos szövetet gyűjtöttünk 15 különböző gyomorrák átesett betegek kuratív rezekció a Zhongshan Kórház, Xiamen Egyetem, Xiamen, Kína. Egy független sor megfelelő szomszédos jóindulatú szöveteket 15 az azonos beteg összegyűjtöttük ugyanabban az időben. Minden szövet mintákat összegyűjtöttük, és két részre oszlik után azonnal tumorreszekcióra. Az egyik részt összegyűjtöttük folyékony nitrogénbe, és -80 ° C-on, amíg az RNS és a fehérje kitermelése. A másik részét rögzítettük 4% -os formaldehidben, és paraffinba ágyaztuk a szövettani elemzéshez (hematoxilin-eozin és IHC festés). Minden mintát is megerősítette patológiai diagnózis (kórszövettani diagnózis alapján a WHO-kritériumok). Minden kísérleti esetek csoportosították accord-nek a Nemzetközi Rákellenes Unió Tumor-Node-metasztázis (TNM) staging rendszer (2002-ben módosított). Katalógusa

Az immunhisztokémiai katalógusa

Négy mikron vastag paraffinos metszeteket voltak vagy megfestjük hematoxilinnel és eozinnal (H &E), vagy analizáltuk PKM2, p-ERK1 /2 és E-cadherin expresszió immunhisztokémiai. Immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk, eljárásoknak megfelelően, amelyeket a gyártó által ajánlott. A reakciókat láthatóvá használva diaminobenzidin mint egy kromogén szubsztrát. A metszeteket kontrasztfestést haematoxylin, majd eltávolították, és felszerelni. Az átlagos sűrűséget (IOD /terület) volt kimutatható különböző pozitív területeken a 15 emberi gyomorrák mintákat használva Image-Pro Plus szoftvert.

Statisztikai elemzések

Statisztikai elemzéseket végeztünk SPSS v13. 0 (SPSS Inc.) szoftver. Az Independent-Samples T Test és korrelációs elemzés használtunk az adatok összehasonlítása. Minden érték kifejezve a átlag ± SD. A különbségek statisztikailag szignifikánsnak tekintettük át P katalógusa < 0,05. Katalógusa

Eredmények katalógusa

kiürülése PKM2 promotált-migráció és inváziót BGC823 és SGC7901 sejteket EGF stimulálás katalógusa

a kifejezés a PKM2 fehérje a gyomor rákos sejtvonalak BGC823, SGC7901 és AGS alkalmazásával értékeltük Western blot analízissel. Ezek a sejtvonalak mutattak a magas szintű PKM2 kifejezés. Ezután stabil gyomorrák sejtvonalak megváltozott PKM2 kifejezés alakult RNS interferencia (PKM2 kiütése) a BGC823, SGC7901 és AGS sejteket. Ábrán látható. 1A, a BGC823, SGC7901 és AGS sejtvonalak PKM2 knockdown jöttek létre. Megfigyeltük, hogy a proliferáció csökkent a BGC823 és AGS sejteken PKM2 lecsökkentettük (ábra. 1B). Ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi tanulmányok. Katalógusa

hatásának vizsgálata PKM2 sejtvándorlásra és invázió, mi foglalkoztatott jól bevált sebgyógyulás és transzwell esszék jellemzésére sejtek mozgékonyságát választ a BGC823 és SGC7901 sejtek . A konfluens réteget sejtek először egy éjszakán át inkubáltuk a médiumban, egy karcolás seb került bevezetésre, tartalmazó közegben a legmegfelelőbb dózist az EGF (100 ng /ml) adtunk hozzá, hogy ösztönözze a migráció, és a százalékos seb tömítés volt megfigyelhető 24 h után ( ábra S1). A betörő sejteket mennyiségileg 36 óra után EGF (100 ng /ml) adtunk az alsó kamrába. Az eredmények azt mutatják, hogy a kezelés a BGC823-sipk és SGC7901-sipk sejteket EGF következő egy karcolás sebet, és a transwell jelentősen növelte az arány a sebgyógyulás (1. C, D) és invázió (ábra. 1 E, F) összehasonlítva a kontroll sejtek. katalógusa

kiürülése PKM2 Csökkent E-cadherin Enhanced a tevékenységek az EGF /EGFR jelátviteli utak PLC-γ1 és ERK1 /2

• PLoS One: genetikai variánsok az epidermális növekedési faktor receptor útvonal Gének és a kockázat az nyelőcső laphámrák és a gyomorrák a kínai Population
• PLoS One: kis molekula R1498 egy jól tolerált és orálisan aktív kináz inhibitor a hepatocelluláris karcinóma és a gyomorrák kezelése révén célzás Az angiogenezis és Mitosis Pathways