PLoS ONE: pyruvatkinase M2 Afspiller en dobbeltrolle på forordning af EGF /EGFR signalering via E-Cadherin-afhængig måde i Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund og Formål

EGFR aktivering og PKM2 udtryk er medvirkende til at tumorigenese. EGFR aktivering regulerer PKM2 funktioner i et subcellulært afsnit-afhængig måde og fremmer gentransskription og tumorvækst. Desuden er PKM2 opreguleret i EGFR-inducerede veje i gliom maligniteter. Vi fandt imidlertid, at PKM2 også kunne regulere aktiviteten af ​​EGF /EGFR signalvejen i gastriske kræftceller. Vi havde til formål at definere de biologiske mekanismer for PKM2 i reguleringen af ​​celle motilitet og invasion.

Metoder

Vi ansat stabil transfektion med kort hårnål RNA til stabilt tavshed udtryk for PKM2 i BGC823, SGC7901 og AGS gastrisk cancer cellelinjer. Virkningerne af PKM2 in vitro blev bestemt ved at vurdere cellemigration og invasion. Immunhistokemisk analyse blev anvendt til at undersøge forholdet mellem PKM2 og andre proteiner.

Resultater Salg

Vores resultater viser, at knockdown af PKM2 faldt aktiviteten af ​​E-cadherin og forbedret EGF /EGFR signalvej i mavens cellelinjer BGC823 og SGC7901 der var positive for E-cadherin udtryk. Men i den udifferentierede gastrisk carcinom cellelinje AGS, som mangler E-cadherin ekspression, PKM2 fremmes cellemigration og invasion. Immunohistokemiske analyser viste, at niveauerne af E-cadherin udtryk, ERK1 /2 phosphorylering, og cytoplasmatisk PKM2 udtryk blev korreleret med hinanden

Konklusion:.

PKM2 kan spille forskellige roller i forskelligt differentierede gastrisk kræftcellen typer, og dette fund vil være i overensstemmelse med den tidligere klinisk forskning. Resultaterne af vores undersøgelse afslører et vigtigt bindeled mellem PKM2 og E-cadherin under EGFR-stimuleret mavekræft celle motilitet og invasion

Henvisning:. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) pyruvatkinase M2 Afspiller en dobbeltrolle på forordning af EGF /EGFR signalering via E-Cadherin-afhængig måde i Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: Februar 7, 2013; Accepteret: 20 maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.971.362, 81.072.013 & 91.229.201), grundforskning fondene til de centrale universiteter i Kina (nr 2010111082) og Sundhedsministeriet Foundation for staten Key Klinisk Institut. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pyruvatkinase (PK) medierer den endelige hastighedsbegrænsende trin af glycolyse ved katalysere dephosphorylering af phosphoenolpyruvat (PEP) til pyruvat, hvilket gav et molekyle af ATP. Mammale celler har fire pyruvatkinase isoenzymer (M1, M2, L, og R), som er selektivt udtrykt i forskellige typer af celler og væv [1]. I pattedyr er M1 isoformen (PKM1) udtrykt i de fleste voksne væv. M2 isoform (PKM2), en alternativt splejset variant af M1, udtrykkes under fosterudviklingen [2]. Undersøgelser har vist, at kræftceller udelukkende udtryk PKM2 [3], [4]. PKM2 har vist sig at være afgørende for aerob glycolyse i tumorer (Warburg effekt). I årenes løb har betydelige fremskridt er gjort i forståelsen af ​​funktion og regulering af PKM2 som pyruvat kinase og protein kinase i cancerceller [5]. En nylig undersøgelse bekræftede, at PKM2 induceret af epidermal vækstfaktor (EGF) translokerer i kernen i glioblastomceller, interagerer med β-catenin og fører til cyclinD1 ekspression, som fremmer celleproliferation og tumorigenese [6]. Disse resultater afslører en hidtil ukendt rolle for PKM2 som transkriptions-coaktivator. Der er dog nogle kontroverser angående specificiteten og potentiale PKM2 som target anti-cancer i cancerterapi. En nylig konstatering afslørede, at PKM2 ekspression stærkt korreleret med mavekræft differentiering. Differentierede kræfttyper udtrykker mere PKM2 protein end de udifferentierede dem. PKM2 var en negativ prognostisk faktor i signetring celle mavekræft [7]. behov for biologiske rolle PKM2 i forskellige differentierings- faser og i udviklingen af ​​gastrisk cancer at blive yderligere belyst.

Tidligere undersøgelser vedrørende PKM2 har fokuseret på tumor metabolisme og tumorvækst. Der har kun været et par rapporter om tumor metastase. E-Cadherin spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​epitel- integritet, og tabet af E-cadherin påvirker den klæbende repertoire af en celle [8]. Tidligere undersøgelser [9] in vitro har vist, at tabet af E-cadherin i humane carcinoma-cellelinier er forbundet med dårlig differentiering og en fibroblastoid morfologi. aktivering af EGFR EGF-afhængige er blevet rapporteret at blive inhiberet i en E-cadherin-adhæsion-afhængig måde, som inhiberer ligand-afhængig aktivering af forskellige receptortyrosinkinaser [10]. Vores forskning viste, at knockdown af PKM2 faldt aktiviteten af ​​E-cadherin og forbedret EGF /EGFR signalvejen i cellelinier BGC823 og SGC7901 der var positive for E-cadherin udtryk. Men i den udifferentierede gastrisk carcinom cellelinje AGS, som mangler E-cadherin ekspression, PKM2 fremmes cellemigration og invasion. Formålet med denne undersøgelse var at belyse funktionen og mekanisme PKM2 med hensyn til celle motilitet i forskelligt differentierede cellelinjer.

Materialer og metoder

Cell Culture, Betingelser og transfektion

de humane gastrisk cancer cellelinjer BGC823 (dårligt differentieret, efter tjenesteyderens) og SGC7901 (moderat differentieret) blev dyrket i RPMI 1640-medium (HyClone, Logan, UT, USA). AGS-cellelinie (udifferentierede) blev dyrket i F12K-medium. Alle celler blev dyrket i medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) og 100 IU /mL penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en CO 5% _{2 fugtig atmosfære. Den menneskelige mavekræft cellelinje AGS blev bestilt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA), og de menneskelige mavekræft cellelinjer SGC7901 og BGC823 blev opnået fra Kina Center for Type Culture Collection (Shanghai, Kina). SGC7901, BGC823 og AGS-celler blev transficeret med siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) eller PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plasmid under anvendelse af FuGENE HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromycin (0,1 ug /ml) blev anvendt til at screene for stabilt transficerede kloner. Ekspressionen af ​​PKM2 proteinet blev undersøgt med Western blot-analyse under anvendelse af et antistof mod PKM2 at validere evne konstruktionerne til at inhibere målgenekspression; Disse forsøg blev gentaget tre gange. Cellekulturer blev gjort hvilende ved at dyrke dem til konfluens, og mediet blev erstattet med frisk medium indeholdende 0,5% serum i 1 dag. EGF med 100 ng /ml slutkoncentration blev anvendt til cellestimulering. EGF blev opnået fra Cell Signaling Technology.}

Stabil Knockdown af PKM2 og overekspression af PKM2

Et plasmid indeholdende en RNA-interferens sekvens, målrettet den PKM2 genet i BGC823, var SGC7901 og AGS celler konstrueret. Sense oligo for siPKM2 sekvensen var 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', og antisense oligo var 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. Den BGC-823, SGC-7901 og AGS celler blev transficeret med pcPUR + U6-siPKM2 eller pcPUR + U6-siRenilla (kontrol) og valgt som puromycin-resistente kloner. Western blot-analyse blev udført for at bekræfte PKM2 undertrykkelse. Et plasmid indeholdende PKM2 cDNA-sekvens blev opnået fra Invitrogen. Den BGC-823, blev SGC-7901 og AGS-celler transficeret med pcDNA6.0-PKM2 eller pcDNA6.0-mock (kontrol) og valgt som blasticidin-resistente kloner. Western blot-analyse blev udført for at bekræfte PKM2 ekspression.

Protein Extraction og Western blot-analyse

Celler blev resuspenderet i lysepuffer indeholdende en proteaseinhibitor cocktail, og de ekstraherede proteiner blev separeret ved anvendelse 8-10% SDS-PAGE geler. p-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. Antistoffer mod E-cadherin og p-E-cadherin blev opnået fra Epitomics. Phospho-EGFR (Tyr1068), phospho-PLCγ1 (Tyr783), phospho-AKT (Ser473), phospho-Gab1 (Tyr627), phospho-c-CBL (Tyr700), og phospho-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology.

RNA Extraction, Reverse Transcription og Real-time PCR

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp af TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA). Prøverne blev derefter behandlet med DNase i 15 minutter ved stuetemperatur, og RNA'et blev yderligere oprenset under anvendelse af en RNA-oprydning (Qiagen, CA, USA). Revers transkription (RT) reaktion for første-streng cDNA-syntese blev udført under anvendelse af revers transkriptase (Bio-Rad) med 2 ug totalt RNA. Kvantitativ RT-PCR-analyse blev udført med ABI 7500 (Applied Biosystems), og de genekspressionsniveauer for hver enkelt prøve blev normaliseret til GAPDH. Den gennemsnitlige relative genekspression blev bestemt og forskelle blev beregnet under anvendelse af 2 ^{-ΔΔCt fremgangsmåde til agarosegelelektroforese. RT-PCR primersekvenser var som følger: sense 5'TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'og antisense 5'GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' for N-cadherin; sense 5'CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'og antisense 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' til E-Cadherin; sense 5'TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'og antisense 5'GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' for MMP7; sense 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'og antisense 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' for GAPDH.}

celleproliferationsassay

Celleproliferation blev målt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki gun, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne udsået i fire 96-brønds plader ved en densitet på 2 x 10 ^{3 celler /brønd. Én plade blev taget ud på samme tidspunkt hver dag efter at cellerne havde adhæreret til brøndene. Absorbansen blev målt med en mikropladelæser ved en bølgelængde på 450 nm. Alle forsøg blev udført tre gange.}

Transwell invasion og sårheling Analyser

transwell invasion analyser blev udført med 8,0-um-pore indsatser i en 24-brønds Transwell pladen. Basalmembranen blev hydratiseret med 500 pi serumfrit RPMI 1640 eller F12K-medium 30 min før anvendelse. For invasionen assayet blev mavens cancercellelinjer tilsat til det øvre kammer af en Transwell med 0,5 mg /ml kollagen type l (BD Bioscience, San Jose, CA) -belagt filtre. RPMI 1640 eller F12K-medium med 10% føtalt bovint serum og 1% af hver antibiotikum blev tilsat til det nederste kammer. Den BGC og 7901 celler blev inkuberet i 36 timer. De AGS-celler blev inkuberet i 24 timer. De invaderende celler blev kvantificeret efter Ensian violet farvning. Hvert forsøg blev udført tredobbelt, og dataene blev udtrykt som middelværdier. Den sårhelende assay blev udført i 6-brønds plader. Tumorceller i medium indeholdende 10% FBS blev podet i plader med 6 brønde (Corning, CA). Cellekulturer blev gjort hvilende ved at dyrke dem til konfluens, og mediet blev erstattet med frisk medium indeholdende 0,5% serum i 1 dag. Sår i monolaget blev foretaget med sterile pipettespidser. Derefter EGF med 100 ng /ml slutkoncentration blev anvendt til cellestimulering. Cellerne blev derefter vasket med PBS og opdateres med medium indeholdende 10% FBS. Fotografier blev taget ved 0 og 24 timer. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité (No: 20.081.012). På Zhongshan Hospital tilknyttet Xiamen University, Xiamen, Fujian-provinsen, Kina, og vi opnåede skriftlige samtykke udsagn fra alle deltagere, der er involveret i denne undersøgelse.

Udarbejdelse af vævsprøver

Tumor vævsprøver blev indsamlet fra 15 forskellige gastrisk cancer patienter, som gennemgik helbredende resektion på Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen, Kina. En uafhængig serie af tilsvarende hosliggende noncancerous væv fra 15 af de samme patienter blev opsamlet på samme tid. Alle vævsprøver blev opsamlet og delt i to dele umiddelbart efter tumorresektion. En del blev opsamlet i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA og protein ekstraktion. Den anden del blev fikseret i 4% formaldehyd og indlejret i paraffin for histologisk analyse (Hematoxylin eosin og IHC farvning). Alle prøver blev bekræftet ved patologisk diagnose (den histopatologiske diagnose var baseret på WHO-kriterier). Alle eksperimentelle sager blev grupperet accord-ing til International Union Against Cancer Tumor-Node-Metastase (TNM) iscenesættelse systemet (revideret i 2002).

Immunhistokemi

Fire-mikron-tykke paraffinsnit blev enten farvet med hematoxylin og eosin (H &E) eller analyseret for PKM2, s-ERK1 /2 og E-cadherin ekspression ved immunhistokemi. Immunhistokemi blev udført i overensstemmelse med procedurerne, der blev anbefalet af producenten. Reaktionerne blev visualiseret under anvendelse diaminobenzidin som et kromogent substrat. Snittene blev modfarvet ved anvendelse af hæmatoxylin og derefter blokerede og monteret. Den gennemsnitlige tæthed (IOD /areal) blev påvist i forskellige positive områder af de 15 menneskelige mavekræft prøver vha Image-Pro Plus software.

Statistiske Analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS v13. 0 (SPSS, Inc.) software. The Independent-Samples T Test og korrelationsanalyse blev brugt til at sammenligne data. Alle værdier er angivet som middelværdier ± SD. Forskellene blev betragtet som statistisk signifikant på P
. ≪ 0,05

Resultater

Udtømning af PKM2 forfremmet Cell Migration og Invasion i BGC823 og SGC7901 Celler med EGF Stimulation

ekspressionen af ​​PKM2 protein i gastriske cancercellelinier BGC823 blev SGC7901 og AGS evalueret under anvendelse af Western blot-analyse. Disse cellelinier viste et højt niveau af PKM2 ekspression. Derefter blev stabile gastrisk cancer cellelinjer med en ændret PKM2 udtryk etableret ved hjælp af RNA-interferens (PKM2 knockdown) i BGC823, SGC7901 og AGS celler. Som vist i fig. 1A blev BGC823, SGC7901 og AGS cellelinier med PKM2 knockdown etableret. Vi observerede, at spredningen blev reduceret i BGC823 og AGS celler efter PKM2 blev udtømt (fig. 1B). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser.

For at undersøge effekten af ​​PKM2 på celle migration og invasion, vi beskæftigede veletableret sårheling og transwell assays til karakteriserer celle motilitet respons i BGC823 og SGC7901 celler . En konfluent lag af celler blev først inkuberet natten over i medium, en ridse sår blev indført, medium indeholdende den mest egnede dosis af EGF (100 ng /ml) blev tilsat for at stimulere migration, og blev observeret procentdelen af ​​såret forsegling efter 24 timer ( Figur S1). De invaderende celler blev kvantificeret 36 timer efter EGF (100 ng /ml) blev tilsat til det nederste kammer. Resultaterne indikerer, at behandlingen af ​​BGC823-sipk og SGC7901-sipk celler med EGF efter en ridse såret og i transwell signifikant øget hastigheden for sårheling (fig. 1 C, D) og invasion (fig. 1 E, F) sammenlignet med kontrol- celler.

Udtømning af PKM2 Nedsat E-cadherin Expression og Forbedret aktiviteterne i det EGF /EGFR Downstream signalveje PLC-γ1 og ERK1 /2

for at undersøge mekanisme af ændringer i celle migration og invasion efter knockdown af PKM2, vi analyserede udtryk for medlemmer af Ca ^{2 + -afhængig celleadhæsionsmolekyler familie og metalloproteinaser. Vi fandt, at E-cadherin-protein ekspressionsniveauer var nedsat i BGC823 og SGC7901 celler, når PKM2 ekspression blev reduceret (Fig. 2A).}

Niveauet af E-cadherin mRNA og phosphoryleringen af ​​E-cadherin blev bestemt i BGC823 og SGC7901 celler med PKM2 udtømning at vurdere, om den observerede forskel i E-cadherinekspression indtraf før eller posttranslationelt. Vi observerede nedregulering af E-cadherin-mRNA og øget phosphorylering, hvilket inducerer endocytose af E-cadherin i PKM2-udtømte celler (fig. 2A, B). Vi fandt også, at ekspressionsniveauet af N-cadherin-protein blev forøget i BGC823 og SGC7901 cellelinjer når PKM2 blev depleteret (fig. 2A).

Cell migration og invasion i vid udstrækning reguleret af EGFR-aktivitet. At analysere, om EGFR er involveret i migration og invasion af BGC823 og SGC7901 celler, blev disse celler behandlet med EGF, som binder til EGFR og aktiverer nedstrøms signalveje. behandling EGF resulterede i phosphorylering af EGFR og den efterfølgende aktivering af PLCγ1, AKT og ERK1 /2-pathways (Fig. 2C). Vi fandt, at PLC γ1 havde et højere aktivitetsniveau i PKM2-udtømte celler end i un-udtømte celler efter enten en kort eller lang (24 timer) inkubation med EGF. Der var imidlertid ingen markant forskel i AKT-aktivitet mellem PKM2-udtømte celler og un-udtømte celler. PLCγ er en vigtig regulator af cellemigrering nedstrøms for RTK signalering [11]. Phosphorylering på tyrosin rest 783 af PLCγ1 er kritisk for dens aktivering [12]. PLCγ1 aktivering forbedret celle motilitet, og blev observeret denne effekt i såret scratch og transwell analyser, som observeret i fig. 1C.

Vi næste undersøgt effekten af ​​en EGFR-ligand på ekspressionen af ​​MMP'er ved hjælp af RT-PCR i BGC823-sipk og SGC7901-sipk celler sammenlignet med deres respektive kontrol- celler. Behandling med EGFR-liganden, EGF, forøgede ekspression af MMP'er på niveauet for transkription i BGC823 og SGC7901 celler. Men der var ingen tydelige forskelle i ekspressionsniveauerne af MMP2 og MMP9 mellem PKM2-udtømte celler og kontrolprøver celler (data ikke vist). MMP7 ekspression blev opreguleret i PKM2-udtømte celler med EGF behandling (fig. 2D). De ERK /MAPK baner spiller kritiske roller i EGFR-ligand-induceret MMP7 ekspression. Endvidere blev en indlysende stigning i ERK1 /2-aktivitet observeret efter 0 timer og 24 timer af behandlingen med EGF i PKM2-udtømte celler.

Udtømning af PKM2 Svækket motilitet AGS celler og funktionelle ændringer efter redning PKM2 i Gastric cancer Cell Lines

udtrykket af E-cadherin protein i gastrisk cancer cellelinjer BGC823, SGC7901 og AGS blev evalueret med Western blot analyse. De BGC823 og SGC7901 cellelinjer udtrykker E-cadherin. I modsætning hertil AGS celler mangler E-cadherin ekspression (fig. 3A).

For at undersøge effekten af ​​PKM2 knockdown på cellemigrering og invasion i AGS celler anvendte vi veletableret sårheling og transwell assays til karakterisere cellemotilitet. En konfluent lag af celler blev først inkuberet natten over i medium, et sår ridse blev indført, medium indeholdende EGF (100 ng /ml) blev tilsat for at stimulere migration, og blev observeret procentdelen af ​​såret forsegling efter 24 timer. De invaderende celler i Transwell assay blev kvantificeret 24 timer efter EGF (100 ng /ml) blev tilsat til det nederste kammer. Til vores overraskelse, fandt vi, at behandlingen af ​​AGS-sipk celler med EGF efter såret bunden og i transwell faldt betydeligt hastigheden af ​​sårluknings- og invasion sammenlignet med kontrolcellerne (fig. 3B, C). Der var iøjnefaldende forskelle mellem BGC823 /SGC7901 og AGS celler.

For yderligere at illustrere den rolle, PKM2 i celle motilitet, gjorde vi det PKM2 redde eksperimenter. Vi taked stabilt transficeret metode ved hjælp af overekspression plasmidvektor pcDNA6.0-mock og pcDNA6.0-PKM2 at beskæftige sig med BGC823 og AGS celler, som stabilt knockdown PKM2. Ekspressionen af ​​p-EGFR, E-cadherin blev vist i PKM2 redning eksperimenter (fig. 3D). Vi observerede, at når PKM2 ekspression udvindes, har phosphorylering af EGFR signifikant reduceret i BGC823 celler og voksede i AGS celler. Desuden blev cellemotilitet af BGC823 celler faldet og AGS celler blev afvist efter PKM2 redning (fig. 3E). For at tydeliggøre den mekanisme af disse forskelle, derefter analyseret vi aktiviteten af ​​EGF /EGFR signalvejen.

PKM2 Forbedret aktiviteterne i EGF /EGFR Downstream signalveje i AGS Cells og var korreleret med ERK aktivitet i Gastric cancer Prøver

for at analysere, om EGFR kan være involveret i migrationen og invasion af AGS celler, blev disse celler behandlet med EGF, som binder til EGFR og aktiverer nedstrøms signalveje. EGF-behandling resulterede i phosphorylering af EGFR og den efterfølgende aktivering af nedstrøms EGFR pathways, herunder PLCγ1 og ERK1 /2-pathways (fig. 4A). Vi fandt, at aktiviteterne i PLCγ1 og ERK1 /2 var større i celler, hvor PKM2 ikke var forarmet end i de PKM2-udtømte celler efter enten en kort eller lang (24 timer) inkubation med EGF. Dette resultat er det modsatte af, hvad der blev observeret med BGC823 og SGC7901 celler; i AGS celler, PKM2 kom i spil som et incitament og fremmet celle migration og invasion. Derefter undersøgte vi, MMP7 ekspression under anvendelse af RT-PCR i AGS-sipk celler og kontrolceller. Behandling med EGF forøget MMP7 ekspression på niveauet for transkription i AGS-pu6 celler, men ikke i AGS-sipk celler (fig. 4B). Aktiviteten af ​​ERK1 /2 var tydeligvis højere i AGS-pu6 celler sammenlignet med AGS-sipk celler efter 0 timer og 24 timer behandling med EGF (fig. 4A).

Vi næste udført immunhistokemiske (IHC) analyser til undersøge E-cadherin udtryk PKM2 lokalisering og ERK1 /2 fosforylering i serielle sektioner af 15 humane mavekræft prøver vha antistoffer med validerede specificiteter. Figur 4C viser, at niveauerne af E-cadherin ekspression, ERK1 /2 phosphorylering, og cytoplasmatisk PKM2 ekspression blev korreleret med hinanden. Derudover observerede vi et højt ERK1 /2 phosphorylering i kernen af ​​cancerceller uden E-cadherin ekspression. I områder med ERK1 /2 phosphorylering, vi også fundet højere niveauer af PKM2 ekspression. Men vi fandt ikke phosphorylering af ERK1 /2 i områder positive for E-cadherin ekspression (fig. 4C). En korrelationsanalyse mellem PKM2, E-cadherin og P-ERK1 /2 blev udført under anvendelse Image-Pro Plus software (Fig. 4D). Den gennemsnitlige tæthed (IOD /areal) blev indspillet i forskellige positive områder af 15 humane mavekræft prøver. Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem PKM2 og E-cadherin i E-cadherin-positive områder. Desuden var der en signifikant sammenhæng mellem PKM2 og p-ERK1 /2 i E-cadherin-negative områder.

Diskussion

Den invasive og metastatiske fase af kræft progression korrelerer med dårlig klinisk prognose og repræsenterer den mest formidable barriere for en vellykket behandling. Cellemotilitet og invasionsevne er de definerende karakteristika maligne tumorer, som muliggør tumorceller til at migrere ind i tilstødende væv eller ved at begrænse basalmembraner og ekstracellulære matrixer. Cell motilitet er nødvendig for de fysiologiske processer i sår reparation og organogenese og for den patologiske proces tumor invasion [13]. Invasive tumorceller er kendetegnet ved dysreguleret cellemotilitet som respons på ekstracellulære signaler fra vækstfaktorer og cytokiner. Humane tumorer udtrykker høje niveauer af vækstfaktorer og deres receptorer, og mange typer af maligne celler synes at udvise autocrine- eller parakrin-stimuleret vækst. Blandt de mest velundersøgte vækstfaktorreceptor systemer er EGF-receptoren familien [14]. Signaler fra det ekstracellulære miljø diktere cellemotilitet. Mange vækstfaktorer, herunder ligander, der virker gennem den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), forbedre cellemotilitet [15]. Mindst to distinkte intracellulære signalveje er nødvendige for EGFR-medieret cellemotilitet: veje anvender PLC γ og MAP-kinase-vejen. PLC γ aktivitet er blevet foreslået at forbedre cellemotilitet ved mobilisering af actin-modificerende proteiner fra en inaktiv membranassocieret lokalisering til en aktiv sub-membran cytoskeletal locale [16]. ERK MAP-kinaser sender signaler til nucleus, såvel som signaler, der regulerer celle-matrix-forbindelser.

Cadheriner omfatter en stor familie af celle-celleadhæsionsmolekyler, der omfatter den klassiske, desmosomer og atypiske cadheriner. E-cadherin, som udtrykkes primært i epitelceller, er et adhæsionsprotein, der kodes af CDH1 genet og funktioner i flere processer, herunder udvikling, vævsintegritet, cellemigrering, morfologi, og polaritet [17], [18], [19]. E-cadherin er også en tumor suppressor, hvis ekspression ofte reduceres eller tavshed, og dens re-udtryk kan fremkalde morfologiske reversion [20], [21]. aktivering af EGFR EGF-afhængige er blevet rapporteret at blive inhiberet i en E-cadherin-adhæsion-afhængig måde, som inhiberer ligand-afhængig aktivering af forskellige receptortyrosinkinaser. N-cadherin, som en invasion promotor, ofte opreguleres. Ekspressionen af ​​N-cadherin i epitelceller inducerer ændringer i morfologi til en fibroblastisk fænotype, hvilket gør cellerne mere motile og invasiv. Nylige undersøgelser viser, at cancerceller har opreguleret N-cadherin foruden tabet af E-cadherin. Denne ændring i cadherinekspression kaldes "cadherin switch".

Vi observerede en nedregulering af E-cadherin-mRNA og øget phosphorylering, hvilket inducerer endocytose af E-cadherin i PKM2-udtømte celler. Vi fandt også, at den N-cadherin-protein ekspressionsniveauet blev forøget i BGC823 cellelinien når PKM2 blev depleteret. Den knockdown af PKM2 fremmet celle migration og invasion i BGC823 og SGC7901 celler med EGF-stimulering. En øget aktivitet af EGFR er den kritiske faktor for celle motilitet og invasivitet af BGC823 og SGC7901 celler. Vi antager, at nedreguleringen af ​​E-cadherin ekspression forøgede phosphorylering af EGFR og aktiverede downstream signalveje, som omfatter PLCγ1 og ERK1 /2. PLC γ-aktivering forøger cellemotilitet, og ERK1 /2-aktivitet spiller en kritisk rolle i MMP7 ekspression.

Matrixmetalloproteinaser (MMP'er) er blevet impliceret i cancer invasion og metastase grund af deres ekstracellulære matrix (ECM) -proteolytic aktivitet [22]. MMP-7 er blevet rapporteret at blive produceret af gastriske carcinomceller og signifikant associeret med de aggressive patologiske fænotyper af gastrisk cancer [23]. MMP-7 kan aktivere pro-MMP-1, har en stærk stromelysin-lignende aktivitet og nedbryder uopløseligt elastin, type IV-collagen, laminin-1, fibronectin, proteoglycan og gelatiner [24]. De ERK /MAPK baner spiller kritiske roller i EGF-induceret MMP7 ekspression [25].

E-cadherin er en celle-adhæsion glycoprotein karakteriseret for første gang i humane cellelinier ved Shimoyama et al [26]. Dens rolle i gastrisk udvikling af kræft blev først defineret af Guilford et al [27]. Der er en signifikant sammenhæng mellem graden af ​​E-cadherin ekspression og karakteren af ​​tumor differentiering, såvel som den histologiske type i henhold til Lauren og WHO klassifikationer. Patienter med E-cadherin-positive tumorer har betydeligt bedre 3- og 5-årige overlevelsesrater end patienter med E-cadherin-negative tumorer [28]. Arvelig diffus gastrisk cancer (HDGC) er en sjælden autosomal dominant syndrom, der er i høj grad tilskrives germline mutationer og deletioner i CDH1 genet er forbundet med en tidlig debut, histologisk diffus, signet-ring celletype mavekræft [29], [30].

Lim JY et al rapporterede, at PKM2 udtryk var stærkt korreleret med mavekræft differentiering. Differentierede kræfttyper udtrykker mere PKM2 protein end de udifferentierede typer; i modsætning hertil er højere PKM2 udtryk korreleret med kortere samlet overlevelse uafhængigt af scenen i signet-ring celle kræft. PKM2 ekspression kan være en negativ prognostisk faktor for signet-ring cellecarcinomer, som mangler E-cadherin [7]. Disse resultater er i overensstemmelse med vores forskning i gastriske cancerceller. Den BGC-823, SGC-7901 og AGS cellelinjer er forskelligt differentierede typer. E-cadherinekspression eksisterer i SGC-7901 og BGC-823-cellelinjer; i modsætning hertil blev AGS celler afledt af malign gastrisk adenocarcinom væv og mangler E-cadherin-medieret celleadhæsion [31]. Vi observerede, at knockdown af PKM2 fremmet migration og invasion af SGC-7901 og BGC-823-cellelinjer, men undertrykte disse egenskaber i AGS cellelinje. En anden gruppe har rapporteret, at pyruvat kinase typen M2 er opreguleret i kolorektal cancer, og knockdown af PKM2 undertrykte proliferation og migration af tyktarmskræft RKO celler [32]. Vi ved, at RKO celler mangler ekspressionen af ​​E-cadherin [33]. Immunhistokemisk (IHC) analyse viser, at niveauerne af E-cadherin ekspression, ERK1 /2 phosphorylering, og cytoplasmatisk PKM2 ekspression blev korreleret med hinanden. Vi fandt en høj grad af ERK1 /2 phosphorylering i kernen af ​​cancerceller uden E-cadherin ekspression, men med en høj grad af PKM2 ekspression.

Vi hypotesen, at PKM2 dæmper cellemotilitet og invasion når E-cadherin er nuværende. Denne nye funktion af PKM2 kan spille en rolle i den reversible inhibering af cellemotilitet og invasion i de tidlige stadier af mavecancer, når cellerne er positive for E-cadherin-ekspression. Under progressionen af ​​tumoren, manglende eller meget lav ekspression af E-cadherin inducerer en aggressiv funktion af PKM2 i tumoren. Den biologiske rolle PKM2 i udviklingen af ​​disse tumorer skal yderligere belyst.

Støtte oplysninger
figur S1.
ekspression af EGFR-proteinet i de gastriske cancercellelinier BGC823, SGC7901 og AGS blev vurderet ved anvendelse af Western blot-analyse. AGS celler viste et højere niveau af EGFR end de andre to cellelinjer. Der er ingen signifikant forskel mellem BGC823 og SGC7901 celler (Figur S1A). BGC-pu6 celler og BGC-sipk celler blev behandlet med forskellige doser af EGF. Efter 40 minutter detekteret vi niveauet af phosphorylering for EGFR. Vi fandt det højeste niveau af phosphorylering i dosis på 100 ng /ml (fig S1B). Derfor valgte vi en dosis på 100 ng /ml som den mest egnede kandidat. Transwell Forsøget viste også stærkere evne til at trænge ind i martrigel i BGC823 celler (Figur S1c)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF)

• PLoS ONE: genetiske varianter i epidermal vækstfaktor receptor Pathway Gener og risiko for esophageal pladecellecarcinom og Gastric Cancer i en kinesisk Befolkning
• PLoS ONE: Small Molecule R1498 som en veltolereret og oralt aktivt kinaseinhibitor for hepatocellulært carcinom og Gastric Kræftbehandling via Målretning angiogenese og mitose Pathways