PLoS ONE: Rollen von DPY30 in der Proliferation und Motilität des Magen-Krebs Cells

Abstrakt

Verschiedene Arten von Histon-Methylierung wurden mit Tumorprogression assoziiert. Je nach Methylierungsstelle in Histon-Proteine, ihre Wirkungen auf die Transkription unterschiedlich sind. DPY30 ist ein gemeinsames Element von SET1 /MLL Histon-Komplexe H3K4 Methyltransferase. Allerdings wurden seine Expression und Rollen bei Magenkrebs schlecht charakterisiert. Um festzustellen, ob DPY30 pathophysiologische Rolle bei Magenkrebs hat, wurden seine Expression und Rollen untersucht. Immunhistochemie und Echtzeit-PCR zeigte eine Hochregulierung von DPY30 Expression in einigen Magenkrebszelllinien und Patientengewebe. Die Zuschlags durch siRNA verringert die Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen, während seine Überexpression die entgegengesetzte Wirkungen zeigte. Diese Ergebnisse zeigen, dass DPY30 hat eine entscheidende Rolle bei der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen, und legen nahe, DPY30 könnte ein therapeutisches Ziel bei Magenkrebs sein

Citation. Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) Rollen von DPY30 in der Proliferation und Motilität des Magen-Krebszellen. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10.1371 /journal.pone.0131863

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Empfangen: 3. März 2015; Akzeptiert: 8. Juni 2015; Veröffentlicht am: 6. Juli 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb der Papier

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der Bio &unterstützt wurde; Medical Technology Development Program (É2M3A9C6050213, OSO) und Basic Science Research Foundation (É2R1A1A3010521, HME) der National Research Foundation (NRF) gefördert von der koreanischen Regierung (MEST) und durch einen Zuschuss von der National R & D-Programm für Cancer Control, Ministerium für Gesundheit, Soziales und Familie, der Republik Korea (\0050, OSO). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Kovalente Modifikationen von Histonen, wie Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Methylierung, Chromatinstruktur modulieren und eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus, Gen-Transkription, DNA-Reparatur, die embryonale Entwicklung spielen, und Zelldifferenzierung [1, 2]. Während erhöhte Histon-Acetylierung im Allgemeinen mit Transkriptionsaktivierung, die Methylierung von Histon korreliert mit Transkriptionsaktivierung und Unterdrückung verbunden ist. Beispielsweise Methylierung von Histon H3 am Lysin 9, 20 oder 27 Resten (H3K9, H3K20 oder H3K27) in transcriptional gene silencing beteiligt, aber auf der anderen Seite, Methylierung an H3K4, H3K36 oder H3K79 mit offenen Chromatinstruktur assoziiert und aktive Gen-Transkription [3].

Bei Säugetieren, Mono-, Di- und Tri-Methylierung von H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 und H3K4me3) werden durch sechs verschiedene SET1 /MLL Familie Komplexe (SET1A, durchgeführt SET1B , MLL1, MLL2, MLL3 und MLL4) [4, 5]. Diese H3K4 Methyltransferasen (H3K4MT) enthalten verschiedene katalytische Untereinheiten, und die Aktivitäten aller sechs Familienkomplexe werden durch eine gemeinsame Multi-Untereinheiten Kernkomponenten gesteuert, die umfassen WDR5, RBBP5, ASH2L und DPY30, und werden auch als WRADs bezeichnet. [6-9]. Ein Verlust von jeder Untereinheit von WRAD Komplex führt zu einer verringerten H3K4 Methylierung. WDR5 und RBBP5 entscheidend sind für alle drei Arten von Methylierung von H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 und H3K4me3), während ASH2L und DPY30 hauptsächlich für H3K4me3 benötigt werden [6, 8, 10, 11].

DPY30 ist Mitglied aller menschlichen SET1 /MLL-Komplexe und ist für die volle SET1 /MLL-Methyltransferase-Aktivität [10, 12] erforderlich. DPY30 wurde in der Differenzierungspotential von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) entlang der neuronalen linage [10] und ist wesentlich für die richtige Differenzierung und Proliferation von hämatopoetischen Vorläuferzellen [12] gebracht. Darüber hinaus Erschöpfung der DPY30 verursacht Zellen eine Seneszenz-ähnlichen Zustand zu betreten und p16 (CDKN2A) und p15 (CDKN2B) hinaufzuregulieren, die direkt in die Seneszenz beteiligt sind [13].

Magenkrebs ist einer der führenden ist Ursachen von Krebs-Todesfälle weltweit [14]. Obwohl die jüngsten diagnostische und therapeutische Fortschritte mit Magenfrühkarzinomen für Patienten hervorragende Überleben bieten, ist die Krankheit in der Regel in einem späten Stadium diagnostiziert, wenn die Prognose schlecht ist [15]. Magen Karzinogenese bringt die progressive Anhäufungen verschiedenen genetischen und epigenetischen Veränderungen, die durch Onkogene und loss-of-function durch Tumorsuppressor-Gene zu gain-of-function führen. Weiterhin stark da Gentranskription auf Chromatinstruktur beruht, verändert oder abnormal Histon-Methylierung mit Tumorprogression und Prognose bei Krebs wurde typischerweise assoziiert [16], und auch wenn der Status der Histon-Methylierung ist auch in vielen Arten von Krebs beschrieben worden ist, ist dieser Aspekt bleibt unklar, bei Magenkrebs [16, 17].

in dieser Studie, um zu bestimmen, ob DPY30 pathophysiologische Rolle bei Magenkrebs hat, wurden seine Expression und Rollen untersucht.

Materialien und Methoden

Zellkultur und siRNA-Transfektion

die Magenkrebs-Zelllinien, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 und NCI-N87 von der koreanischen Zelllinie Bank (Seoul) erworben wurden. Die Magen-epithelialen Zelllinie, HFE145 wurden von Professor Hassan Ashktorab (Howard University) begabt. Die Magenkrebs-Zelllinien wurden in einem befeuchteten 5% CO bei 37 ° C kultiviert _{2/95% Luftatmosphäre in RPMI1640 mit 25 mM HEPES ergänzt, das 10% fötales Rinderserum (FBS) (GE Healthcare Life Science, South Logan , UT, USA) und 100 ug /ml Penicillin /Streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). DMEM (GE Healthcare Life Science) Medium mit 10% FBS und 100 ug /ml Penicillin /Streptomycin wurde für HFE145 Kultur verwendet. Die Zellen wurden mit small interfering RNA (siRNA) oder verschlüsselt (SCR) siRNA unter Verwendung von DhamaFECT Reagenz 1 oder 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, USA) transfiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers. siRNA Sequenzen waren wie folgt: DPY30 siRNA-Duplex (ORF) (Bioneer, Daejeon, Korea), 5'-CAC UCU GAG UAC GGU CUC A (dTdT) -3 ', 5' CUC UGA GUA CGG UCU CAC A (dTdT) -3 ', 5' CUC ACU UAU UCU AGG UAC U (dTdT) -3 '; DPY30 siRNA-Duplex (3'-UTR) (Bioneer); 5 'CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) -3', 5 'GAG GCA AVV UUA AUU GCC August AUC A (dTdT) -3'; WDR5 siRNA-Duplex (Bioneer), 5 'GUC CUU GUG AAG CUC GUC U (dTdT) -3', 5 'GUC GUG AUC UCA ACA AVV U (dTdT) -3', 5 'CAG AUU CUA ACC UUC UUG U (dTdT) -3 '; RBBP5 siRNA-Duplex (Bioneer), 5 'GUG UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3', 5 'CAG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3', 5 'GUG GUU GAG AUU AGU AGA U (dTdT) -3 '; ASH2L siRNA-Duplex (Bioneer), 5 'GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) -3', 5 'CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) -3', 5 'GUC UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) -3 '; siRNA (Thermo Scientific) scrambled (SCR), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '.}

DPY30 Überexpression

Die DPY30 cDNA wurde in pLenti6.3 geklont -V5 /DEST-Vektor (lentivirale Zielvektor) mit dem in-vivo-Rekombination
-basierten Gateway-Klonen System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Der Spender-Vektor (pDONR221) wurde im Ultimate ORF-Klone (Invitrogen) gekauft die cDNA-Sequenz von DPY30 Beherbergung und rekombiniert mit dem Gegen wählbar ccdB
Gen von pLenti6.3-V5 /DEST mit LR Clonase Enzymmischung (Invitrogen). Der leere Vektor pLenti6.3 /V5-DEST wurde als Mock-Kontrolle verwendet. Rekombinante Lentiviren wurden in 293FT Zellen produziert und verwendet SNU216 und SNU638 Zellen zu infizieren, gemäß den Anweisungen des Herstellers (ViraPower Lentivirale Expression System, Invitrogen). DPY30-überexprimierenden stabile Zellen wurden durch Selektion mit Blasticidin (7,5 ug /ml) (Invitrogen) hergestellt.

Bei Rettungs- Assays wir geändert, gefolgt ein Protokoll 'RNAi-Interferenz Precision Lenti ORF Sammlung' (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Kurz gesagt, wurden die Zellen mit rekombinanten Lentiviren (pLenti6.3-V5 /DEST oder DPY30-over-Konstrukte) infiziert. 24 Stunden nach der Transduktion werden die Medien-Virus enthielten, wurden entfernt und mit komplettem Kulturmedium ersetzt. Am folgenden Tag Blasticidin wurde in einer Konzentration von 7,5 &mgr; g /ml zugegeben. Die Zellen wurden für sechs Tage unter Auswahl beibehalten, Medium zu ersetzen oder alle 2-3 Tage Passagierung nach Bedarf. Die ausgewählten Populationen von Kontrollzellen oder Zellen, die DPY30 wurden für Transfektionsexperimente verwendet mit DPY30 siRNA Targeting den offenen Leserahmen (ORF) oder 3'-untranslatierten Region (UTR).

Real-time PCR

die Gewebeproben wurden von 23 nicht verwandten koreanischen primären Magenkrebs-Patienten erhalten, die chirurgische Resektion bei Pusan ​​National University Hospital und Pusan ​​National University Yangsan Hospital und eine schriftliche Einverständniserklärung unterzogen. Die Studie wurde von der Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) und der Pusan ​​National University Yangsan Krankenhaus-Institutional Review Board (PNUYH-IRB) genehmigt. Gesamt-RNA aus Geweben und Zellen wurden unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) oder eines RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) extrahiert, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (real-time PCR) wurde verwendet, DPY30 mRNA-Spiegel zu überprüfen. cDNAs wurden mit MMLV-reverse Transkriptase (Promega, Madison, WI, USA), dNTP und oligo-dT-Primern synthetisiert. Die verwendeten Primersequenzen waren wie folgt: DPY30, 5 'AAC GCA GGT TGC AGA AAA TCC T-3' und 5'-TCT GAT CCA GGT AGG CAC GAG-3 '; WDR5, 5 'TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 und 5' CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT -3 '; RBBP5, 5 'AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3' und 5 'TCA CAG TCG CCT GAA AGA AC-3'; ASH2L, 5 'TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC-3' und 5 'CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG -3'; GAPDH, 5 'TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3' und 5 'CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG-3'. Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung eines LightCycler ™ 96 Echtzeit-PCR System (Roche, Nutley, NJ) und Faststart DNA Wesentliche Grün Master (Roche) durchgeführt, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet.

Immunohistochemistry

Immunhistochemische Färbung mit Kaninchen-anti-human DPY30 polyklonalen Antikörpers (Sigma-Aldrich) auf einer Magenkrebsgewebe-Array wurde durchgeführt (n = 59) gekauft von SUPER BIO CHIPS (Seoul) oder auf 4 um Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Proben. Kurz gesagt, nach der Entparaffinierung und Rehydratisierung wurden die Objektträger mit 0,3% Wasserstoffperoxid behandelt, für 30 min endogene Peroxidase-Aktivität und mit 10% normalem Eselserum (NDS) und 1% BSA in 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) blockiert zu hemmen. Die Objektträger wurden dann in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 ° C inkubiert, um ein Kaninchen-anti-human DPY30 primären Antikörper enthält (1:80, Sigma-Aldrich). 200 in Blockierungspuffer für 2 h bei RT: Sekundär-Antikörper (HRP-konjugiertem) Bindung wurde bei einer Verdünnung von 1 durchgeführt. Die Detektion wurde mit HRP (Vector Laboratories) durchgeführt und die Objektträger wurden gegengefärbt, indem sie für 1 min mit Hämatoxylin Färbepuffer (Sigma-Aldrich) behandelt wird.

Zellproliferationsassay

Einen Tag nach der Transfektion von Zellen mit siRNA wurde das Medium mit 1% FBS-Medium ersetzt, und vier Tage später wurden 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) zugegeben und für 0,5 bis 2 Stunden inkubiert. Um die Wirkung von DPY30 Überexpression auf die Zellproliferation zu überprüfen, wurden die Zellen in 10% FBS-Medium beimpft, und nach drei Tagen Kultur wurden 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO) wurde 0,5 bis 2 Stunden zugegeben und inkubiert. Zellviabilitäten wurden bestimmt durch Absorption bei 450 nm gemessen wurde unter Verwendung von VICTOR3 mehrere Leser (PerkinElmer, MA, USA).

Boyden-Kammer-Assay

Eine modifizierte Boyden Transwell-Kammer (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) wurde verwendet. Die untere Kammer wurde mit 50 &mgr; l RPMI, enthaltend 10% FBS gefüllt. Um zu untersuchen Auswirkungen von DPY30 bekannt-down, SNU1 und SNU16 (nicht-adhärenten Zellen) wurden mit dem ORF-Targeting-siRNA transfiziert. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen gewaschen, suspendiert in einer Dichte von 5 x 10 ^{5 Zellen /ml in 50 ul RPMI mit 0,5% FBS ergänzt und impft in die obere Kammer. Um die Auswirkungen der Proliferation, Mitomycin C (0,01 &mgr; g /ml, Sigma-Aldrich) entfernen, wurde zugegeben. Die Zellen wurden dann 24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO2 inkubiert. Die Zahl der gewanderten Zellen wurde durch Zählen der Zellen in Bodenvertiefungen ausgewertet. Um Effekte der DPY30 Überexpression zu untersuchen, die stabilen Zellen (adhärente Zellen; SNU216 und SNU638) verwendet. Die Zellen (mock und DPY30-over) wurden trypsinisiert und ausgesät bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen /ml. Um die Auswirkungen der Proliferation entfernen, wurde Mitomycin C zugesetzt. Die Zellen durften für vier Stunden zu wandern, wurden die Membranen fixiert und gefärbt mit Diff-Quik-Lösung (Sysmex, Kobe, Japan) und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Zellzahlen in 10 zufällig ausgewählten Feldern wurden mit einem Lichtmikroskop gezählt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.}

Matrigel Invasionstest

Die invasiven Fähigkeiten von Krebszellen wurden 8-um poröse BioCoat Matrigel Kammereinsätze (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) beurteilt werden. Einen Tag nach der Transfektion mit SCR oder DPY30 siRNA, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und suspendiert in einer Dichte von 5 x 10 ^{4 Zellen /ml in 500 ul RPMI, supplementiert mit 0,5% FBS und Mitomycin C (0,01 &mgr; g /ml, Sigma -Aldrich). Die Zellen wurden dann in die Kammer Einsätze zugegeben und in den Vertiefungen, gefüllt mit 0,7 ml Medium, ergänzt mit 10% FBS als chemoattractant platziert. Nach einer Inkubation von 24 oder 48 Stunden, nicht-eindringenden Zellen auf der Membran wurden durch Abschaben entfernt und invasive Zellen auf der Unterseite der Membran wurden mit Diff-Quik-Lösung (Sysmex) fixiert und gefärbt. Die Zellzahlen in 10 zufällig ausgewählten Feldern wurden mit einem Lichtmikroskop gezählt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und mindestens 5 Felder wurden pro Experiment gezählt durchgeführt.}

Die statistische Analyse

Die Ergebnisse werden als Mittel ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die Wertigkeiten der Unterschiede der Schüler bestimmt mit t
-Test für ungepaarte Beobachtungen. P
Werte von < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse |

Expression von DPY30 bei Magenkrebs Gewebe

DPY30 Expression in menschlichen Magenkrebs zu untersuchen, wir Immunhistochemie führten eine Magenkrebsgewebe Array oder Archivierung in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. In normalen Magengewebe wurde DPY30 Expression schwierig (1A) zu erkennen, aber in Krebsgeweben DPY30 Protein wurde weithin überexprimiert (1B bis 1D). Bemerkenswert ist, wurde in eindringenden Magenkrebszellen (1B-1D) DPY30 überexprimiert. Darüber hinaus stellten wir fest, mRNA-Spiegel von DPY30 in einer verewigte normalen Magen-epithelialen Zell-Linie (HFE145) und sechs Magenkrebs-Zelllinien (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 und NCI-N87) real-time PCR. Die mRNA-Ebene von DPY30 war deutlich höher (mehrfache Änderung > 5) in SNU1 und SNU16 als in HFE145 Zellen, während die Expression von DPY30 in SNU216, SNU620 und SNU638 ähnlich war in HFE145 Zellen diejenigen zu und geringer war (mehrfache Änderung > 10) in NCI-N87 (Bild 1E). Wir überprüften auch mRNA-Spiegel von DPY30 bei Magenkrebs Gewebe. DPY30 war hoch in 15 Fällen ausgedrückt (15/23, 65%) im Vergleich zu normalen Geweben (Fig 1F). Diese Ergebnisse zeigen, dass DPY30 ist stark in einigen menschlichen Magenkrebs ausgedrückt.

Rollen von DPY30 in der Verbreitung von Magenkrebszellen

Um eine mögliche Rolle von DPY30 in Magenkrebszellen, um zu bestimmen, wir erste zerlegten DPY30 die ORF-Targeting DPY30 siRNA mit und überwacht seine Zuschlags Effizienz durch Echtzeit-PCR (2A). Die ORF-Targeting DPY30 siRNA (100 nM) reduzierte die mRNA-Spiegel von DPY30 in HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 und SNU638 Zellen im Vergleich mit verschlüsselten siRNA (SCR) um 78%, 89%, 79%, 76%, und 88% betragen. Fünf Tage nach der Transfektion von Zellen mit SCR oder der ORF-Targeting siRNA, führten wir Proliferationsassays. Preissturz von DPY30 hemmte die Wucherungen von HFE145, SNU1 und SNU16 im Vergleich mit SCR um 31%, 69% bzw. 71%, während der Zuschlag nicht die Wucherungen von SNU216 und SNU638 (2B) nicht beeinträchtigte, in dem das Expressionsniveau DPY30 war gering (1E). Als nächstes stellten wir DPY30-überexprimierenden Zelllinien (DPY30-over) mit HFE145, SNU216 und SNU638 Zellen, und dann verglichen DPY30 mRNA-Spiegel in Mock-Zellen (Kontrolle) und DPY30-over-Zellen. Real-time-PCR-Ergebnisse zeigten, dass die Expression von DPY30 4.2 war, 3,5 und 3,2-fach höher in DPY30-überexprimierenden HFE145, SNU216 und SNU638 Zellen als Mock-Zellen, bzw. (2A). DPY30 Überexpression verstärkt die Wucherungen von HFE145, SNU216 und SNU638 Zellen im Vergleich zu mock Zellen von 1,9, 2,2 und 1,6-fach bzw. (2B).

, um die Spezifität der DPY30 siRNA Um zu bestätigen, führten wir die Rettungsversuche. Für die Rettungsversuchen verwendeten wir eine DPY30 siRNA 3'-UTR statt ORF Targeting weil der ORF-Targeting siRNA auch die exogene DNA DPY30 ORF wir eingeführt abbauen können. Überexprimiert DPY30 wir transduzierten SNU1 und SNU16 mit Viruspartikeln, pLenti6.3-V5 /DEST (Kontrolle) oder DPY30-ORF-over-Konstrukte. DPY30-überexprimierenden SNU1 oder SNU16 Zellen zeigten eine höhere Expression von DPY30 2,1 oder 2,5-fach höher als Mock-Zellen, bzw. (2C). Die ORF-Targeting-siRNA führte zu Down-Regulation der DPY30 Expressionsniveaus von mehr als 75% in Mock sowie DPY30-überexprimierenden Zellen. Die 3'-UTR-Targeting siRNA die DPY30 Expression von mehr als 85% in mock Zellen herunterreguliert, während in den DPY30-überexprimierenden Zellen, den DPY30 Ausdruck auf ein Niveau verringert ähnlich der SCR-siRNA-transfizierten Zellen ( Fig 2C). Dieses Ergebnis zeigt, dass die exogene DPY30-ORF DNA an die 3'-UTR-Targeting siRNA resistent ist und auf einem ähnlichen Niveau wie endogene DPY30 mRNA exprimiert wird. Die ORF-Targeting siRNA gehemmt Proliferation von Zellen unabhängig von der exogenen DPY30 Ausdruck (Abb 2D). Die Proliferation wurde auch durch die 3'UTR-Targeting-siRNA in mock Zellen gehemmt, aber es ist teilweise in DPY30-überexprimierenden Zellen gehemmt wurde. In DPY30-überexprimierenden Zellen verringerte sich der ORF-Targeting siRNA, die Proliferation von SNU1 und SNU16 wie mit SCR-siRNA um 74% bzw. 66% im Vergleich jeweils jedoch die 3'-UTR-Targeting siRNA verringerte sich um 20% bzw. 8% bzw. . Dieses Ergebnis zeigt, dass exogene DPY30 die Inhibition der Proliferation durch die 3'-UTR-Targeting siRNA, und die Phänotypen verursacht durch DPY30 spezifische siRNA nicht Off-Target-Effekte induziert rettet.

Da DPY30 eine Komponente von Wards ist wir Ausdrücke und Rollen anderer Komponenten von Wards sucht. Echtzeit-PCR zeigte, dass mRNA-Spiegel von WDR5 und RBBP5 in SNU1, SNU16, SNU216 und SNU638 denen von HFE145 ähnlich waren. Allerdings waren die mRNA-Ebene von ASH2L signifikant höher (mehrfache Änderung > 3) in SNU1 und SNU16 als in HFE145 Zellen (3A) als DPY30 in 1E. Um zu untersuchen, ob WRAD Komponenten mit der Proliferation von Magenkrebszellen assoziiert sind, knockdowned wir jede WRAD Komponente ihre spezifische siRNA mit und überwacht Knockdown Effizienz durch Echtzeit-PCR (3B). Jede siRNA (100 nM) reduzierte die mRNA-Spiegel in SNU1 und SNU16 Zellen mit SCR um 65% -75% verglichen. Preissturz von WDR5 und RBBP5 hemmte die Proliferation von SNU1 und SNU16 Zellen im Vergleich mit SCR von 30-48% (3C). Jedoch hemmte ASH2L die Proliferation von SNU1 und SNU16, bei dem das Expressionsniveau von ASH2L hoch war, im Vergleich mit SCR um 85% und 75% betragen.

Rollen von DPY30 in der Migration und Invasion von Magen Krebszellen

Wir nächstes geprüft, ob DPY30 die Migration von Magenkrebszellen reguliert. Preissturz von DPY30 verringert die FBS-induzierte Migration von SNU1 und SNU16 Zellen gegenüber SCR um 35% und 45%, bzw. (Bild 4). Im Gegensatz dazu erhöhte DPY30 Überexpression die FBS-induzierte Migration von SNU216 und SNU638 Zellen im Vergleich zu mock Zellen von 2,5 und 2,2-fach bzw. (Bild 4). Diese Ergebnisse führten uns die Rolle der DPY30 bei der Invasion von Magenkrebszellen zu untersuchen. In einem Matrigel Invasionstest hemmte DPY30 siRNA die FBS-induzierte Invasionen von SNU1 und SNU16 Zellen gegenüber SCR-siRNA um 65% und 84%, bzw. (5A und 5C). Darüber hinaus erhöhte DPY30 Überexpression die-FBS induzierten Invasionen von SNU216 und SNU638 Zellen im Vergleich zu mock Zellen um 3,2 und 2,9-fach bzw. (5B und 5C). Diese Ergebnisse zeigen, dass DPY30 die Migration und Invasion von Magenkrebszellen fördert.

Diskussion

Rollen von DPY30 in der Krebsbiologie haben schlecht, obwohl seine Rolle bei der Differenzierung von ES-Zellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen charakterisiert hatte berichtet [10, 12]. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, neue Rollen von DPY30 bei Magenkrebs. DPY30 amplifiziert (Daten nicht gezeigt) und stark exprimiert (Fig 1) in einigen Magenkrebsgewebe. Darüber hinaus wurden die Zuschlags oder Überexpression der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen reguliert. Veränderungen in der Expression, chromosomalen Translokationen und somatische Mutationen von Genen, die Untereinheiten von SET1 /MLL Komplexe wurden in vielen Krebsarten berichtet. Diese Ergebnisse unterstützen die kritische Rolle der Mitglieder des SET1 /MLL-Komplex in der Tumorprogression.

Hochregulation von DPY30 Expression beobachtet wurde nur in SNU1 und SNU16 Magenkrebszellen unter sechs Magenkrebszellen wir untersucht haben. Doch seine Hochregulation wurde in mehr als der Hälfte der Magenkrebsgewebe beobachteten wir untersucht haben (Bild 1). Es ist schwer, diese Diskrepanz zu erklären. Es ist jedoch offensichtlich, dass die Anzahl von Magenkrebsgewebe wir untersucht haben, ist nicht genug. Also, eine umfangreiche Ausdruck Studie viel mehr Zahl von Geweben verwendet, ist erforderlich, um den klinischen Wert in der Zukunft zu bewerten.

Rollen von SET1 /MLL H3K4 Methyltransferase-Komplex in der Krebsbiologie ist komplex. Regulatorischen Untereinheiten von SET1 /MLL-Komplexe, einschließlich WRAD, enthalten sowohl potente oncoproteins und Tumorsuppressoren. Beispielsweise kodiert das Gen MEN1 Menin, eine integrale Untereinheit von MLL1 und MLL2 und ist bei Patienten mit Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1) [18, 19] mutiert. Darüber hinaus reguliert menin p18 (CDKN2C) und p27 (CDKN1B) durch die Rekrutierung MLL1 Komplex [20]. Im Gegensatz dazu WDR5, eine Komponente von WRAD Komplex wurde als ein Onkoprotein in Prostatakrebs berichtet handeln, in dem es überexprimiert wird und entscheidend für die Androgen-induzierte Proliferation von Tumorzellen [21]. ASH2L, die ein weiterer Bestandteil der WRAD komplex und kann mit dem Onkoprotein MYC [22] in Wechselwirkung treten, ist entscheidend für das MYC /Ha-RAS-abhängige Transformation von Rattenembryo-Fibroblasten. Darüber hinaus ist es in vielen Arten von Tumoren überexprimiert, und ist entscheidend für die Proliferation von Tumorzellen [23]. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, Rollen von DPY30 als oncoprotein im Magenkrebs.

Was molekularen Mechanismen Rollen von DPY30 bei Magenkrebs sind zugrunde liegen? Obwohl wir nicht offenbaren können mehrere Hypothesen basierend auf früheren Studien vorgeschlagen werden. Eine der möglichen Hypothesen ist, dass DPY30 Überexpression auf die overexpressions von Onkogenen durch erhöhte H3K4MT Aktivität führt. Depletion of DPY30 oder ASH2L führt zu einer Abnahme in H3K4me3, während WDR5 und RBBP5 entscheidend sind für alle drei Arten von H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 und H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Darüber hinaus allein die Überexpression von DPY30 kann H3K4MT Aktivität [10] erhöhen. Da H3K4me2 /3 eine aktive Markierung für die Transkription ist [3, 24], erhöhte H3K4MT direkt viele Gene, wie Oncogene oder alternativ indirekt herunterregulieren Tumorsuppressoren upregulate kann. Ein früherer Bericht diese Hypothese zu unterstützen, ist, dass ASH2L, eine kritische Komponente von SET1 /MLL-Komplex, wurde als ein Onkoprotein zu spielen gezeigt [25, 26]. Ein weiterer vorherigen Bericht ist, dass DPY30 direkt die Ausdrücke von ID-Proteine ​​über H3K4 Methylierung aktiviert [13, 27]. ID-Proteine ​​Aktivitäten von ETS1 und ETS2 gehemmt, die ein Tumor-Suppressor-Gens induzieren kann, p16. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass die Komponenten von WRAD (WDR5, RBBP5 und ASH2L) Proliferation von Magenkrebszellen (Abb 3) hemmen kann, was darauf hindeutet, dass DPY30 Akt durch die erhöhte H3K4MT Aktivität. Weitere Studien sind erforderlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen, die Rollen von DPY30 in Magenkrebszellen zu offenbaren.

• PLoS ONE: Analyse von deregulierten microRNAs und ihrer Zielgene in Magenkrebs
• PLoS ONE: MED30 Regelt die Proliferation und Motilität des Magen-Krebszellen