PLoS ONE: vaidmenys DPY30 į platinimu ir judrumas skrandžio vėžio ląsteles

Abstract

Įvairios Histonas metilinimo buvo susiję su vėžio progresavimą. Priklausomai nuo metilinimo aikštelėje Histonas baltymų, jos poveikis transkripcijos yra skirtingi. DPY30 yra bendras narys SET1 /MGL Histonas H3K4 metiltransferazei kompleksų. Tačiau, jo išraiška ir vaidmenis skrandžio vėžio buvo blogai charakterizuojamas. Norėdami nustatyti, ar DPY30 turi patofiziologinių vaidmenis skrandžio vėžio, buvo išnagrinėti jo išraiška ir vaidmenys. Imunohistocheminis ir realaus laiko PGR parodė, reguliavimo DPY30 raiškos kai kurių skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pacientų audiniuose. Jo nokdaunas iki siRNA sumažėjo proliferaciją, migraciją, ir invazija skrandžio vėžio ląstelių, o jo raiška parodė priešingą poveikį. Šie rezultatai rodo, kad DPY30 turi kritinių vaidmenis dauginimosi, migracijos ir invazijos į skrandžio vėžio ląstelių, ir pasiūlyti DPY30 gali būti terapinis taikinys skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Lee YJ, Han ME Baek SJ Kim SY, oh so (2015) vaidmenys DPY30 į platinimu ir judrumas skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 10 (7): e0131863. Doi: 10,1371 /journal.pone.0131863

redaktorius: Aamir Ahmadas Wayne State University School of Medicine, JAV

Įstojo: Kovo 3, 2015; Priėmė: Birželis 8, 2015 m Paskelbta 6 Liepos 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Lee et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus

finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas Bio & Medicinos technologijų plėtros programa (É2M3A9C6050213, OSO) ir pagrindinių mokslo tyrimų fondas (É2R1A1A3010521, HME) Nacionalinės mokslinių tyrimų fondo (NRP) finansuojamas Korėjos vyriausybės (Mest), ir dotacijos iš Nacionalinio mokslinių & D programa Vėžys kontrolė, ministerija sveikatos, gerovės ir šeimos reikalų, Korėjos Respublika (�.920.050, OSO). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

kovalentinis modifikavimas Histonas uodegas, kaip antai, acetilinimo, fosforilinimas, ubiquitination ir metilinimo, moduliuoti chromatino struktūrą ir vaidina pagrindinį vaidmenį iš ląstelių ciklo progresavimo, genų transkripcijos, DNR remonto, embriono vystymasis reguliavimo ir korinio diferenciacija [1, 2]. Nors padidėjo iuose acetilinimo paprastai susijęs su transkripcijos aktyvavimo, iš Histonas metilinimas koreliuoja su transkripcijos aktyvavimo ir represijų. Pavyzdžiui, metilinimo Histonas H3 lizinu 9, 20, arba 27 likučių (H3K9, H3K20 arba H3K27) dalyvauja transkripcijos genai yra nuslopinami, tačiau, kita vertus, metilinimas ne H3K4, H3K36, arba H3K79 yra susijęs su atvira chromatino ir aktyvus genas transkripcijos [3].

žinduolių, mono-, di-, ir tri-metilinimas H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 ir H3K4me3) atlieka šeši skirtingi SET1 /MGL šeimos kompleksų (SET1A, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3 ir MLL4) [4, 5]. Šie H3K4 metiltransferazių (H3K4MT) yra skirtingos katalizatoriaus subvienetų, o visų šešių šeimos kompleksų veiklą kontroliuoja bendrųjų kelių subvieneto pagrindinių komponentų, kurie apima WDR5, RBBP5, ASH2L ir DPY30, o taip pat vadinama WRADs. [6-9]. Pagal bet WRAD sudėtingų sąlygoja sumažėjusį H3K4 metilinimo subvieneto praradimas. WDR5 ir RBBP5 yra svarbus visoms trims rūšių metilinimo H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 ir H3K4me3), o ASH2L ir DPY30 daugiausia reikalingas H3K4me3 [6, 8, 10, 11].

DPY30 yra narys visų žmogaus SET1 /MGL kompleksų, reikalingas visiškam SET1 /MGL metiltransferazės veiklos [10, 12]. DPY30 buvo susijęs diferenciacijos potencialą embrionines kamienines ląsteles (ESRT) išilgai neuronų Wierszówka [10] ir yra būtinas tinkamam diferenciacijos ir proliferacijos kraujodaros kamieninių ląstelių [12]. Be to, išeikvojimas DPY30 sukelia ląstelių įvesti senėjimo panaši būklė ir upregulate P16 (CDKN2A) ir p15 (CDKN2B), kurie tiesiogiai dalyvauja senėjimo [13].

Skrandžio vėžys yra viena iš pirmaujančių priežastys vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [14]. Nors naujausi diagnostikos ir gydymo pažanga suteikia puikią išgyvenimo už pacientams su ankstyvos skrandžio vėžiu, liga paprastai diagnozuojama vėlai, kai prognozė yra prasta [15]. Skrandžio Kancerogeninis reiškia pažangiojo sankaupas įvairių genetinių ir epigenetinių pokyčių, dėl kurių atsiranda įgyti-of-funkcijai onkogenų ir netekus funkcija pagal naviko slopintuvas genų. Be to, kadangi genų transkripcija stipriai remiasi chromatino struktūros, pakeista ar nenormalus iuose metilinimas buvo paprastai susijęs su naviko progresavimo ir prognozės vėžiu [16], ir nors Histonas metilinimo statusas buvo gerai aprašyta daugelio rūšių vėžio, šis aspektas lieka neaišku, skrandžio vėžio [16, 17].

šiame tyrime siekiant nustatyti, ar DPY30 turi patofiziologinių vaidmenis skrandžio vėžio, buvo išnagrinėti jo išraiška ir vaidmenys.

medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra ir siRNR transfekcija

skrandžio vėžio kilmės ląstelių linijas, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 ir NVI-N87 buvo įsigytas iš Korėjos ląstelių linijos bankas (Seulas). Skrandžio epitelio ląstelių linija, HFE145 buvo talentingas profesoriaus Hassan Ashktorab (Howard University). Skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo auginamos 37 ° C drėgnoje 5% CO _{2/95% oro atmosferoje RPMI1640 papildytas 25 mm HEPES, 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (GE Healthcare Life Science, Pietų Logan UT, JAV) ir penicilino /streptomicino 100 mikrogramų /ml (Sigma-Aldrich, St Louis, Misūrio valstija, JAV). DMEM (GE Healthcare "Life Science) vidutinio papildytas 10% FBS ir penicilino 100 mikrogramų /ml /streptomicino buvo naudojamas HFE145 kultūrą. Ląstelės buvo pernešta su sirnr (siRNA) arba plakta (MKR) siRNR naudojant DhamaFECT reagentas 1 arba 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. siRNA sekas buvo taip: DPY30 siRNR dvipusis (ORF) (Bioneer, Tedžonas, Korėja), 5'-ŠMC UCU GAG UAC GGU CUC A (dTdT) -3 ", 5'-CUC UGA GUA CGG UCU ŠMC A (dTdT) -3 ", 5'-CUC ACU Aminorūgštis koduojančios sekos UCU AGG UAC U (dTdT) -3"; DPY30 siRNR dvipusis (3'-UTR) (Bioneer); 5'-CCG GAA AAC AGA ACC Aminorūgštis koduojančios sekos UUU UGG A (dTdT) -3 ", 5'-GAG GCA GCU UUA AUU Persijos rugpjūtis AUC A (dTdT) -3"; WDR5 siRNR dvipusis (Bioneer), 5'-GUC Cuu GUG ARG CUC GUC U (dTdT) -3 ", 5'-GUC GUG AUC Uca PPK GCU U (dTdT) -3", 5'-PVG AUU Bendrąjį vartotojo prieigą ACC UUC UUG U (dTdT) -3 "; RBBP5 siRNR dvipusis (Bioneer), 5'-GUG UGA AAA ggg CUC Agila A (dTdT) -3 ", 5'-PVG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3", 5'-GUG GUU GAG AUU Agila "AGA U (dTdT) -3 "; ASH2L siRNR dvipusis (Bioneer), 5'-GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) -3 ", 5'-UVG AGA PPK CCU GAA AUC A (dTdT) -3", 5'-GUC UAC Cuu Uca UGA CCA A (dTdT) -3 "; koduotų (MKR) siRNR (Thermo Scientific), 5'-Gau CCG CAA ARG AGC GAA A (dTdT) -3 ".}

DPY30 raiškos

DPY30 kDNR buvo klonuotas į pLenti6.3 -V5 /DEST vektorius (lentiviruso paskirties vektorius), naudojant vivo
rekombinacijos pagrindu Gateway klonavimo sistemą (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV). Donoras vektorius (pDONR221) slėpimas kDNR seka DPY30 buvo įsigytas iš Ultimate ORF klonų (INVITROGEN) ir atgamintas su kovos su pasirenkama ccdB pervežimas geno pLenti6.3-V5 /DEST naudojant LR clonase fermentų mišinys (Invitrogen). Tuščia vektorius pLenti6.3 /V5-DEST buvo naudojamas kaip juoktis kontrolę. Rekombinaciniai lentiviruses buvo pagaminta 293FT ląstelių, ir naudojamas užkrėsti SNU216 ir SNU638 ląsteles, pagal gamintojo nurodymus (ViraPower lentiviruso išraiška sistemą; INVITROGEN). DPY30 ekspresija stabilius ląstelės buvo nustatyta atrankos su blasticidin (7,5 mikrogramų /ml) (Invitrogen).

gelbėjimo tyrimų, mes keistas, po protokolą "RNAi trukdžių naudojant Tiksliosios Lenti ORF kolekciją" (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Trumpai tariant, ląstelės buvo užsikrėtę rekombinantinės lentiviruses (pLenti6.3-V5 /DEST ar DPY30-per konstruktų). Praėjus 24 valandoms po transdukcijos, laikmena virusas buvo pašalintas ir pakeistas visiškai mitybinės terpės. Kitą dieną, blasticidin buvo įtraukta esant 7,5 mikrogramo /ml koncentracijos. Ląstelės buvo prižiūrimi pagal atrankos šešias dienas, pakeičiant terpę arba persėjant kas 2-3 dienas, kaip reikia. Pasirinktos populiacijos kontrolės ląstelių ar ląstelių išreiškė DPY30 buvo naudojami transfekcijos eksperimentus su DPY30 siRNA orientacija atviras skaitymo rėmelis (ORF) arba 3'-neverstą regioną (UTR).

Realaus laiko PGR

Audinių mėginiai buvo paimti iš 23 nesusiję Korėjos pirminių skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kurie po chirurginės rezekcija esant Pusano nacionalinio universiteto ligoninės ir Pusano nacionalinio universiteto Yangsan ligoninės ir raštu informuoti sutikimą. Tyrimas patvirtino Pusano nacionalinio universiteto ligoninė institucijų priežiūros valdyba (PNUH-IRB) ir Pusano nacionalinio universiteto Yangsan ligoninė institucijų priežiūros valdyba (PNUYH-IRB). Iš viso RNR iš audinių ir ląstelių buvo paimti naudojant Trizol reagento (Invitrogen) arba RNeasy Mini komplektas (Qiagen, Valencia, CA, JAV), pagal gamintojo nurodymus. Kiekybinis realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (realaus laiko PGR) buvo naudojamas patikrinti DPY30 iRNR kiekį. kDNR buvo susintetinti su MMLV atvirkštinės transkriptazės (Promega Madison, WI, JAV), dNTP ir oligo-dT pradmenis. Grunto sekas, buvo taip: DPY30, 5'-AAC GCA GGT TGC "AGA" AAA TCC, T -3 "ir 5'-TCT GAT CCA GGT AGG ŠMC GAG -3"; WDR5, 5'-TGT BLSK TGG TGG GAA GTG GA -3 ir 5'-KTG TTG GGT GAA ARG KTG TT -3 "; RBBP5, 5'-AGT GCA ŠMC, ATC CAT CCA GT -3 "ir 5'-TBS PVG TCG BMT GAA" AGA AC -3 "; ASH2L, 5'-BLSK ARG AGC TGC ACG GTT TC -3 "ir 5'-CCA Persijos katė GTC AKTAS CAT AG" -3 "; GAPDH, 5'-TGG Persijos AGG AAA TBS CAT CK -3 "ir 5'-BTK AGC CCG AGT GGA AAT VS -3". Realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant LIGHTCYCLER ™ 96 realiojo laiko PGR sistema (Roche NUTLEY NJ) ir Faststart Eteriniai DNR Žalioji Master (Roche), pagal gamintojo nurodymus. GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės.

imunohistocheminis

imunohistocheminį dažymo su triušio anti-žmogaus DPY30 polikloninio antikūno (Sigma-Aldrich) buvo atliekamas su skrandžio vėžio audinių masyvo (n = 59) įsigyti nuo SUPER BIO CHIPS (Seulo) arba 4-mikrometrai skyriuose parafino įterptųjų egzempliorių. Trumpai tariant, po deparaffinization ir Rehidratacija, skaidres buvo gydomi 0,3% vandenilio peroksido 30 min slopina endogeninio peroksidazės aktyvumo, ir blokavo 10% normalaus asilas serumas (NDS) ir 1% BSA 1 × fosfatinio buferio druskų tirpalu (PBS). tada skaidres buvo inkubuojami per naktį 4 ° C blokuojančiu buferiu, kurių sudėtyje yra triušio anti-žmogaus DPY30 pirminį antikūną (1:80, Sigma-Aldrich). Antrinis antikūnas (HRP-konjuguoto) rišasi atliekamas praskiesto santykiu 1:: 200 blokuojančiu buferiu 2h kambario temperatūroje. Aptikimas buvo atliktas su HRP (Vector Laboratories) ir skaidres buvo counterstained apdorojant juos 1 min hematoksilinu dažymo buferis (Sigma-Aldrich).

ląstelių proliferacija tyrimas

Vieną dieną po transfekuoja ląsteles su siRNA, vidutinės buvo pakeistas 1% FBS terpę, ir po keturių dienų, buvo įtraukta 10 įxL EZ-Cytox (ITSBIO, Seulas) ir inkubuojami nuo 0,5 iki 2 val. Siekiant patikrinti, ar DPY30 raiškos poveikį ląstelių proliferaciją, ląstelės buvo pasėjamos 10% FBS terpę, o po trijų dienų kultūroje buvo įtraukta ir inkubuojami nuo 0,5 iki 2 val 10 įxL EZ-Cytox (ITSBIO). Mobilaus ryšio viabilities buvo nustatomas matuojant optinį tankį esant 450 nm, naudojant VICTOR3 kelis skaitytojus (PERKINELMER, MA, JAV).

Boyden kamera testas

keistas Boyden transwell kamera (Neurolingvistinis zondas, Gaithersburg, MD buvo naudojamas JAV). Apatinė kamera prisipildė 50 mikrol RPMI, kurių sudėtyje yra 10% FBS. Išnagrinėti poveikį DPY30 žinomas-žemyn, SNU1 ir SNU16 (ne gretimus ląstelių) buvo pernešta su ORF nukreipimą siRNA. Vieną dieną po to, kai transfekciją, ląstelės buvo išplauti, sustabdytas tankio 5 × 10 ^{5 ląstelių /ml 50 pL RPMI papildytas 0,5% FBS, ir pasėjamos į viršutinį kameroje. Norėdami pašalinti platinimo poveikį, buvo įtraukta mitomicino C (0,01 mikrogramo /ml, Sigma-Aldrich). Po to ląstelės buvo inkubuojami 24 val 37 ° C temperatūroje su 5% CO2. Iš migravo ląstelių skaičius buvo įvertintas suskaičiavus ląsteles dugno gręžinių. Išnagrinėti poveikį DPY30 raiškos, stabilios ląstelės (prisitvirtinę ląstelės; SNU216 ir SNU638) buvo naudojami. Ląstelių (juoktis ir DPY30-vyresni) buvo tripsinizuojamos ir pasėjamos esant 1 × 10 5 ląstelių /ml tankiui. Norėdami pašalinti platinimo poveikį, mitomicino C buvo pridėta. Ląstelės buvo leista pereiti keturias valandas, membranos buvo fiksuotas ir dažomi DA-Quik tirpalo (SYSMEX, Kobe, Japonija) ir nuplauti distiliuotu vandeniu. Mobilaus ryšio numeriai 10 atsitiktinai pasirinktose srityse buvo skaičiuojami naudojant šviesos mikroskopu. Eksperimentai buvo atliekami tris kartus.}

Matrigel invazija tyrimas

invazinės gebėjimai vėžinių ląstelių buvo vertinamas naudojant 8-mkm akyti BioCoat Matrigel kameriniai įdėklai (BD biologijos, San Chosė, CA, JAV). Vieną dieną po transfekciją su SCR arba DPY30 siRNA, ląstelės buvo tripsinizuojamos ir sustabdomas esant 5 × 10 ^{4 ląstelių /ml 500 įxL RPMI papildytas 0,5% FBS ir mitomicino C (0,01 mikrogramai /ml, Sigma tankio -Aldrich). tada ląstelės buvo įtraukta į kameros intarpais ir įdedamas į šulinių pripildytas 0,7 ml terpės, papildytoje 10% FBS kaip chemoattractant. Po inkubacijos 24 arba 48 val, ne invazija ląstelės ant membranos buvo ištrintas, grandymo, ir invazinės ląstelės dėl membranos apačioje buvo fiksuotas ir tamsintas su DA-Quik tirpalo (SYSMEX). Mobilaus ryšio numeriai 10 atsitiktinai pasirinktose srityse buvo skaičiuojami naudojant šviesos mikroskopu. Eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir ne mažiau kaip 5 laukai buvo skaičiuojami už eksperimentą.}

Statistinė analizė

Rezultatai išreikštas priemonėmis ± standartiniai nuokrypiai (TVS) trijų nepriklausomų eksperimentų. Skirtumų reikšmes buvo nustatyti naudojant Stjudento , T
-test nesusietus pastabas. P
vertės < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

išraiška DPY30 skrandžio vėžio audiniuose

Jei ištirti DPY30 išraiška žmogaus skrandžio vėžiu, Mes atlikome imunohistocheminis naudojant skrandžio vėžio audinių masyvo arba archyvinė parafino įterptųjų audinių atkarpas. Įprastomis skrandžio audinių, DPY30 išraiška buvo sunku aptikti (pav 1A), bet vėžiu audinių DPY30 baltymas buvo plačiai ekspresija (Pav 1B-1D). Pažymėtina, DPY30 buvo ekspresija į užplūsta skrandžio vėžio ląstelių (pav 1B-1d). Be to, mes nustatomas iRNR lygius DPY30 vienoje įamžino normalų skrandžio epitelio ląstelių linijos (HFE145) ir šešių skrandžio vėžio kilmės ląstelių linijas (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 ir NVI-N87), naudojant realaus laiko PGR. MRNR lygis DPY30 buvo gerokai didesnis (fold pokyčius > 5) SNU1 ir SNU16 nei HFE145 ląstelių, o ekspresijos lygį DPY30 į SNU216, SNU620 ir SNU638 buvo panašūs į HFE145 ląstelių ir buvo mažesnis (fold pokyčius > 10) NVI-N87 (pav 1E). Mes taip pat patikrino iRNR lygius DPY30 skrandžio vėžio audiniuose. DPY30 buvo labai išreikštas 15 atvejais (15/23, 65%), palyginti su sveikų audinių (pav 1f). Šie rezultatai rodo, kad DPY30 yra labai išreikštas tam tikrais žmogaus skrandžio vėžio.

Vaidmenys DPY30 į skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją

Siekiant nustatyti galimus vaidmenis DPY30 skrandžio vėžio ląsteles, mes pirmasis išjudinti žemyn DPY30 naudojant ORF-taikymo DPY30 siRNA ir stebėti savo triuškinantis efektyvumą realaus laiko PGR (pav 2A). ASR nukreipimą DPY30 siRNR (100 nm) sumažėjo iRNR lygį DPY30 į HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 ir SNU638 ląstelių, palyginti su plakta siRNA (SCR) 78%, 89%, 79%, 76%, o 88%, atitinkamai. Penkias dienas po transfekuoja ląsteles su SCR arba ASR nukreipimą siRNA, mes atliekame platinimo tyrimų. Nokdaunas iš DPY30 slopino HFE145, SNU1 ir SNU16 dauginimasis, palyginti su SCR 31%, 69% ir 71% atitinkamai, o nokdaunas nebuvo paveikti SNU216 ir SNU638 (pav 2b) dauginimasis, kurioje išraiška lygis DPY30 buvo mažas (pav 1E). Be to, mes gaminami DPY30-ekspresija ląstelių linijas (DPY30-Over) per HFE145, SNU216 ir SNU638 ląsteles, o tada palyginti DPY30 iRNR kiekį juoktis ląstelių (kontrolės) ir DPY30 apvirtimo ląsteles. Realaus laiko PGR rezultatai parodė, kad pasakymas lygis DPY30 buvo 4,2, 3,5 ir 3,2 karto didesnis DPY30 ekspresija HFE145, SNU216 ir SNU638 ląsteles nei juoktis ląstelių, atitinkamai (pav 2a). DPY30 raiškos sustiprino HFE145, SNU216 dauginimasis ir SNU638 ląsteles lyginant juoktis ląstelių 1,9, 2,2 ir 1,6 karto, atitinkamai (pav 2b).

Jei patvirtinti DPY30 siRNA specifiką, mes atliekame gelbėjimo eksperimentus. Dėl gelbėjimo eksperimentų, mes naudojamas DPY30 siRNR orientacija 3'-UTR vietoj ORF nes ORF nukreipimą siRNR taip pat gali pabloginti egzogeninės DPY30 ORF DNR Mes pristatėme. Superekspresuotų DPY30, mes transdukuojamos SNU1 ir SNU16 su virusinių dalelių, pLenti6.3-V5 /DEST (kontrolė) arba DPY30-ORF-virš konstruktai. DPY30-ekspresija SNU1 arba SNU16 ląstelės parodė didesnę raišką DPY30 2,1 arba 2,5 karto didesnę nei juoktis ląstelių, atitinkamai (pav 2C). ASR nukreipimą siRNR lėmė žemyn reguliavimo DPY30 ekspresijos lygį didesnis nei 75%, juoktis, taip pat DPY30-ekspresija ląsteles. 3'-UTR nukreipimą siRNA žemyn reglamentavo DPY30 ekspresiją didesnis nei 85%, juoktis ląsteles, kadangi į DPY30 ekspresija ląstelių, jis sumažėjo DPY30 išraišką iki tokio lygio, kuri yra panaši į MKR siRNR-perkeltų ląstelių ( pav 2C). Šis rezultatas rodo, kad egzogeninė DPY30-ASR DNR yra atspari 3'-UTR nukreipimas siRNA ir išreiškiamas panašaus lygio kaip ir endogeninio DPY30 mRNR. ASR nukreipimą siRNA slopinamas ląstelių proliferacija, neatsižvelgiant į egzogeninės DPY30 išraiškos (pav 2D). Proliferacija buvo slopinamas 3'UTR nukreipimą siRNA į juoktis ląstelių, tačiau jis buvo iš dalies slopinamas DPY30-ekspresija ląsteles. Be DPY30 ekspresija ląsteles, The ORF nukreipimą siRNR sumažino SNU1 ir SNU16 platinimu, palyginti su SCR siRNA 74% ir 66%, atitinkamai, tačiau 3'-UTR nukreipimą siRNR sumažėjo 20% ir 8%, atitinkamai , Šis rezultatas rodo, kad egzogeninė DPY30 gelbsti ginklų platinimo sukelta 3'-UTR nukreipimą siRNA slopinimas ir fenotipų sukelia DPY30 konkretaus siRNA nesate off-taikinio poveikis.

Kadangi DPY30 yra grandinių komponentų mes išnagrinėjo išraiškas ir vaidmenis kitų komponentų grandinių. Realaus laiko PGR parodė, kad iRNR lygiai WDR5 ir RBBP5 į SNU1, SNU16, SNU216 ir SNU638 buvo panašūs į HFE145. Tačiau, lygis mRNR ASH2L buvo žymiai didesnis (kartų kaita > 3) į SNU1 ir SNU16 negu HFE145 ląstelių (pav 3a) kaip DPY30 Fig 1E. Siekiant ištirti, ar WRAD komponentai yra susiję su dauginimusi skrandžio vėžio ląsteles, mes knockdowned kiekvieną WRAD komponentą naudojant konkretų siRNA ir stebima triuškinantis efektyvumą realaus laiko PGR (pav 3b). Kiekvienas siRNR (100 nM), sumažėjo iRNR lygiui SNU1 ir SNU16 ląstelių, palyginti su SCR 65% -75%. Nokdaunas iš WDR5 ir RBBP5 slopino SNU1 ir SNU16 ląstelių proliferaciją, palyginti su SCR iki 30-48% (pav 3C). Tačiau ASH2L slopino SNU1 ir SNU16 proliferaciją, kurioje išraiška lygis ASH2L buvo didelis, palyginti su SCR 85% ir 75%, atitinkamai.

Vaidmenys DPY30 į migraciją ir invazijos į skrandžio vėžinės ląstelės

kitas išnagrinėti, ar DPY30 reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių migraciją. Nokdaunas iš DPY30 sumažėjo FBS sukelta migracija iš SNU1 ir SNU16 ląstelių, palyginti su SCR atitinkamai 35% ir 45%, atitinkamai (4 pav). Priešingai, DPY30 raiška padidėjo FBS sukelta migracija iš SNU216 ir SNU638 ląsteles lyginant juoktis ląstelių 2.5 ir 2.2 karto, atitinkamai (4 pav). Šie rezultatai paskatino mus išnagrinėti DPY30 vaidmenį skrandžio vėžio ląstelių invaziją. Be Matrigel invazijos metodu, DPY30 siRNR slopinamas FBS sukeltos pažeidžiančių SNU1 ir SNU16 ląstelių, palyginti su SCR siRNA 65% ir 84%, atitinkamai (pav 5A ir 5c). Be to, DPY30 raiška padidėjo FBS sukeltos pažeidžiančių SNU216 ir SNU638 ląstelių, lyginant juoktis ląstelių 3.2 ir 2.9 karto, atitinkamai (pav 5B ir 5C). Šie rezultatai rodo, kad DPY30 skatina migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląsteles.

Diskusijos

Vaidmenys DPY30 vėžio biologijos buvo blogai apibūdina nors jos vaidmenų diferenciacijos ESRT ir kraujodaros kamieninių ląstelių buvo buvo pranešė, [10, 12]. Šioje studijoje, mes parodė naujus vaidmenis DPY30 skrandžio vėžio. DPY30 yra stiprinama (duomenys neparodyta) ir labai išreikštas (1 pav) kai kuriais skrandžio vėžio audiniuose. Be to, jos nokdaunas arba padidėjusi reglamentavo dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio vėžio ląsteles. Pasikeitimai išraiškos, TRANSLOKACIJA ir somatinės mutacijos genuose koduojančių subvienetų SET1 /MGL kompleksų buvo pranešta apie daugelį vėžio. Šie rezultatai patvirtina kritinių vaidmenis nariai SET1 /MGL komplekso vėžio progresavimą.

Up-reguliavimo DPY30 išraiška buvo stebimas tik SNU1 ir SNU16 skrandžio vėžio ląsteles tarp šešių skrandžio vėžio ląstelių mes išnagrinėjome. Tačiau jos iki reguliavimas buvo stebimas daugiau nei pusė skrandžio vėžio audiniuose mes išnagrinėjome (1 pav). Sunku paaiškinti šį neatitikimą. Tačiau, ji yra akivaizdu, kad skrandžio vėžio audinių numeris mes išnagrinėjome yra ne pakankamai. Taigi, platus išraiška tyrimas, naudojant daug daugiau skaičių audiniuose turi įvertinti klinikinę vertę ateityje.

Vaidmenys SET1 /MGL H3K4 metiltransferazė kompleksas vėžio biologija yra sudėtinga. Reguliavimo padaliniai SET1 /MGL kompleksų, įskaitant WRAD, yra tiek stiprus oncoproteins ir naviko slopintuvai. Pavyzdžiui, MEN1 genas koduoja Menin, neatskiriamą subvienetą MLL1 ir MLL2, ir mutavo pacientams su dauginių endokrininių navikų 1 tipo (MEN1) [18, 19]. Be to, Menin reguliuoja P18 (CDKN2C) ir p27 (CDKN1B) įdarbinant MLL1 kompleksas [20]. Priešingai, WDR5, iš WRAD komplekso komponentas, buvo pranešė, kad veikti kaip prostatos vėžio oncoprotein, į kurią jis yra aktyvuojami ir labai Androgeno sukeltas proliferacijos vėžinių ląstelių [21]. ASH2L, kuris yra dar vienas WRAD komplekso komponentas ir gali sąveikauti su oncoprotein MYC [22], yra labai svarbus Myc /ha-RAS-priklausomo transformacijos žiurkė embriono fibroblastų. Be to, ji yra aktyvuojami daugelio rūšių auglių ir yra labai svarbi navikinių ląstelių proliferaciją [23]. Šioje studijoje, mes parodė vaidmenis DPY30 kaip skrandžio vėžio oncoprotein.

Kas yra molekuliniai mechanizmai pagrindinės vaidmenis DPY30 skrandžio vėžio? Nors mes neatskleidė, keletas hipotezių gali būti siūloma remiantis ankstesniais tyrimais. Vienas iš galimų hipotezių yra ta, kad DPY30 raiškos veda į onkogenų overexpressions per padidėjusios H3K4MT veikla. Išeikvojimas DPY30 ar ASH2L veda į H3K4me3 sumažėjo, o WDR5 ir RBBP5 yra svarbus visoms trims rūšių H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 ir H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Be to, DPY30 raiškos vieni gali padidinti H3K4MT veiklą [10]. Nuo H3K4me2 /3 yra aktyvus ženklas transkripcijos [3, 24], padidėjo H3K4MT gali tiesiogiai upregulate daug genų, pavyzdžiui,, onkogenų, arba alternatyviai netiesiogiai žemyn reguliuoti auglio slopintuvai. Vienas ankstesnės ataskaitos remti šią hipotezę yra tas, kad ASH2L, kritinis komponentas SET1 /MGL komplekso, buvo įrodyta, kad žaisti kaip oncoprotein [25, 26]. Kitas ankstesnės ataskaitos yra tai, kad DPY30 tiesiogiai aktyvina id baltymų raišką per H3K4 metilinimo [13, 27]. ID baltymai slopina veiklą ETS1 ir ETS2 kuris gali sukelti vienas iš auglio slopinamojo geno, P16. Šiame tyrime mes parodėme, kad komponentai WRAD (WDR5, RBBP5 ir ASH2L) gali slopinti platinimu skrandžio vėžio ląsteles (3 pav), o tai rodo, kad DPY30 veikia per padidėjusio H3K4MT veikla. Daugiau studijos privalo atskleisti mechanizmus, sukeliančius su DPY30 vaidmenis skrandžio vėžio ląsteles.

• PLoS ONE: analizė nereguliuojamoje mikro RNR ir savo tikslinę genų skrandžio vėžio
• PLoS ONE: MED30 Reguliuoja platinimu ir judrumas skrandžio vėžio Cells