PLoS: Rol van DPY30 in de proliferatie en motiliteit van maagkanker Cells

Samenvatting

Verschillende soorten histon methylatie zijn geassocieerd met de progressie van kanker. Afhankelijk van de methylering site histon eiwitten, de effecten op transcriptie zijn verschillend. DPY30 is een gemeenschappelijk lid van SET1 /MLL histone H3K4 methyltransferase complexen. Echter, de expressie en rollen in maagkanker zijn slecht gekarakteriseerd. Om te bepalen of DPY30 heeft pathofysiologische rol bij maagkanker, de expressie en rollen werden onderzocht. Immunohistochemie en real time PCR toonde opwaartse regulatie van expressie in bepaalde DPY30 maagkanker cellijnen en weefsels van patiënten. De knockdown van siRNA verlaagde de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen, terwijl de overexpressie toonde de tegengestelde effecten. Deze resultaten geven aan dat DPY30 heeft cruciale rol bij de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen, en suggereren DPY30 kan een therapeutisch doelwit bij maagkanker

Citation:. YJ Lee, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) Rollen van DPY30 in de verspreiding en de beweeglijkheid van maagkanker Cells. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10.1371 /journal.pone.0131863

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 3 maart 2015; Aanvaard: 8 juni 2015; Gepubliceerd: 6 juli 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de Bio & Medical Technology Development Program (É2M3A9C6050213, OSO) en Basic Science Research Foundation (É2R1A1A3010521, HME) van de National Research Foundation (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MEST), en door een subsidie ​​van het Nationaal R & D-programma voor Cancer control, Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Gezin, de Republiek Korea (\0050, OSO). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Covalente modificaties van histone staarten, zoals acetylatie, fosforylatie, ubiquitinatie, en methylatie, moduleren chromatinestructuur en centrale rol in de regulatie van cel-cyclus progressie gentranscriptie, DNA herstel, embryonale ontwikkeling en celdifferentiatie [1, 2]. Hoewel sterkere histonacetylering algemeen geassocieerd met transcriptionele activering wordt de methylatie van histon gecorreleerd met transcriptionele activatie en repressie. Zo wordt methylatie van histon H3 op lysine 9, 20 of 27 residuen (H3K9, H3K20 of H3K27) betrokken bij transcriptionele genuitschakeling, maar anderzijds wordt methylatie op H3K4, H3K36 of H3K79 geassocieerd met open chromatine en actieve gentranscriptie [3].

In zoogdieren, mono-, di- en tri-methylatie van H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 en H3K4me3) wordt geleverd door zes verschillende SET1 /MLL familie complexen (SET1A, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3 en MLL4) [4, 5]. Deze H3K4 methyltransferases (H3K4MT) bevatten verschillende katalytische subeenheden, en de activiteiten van alle zes familie complexen worden gecontroleerd door gemeenschappelijke multi-subunit kerncomponenten, die WDR5, RBBP5, ASH2L en DPY30, omvatten en worden ook wel aangeduid als WRADs. [6-9]. Een verlies van elke subunit van WRAD complex resulteert in verminderde H3K4 methylatie. WDR5 en RBBP5 zijn van cruciaal belang voor alle drie soorten van methylatie van H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 en H3K4me3), terwijl ASH2L en DPY30 vooral nodig zijn voor H3K4me3 [6, 8, 10, 11].

DPY30 is een lid van alle menselijke SET1 /MLL-complexen, en is vereist voor een volledige SET1 /MLL methyltransferase activiteit [10, 12]. DPY30 is betrokken bij de differentiatie potentieel van embryonale stamcellen (SER) langs de neuronale linage [10] en is essentieel voor een juiste differentiatie en proliferatie van hemopoëtische progenitorcellen [12]. Bovendien, uitputting van DPY30 zorgt ervoor dat cellen een veroudering-achtige toestand te komen en p16 (CDKN2A) en p15 (CDKN2B), die rechtstreeks betrokken zijn bij veroudering [13] upregulate.

Maagkanker is een van de toonaangevende oorzaken van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [14]. Hoewel recente diagnostische en therapeutische vooruitgang bieden uitstekende overleving van patiënten met vroege maagkanker, wordt de ziekte meestal gediagnosticeerd in een laat stadium, wanneer de prognose slecht [15]. Maagkanker omvat de geleidelijke accumulatie van verschillende genetische en epigenetische veranderingen, die leiden tot gain-of-functie van oncogenen en het verlies van functie van tumorsuppressorgenen. Aangezien gentranscriptie sterk afhankelijk van chromatinestructuur, gewijzigde of abnormale histon methylatie wordt doorgaans geassocieerd met tumorprogressie en prognose van kanker [16], en hoewel de status van histon methylatie is goed beschreven in vele soorten kanker, dit aspect onduidelijk bij maagkanker [16, 17].

in deze studie te bepalen of DPY30 heeft pathofysiologische rol bij maagkanker, de expressie en rollen onderzocht.

Materialen en Werkwijzen

Cell cultuur en siRNA transfectie

de maag-kanker afgeleide cellijnen, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 en NCI-N87 werden aangekocht van de Koreaanse Cell Line Bank (Seoul). De maag epitheliale cellijn, HFE145 werden begaafd van professor Hassan Ashktorab (Howard University). De maagkanker cellijnen werden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO _{2/95% lucht atmosfeer in RPMI1640 gesupplementeerd met 25 mM HEPES, 10% foetaal runderserum (FBS) (GE Healthcare Life Science, South Logan , UT, USA) en 100 ug /ml penicilline /streptomycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). DMEM (GE Healthcare Life Science) medium aangevuld met 10% FBS en 100 ug /ml penicilline /streptomycine werd gebruikt voor HFE145 cultuur. Cellen werden getransfecteerd met kleine interfererende RNA (siRNA) of vervormd (SCR) siRNA gebruikt DhamaFECT reagens 1 of 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, USA) volgens de instructies van de fabrikant. siRNA sequenties waren als volgt: DPY30 siRNA-duplex (ORF) (Bioneer, Daejeon, Zuid-Korea), 5'-CAC UCU GAG UAC GGU CUC A (dTdT) -3 ', 5'-CUC UGA GUA CGG UCU CAC A (dTdT) 3 ', 5'-CUC ACU UAU UCU AGG UAC U (dTdT) -3'; DPY30 siRNA-duplex (3'-UTR) (Bioneer); 5'-CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) -3 ', 5'-GAG GCA GCU UUA AUU GCC augustus AUC A (dTdT) -3'; WDR5 siRNA-duplex (Bioneer), 5'GUC CUU GUG AAG CUC GUC U (dTdT) -3 ', 5'-GUC GUG AUC UCA ACA GCU U (dTdT) -3', 5'-CAG AUU CUA ACC UUC UUG U (dTdT) -3 '; RBBP5 siRNA-duplex (Bioneer), 5'GUG UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3 ', 5'-CAG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3', 5'-GUG GUU GAG AUU AGU AGA U (dTdT) -3 '; ASH2L siRNA-duplex (Bioneer), 5'-GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) -3 ', 5'-CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) -3', 5'-GUC UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) -3 '; scrambled (SCR) siRNA (Thermo Scientific), 5'-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '.}

DPY30 overexpressie

De DPY30 cDNA werd gekloond in pLenti6.3 -V5 /DEST vector (lentivirale bestemming vector) met behulp van de in vivo
-recombinatie gebaseerde Gateway klonen systeem (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De donor vector (pDONR221) herbergen van de cDNA-sequentie van DPY30 werd gekocht van Ultimate ORF Clones (Invitrogen), en gecombineerd met de contra-selecteerbare ccdB
gen pLenti6.3-V5 /DEST behulp van LR clonase enzymmengsel (Invitrogen). De lege vector pLenti6.3 /V5-DEST werd gebruikt als een mock controle. Recombinant lentivirussen werden geproduceerd in 293FT cellen en gebruikt om SNU216 en SNU638 cellen infecteren, volgens de instructies van de fabrikant (ViraPower Lentivirale Expression System, Invitrogen). DPY30-overexpressie stabiele cellen werden vastgesteld door selectie met blasticidine (7,5 ug /ml) (Invitrogen).

Voor rescue assays, we gewijzigd, volgde een protocol 'RNAi interferentie met behulp van Precision Lenti ORF collectie' (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). In het kort werden de cellen geïnfecteerd met recombinant lentivirussen (pLenti6.3-V5 /DEST of DPY30-over constructen). 24 uur na transductie, de media die virus verwijderd en vervangen door volledig kweekmedium. De volgende dag, Blasticidine werd bij een concentratie van 7,5 ug /ml toegevoegd. De cellen werden onder selectie gedurende zes dagen, vervangen of medium elke 2-3 dagen doorkweken zoals nodig. De geselecteerde populaties van cellen of cellen die DPY30 werden gebruikt voor transfectie-experimenten met DPY30 siRNA gericht op het open leeskader (ORF) of 3'-onvertaalde gebied (UTR).

Real-time PCR

Tissue monsters werden verkregen uit 23 ongerelateerde Koreaanse primaire maagkanker patiënten die chirurgische resectie ondergingen bij Pusan ​​National University Hospital en Pusan ​​National University Hospital Yangsan en mits schriftelijke toestemming. De studie werd goedgekeurd door de Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) en de Pusan ​​National University Hospital Yangsan-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Totaal RNA uit weefsels en cellen werden geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen) of een RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve Real-time PCR (real-time PCR) werd gebruikt om mRNA DPY30 te controleren. cDNA's werden gesynthetiseerd met MMLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA), dNTP en oligo-dT primers. De primersequenties waren als volgt: DPY30, 5'-AAC TGC AGA GCA GGT AAA TCC T -3 'en 5'- GAT CCA TCT GGT AGG CAC GAG -3'; WDR5, 5'-TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 en 5'- CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT -3 '; RBBP5, 5'AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3 'en 5'-TCA CAG TCG CCT GAA AGA AC-3'; ASH2L, 5'-TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC-3 'en 5'-CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG -3'; GAPDH, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 'en 5'-CTC AGC AGT CCG GGA AAT GG -3'. Real-time PCR werd uitgevoerd met een LightCycler ™ 96 real-time PCR systeem (Roche, Nutley, NJ) en FastStart DNA Essentiele Green Master (Roche) volgens de instructies van de fabrikant. GAPDH werd gebruikt als een interne controle.

Immunohistochemie

Immunohistochemische kleuring met konijn anti-humaan DPY30 polyklonaal antilichaam (Sigma-Aldrich) werd uitgevoerd op een maagkanker weefselarray (n = 59) gekocht van SUPER BIO CHIPS (Seoul) of 4-um secties van in paraffine ingebedde monsters. Kort na deparaffinisatie en rehydratatie werden de glaasjes behandeld met 0,3% waterstofperoxide gedurende 30 minuten om endogene peroxidase activiteit te remmen en geblokkeerd met 10% normaal serum ezel (NDS) en 1% BSA in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). De objectglaasjes werden vervolgens gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C in blokkerende buffer met een konijn anti-humaan DPY30 primair antilichaam (1:80, Sigma-Aldrich). Secundair antilichaam (HRP-geconjugeerd) binding werd uitgevoerd bij een verdunning van 1: 200 in blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Detectie werd uitgevoerd met HRP (Vector Laboratories) en objectglaasjes werden tegengekleurd door ze gedurende 1 minuut met hematoxyline kleuring buffer (Sigma-Aldrich).

celproliferatie assay

Een dag na transfectie van cellen met siRNA, werd het medium vervangen door 1% FBS medium en vier dagen later werd 10 pl Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) werd toegevoegd en gedurende 0,5 tot 2 uur. Om het effect van overexpressie DPY30 op celproliferatie controleren, werden cellen gezaaid in 10% FBS medium en na drie dagen kweken 10 pl Ez-Cytox (ITSBIO) werd toegevoegd en gedurende 0,5 tot 2 uur. Cel levensvatbaarheid werd bepaald door absorptie bij 450 nm met behulp VICTOR3 meerdere lezers (PerkinElmer, MA, USA).

Boyden kamer assay

Een gemodificeerd Boyden kamer transwell (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) werd gebruikt. De onderste kamer werd gevuld met 50 ui RPMI dat 10% FBS. Om effecten van DPY30 bekende-down, SNU1 en SNU16 (niet-hechtende cellen) te onderzoeken werden met de ORF-targeting siRNA. Eén dag na transfectie werden de cellen gewassen, gesuspendeerd in een dichtheid van 5 x 10 ^{5 cellen /ml in 50 ul RPMI aangevuld met 0,5% FBS, en gezaaid in de bovenste kamer. Om de effecten van proliferatie verwijderen, mitomycine C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich) toegevoegd. De cellen werden vervolgens gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2. Het aantal gemigreerde cellen werd geëvalueerd door telling cellen in putjes bodem. Om effecten van overexpressie DPY30 onderzoekt de stabiele cellen (hechtende cellen, SNU216 en SNU638) gebruikt. Cellen (mock en DPY30-over) getrypsiniseerd en uitgezet met een dichtheid van 1 x 10 5 cellen /ml. Om de effecten van proliferatie verwijderen werd mitomycine C toegevoegd. Men liet de cellen migreren gedurende vier uur werden de membranen gefixeerd en gekleurd met Diff-Quik-oplossing (Sysmex, Kobe, Japan) en gewassen met gedestilleerd water. Cel aantallen in 10 willekeurig gekozen velden werden geteld met behulp van een lichtmicroscoop. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.}

Matrigel invasie assay

De invasieve vermogen van kankercellen werden beoordeeld met 8 urn poreuze BioCoat Matrigel kamer inserts (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Eén dag na transfectie met SCR of DPY30 siRNA, werden cellen getrypsiniseerd, en gesuspendeerd bij een dichtheid van 5 x 10 ^{4 cellen /ml in 500 pl RPMI aangevuld met 0,5% FBS en mitomycine C (0,01 ug /ml, Sigma -Aldrich). Cellen werden daarna toegevoegd aan kamer inserts en geplaatst in putjes gevuld met 0,7 ml medium, aangevuld met 10% FBS als chemoattractant. Na incubatie gedurende 24 of 48 uur werden de niet-binnendringende cellen bovenop het membraan verwijderd door schrapen en invasieve cellen op de bodem van het membraan werden gefixeerd en gekleurd met Diff-Quik-oplossing (Sysmex). Cel aantallen in 10 willekeurig gekozen velden werden geteld met behulp van een lichtmicroscoop. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en ten minste 5 velden werden geteld per experiment.}

Statistische analyse

De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviaties (SD's) van drie onafhankelijke experimenten. De betekenissen van de verschillen werden bepaald met behulp van de Student's t
-test voor ongepaarde waarnemingen. P
waarden van < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Expressie van DPY30 bij maagkanker weefsels

Om DPY30 expressie te onderzoeken in menselijke maagkanker, voerden we immunohistochemie met behulp van een maagkanker weefsel-array of archiveringsdoeleinden paraffine ingebedde weefselcoupes. In normale gastrische weefsels werd expressie DPY30 moeilijk op te sporen (figuur 1A), maar in kankerweefsel DPY30 eiwit werd sterk tot overexpressie gebracht (Figuur 1B-1D). Met name DPY30 werd overexpressie in binnendringende maagkanker cellen (Figuur 1B-1D). Verder hebben we bepaald mRNA-niveaus van DPY30 in één vereeuwigd normale maag epitheel cellijn (HFE145) en zes maag-kanker afgeleide cellijnen (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 en NCI-N87) met behulp van real-time PCR. Het mRNA niveau van DPY30 was aanzienlijk hoger (fold change > 5) in SNU1 en SNU16 dan in HFE145 cellen, terwijl de expressie niveau van DPY30 in SNU216, SNU620 en SNU638 was vergelijkbaar met die in HFE145 cellen en was lager (fold change > 10) in NCI-N87 (figuur 1E). Wij checkten mRNA niveaus van DPY30 bij maagkanker weefsels. DPY30 was sterk tot expressie gebracht in 15 gevallen (15/23, 65%) in vergelijking met normale weefsels (Figuur 1F). Deze resultaten geven aan dat DPY30 hoog tot expressie in sommige menselijke maagkanker.

Rollen van DPY30 in de proliferatie van maagkanker cellen

Om mogelijke rollen van DPY30 bij maagkanker cellen te bepalen, we eerste knock-down DPY30 met behulp van de ORF-targeting DPY30 siRNA en bewaakt de knock-down-efficiëntie met real-time PCR (figuur 2A). De ORF-targeting DPY30 siRNA (100 nm) daalde het mRNA niveau van DPY30 in HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 en SNU638 cellen in vergelijking met scrambled siRNA (SCR) met 78%, 89%, 79%, 76%, en 88%, respectievelijk. Vijf dagen na transfectie van cellen met SCR of ORF-siRNA gericht, voerden wij proliferatie assays. Knockdown van DPY30 remde de proliferatie van HFE145, SNU1 en SNU16 vergeleken met SCR met 31%, 69% en 71% respectievelijk, terwijl de knockdown geen invloed op de proliferatie van SNU216 en SNU638 (figuur 2B), waarbij het expressieniveau van DPY30 laag was (fig 1E). Vervolgens produceerden we DPY30 tot overexpressie cellijnen (DPY30-over) met behulp van HFE145, SNU216 en SNU638 cellen, en vervolgens vergeleken DPY30 mRNA niveaus in mock-cellen (controle) en DPY30-over cellen. Real-time PCR resultaten toonden dat het expressieniveau van DPY30 was 4,2, 3,5 en 3,2 maal hoger bij DPY30-overexpressie HFE145, SNU216 en SNU638 cellen dan mock cellen (Fig 2A). DPY30 overexpressie verbeterde de proliferatie van HFE145, SNU216 en SNU638 cellen versus mock-cellen met 1,9, 2,2 en 1,6 maal, respectievelijk (figuur 2B).

Om de specificiteit van DPY30 siRNA te bevestigen, voerden we de redding experimenten. Voor de redding experimenten, gebruikten we een DPY30 siRNA gericht 3'-UTR plaats van ORF, omdat de ORF-targeting siRNA ook de exogene DPY30 ORF DNA introduceerden we kunnen afbreken. Om DPY30 overexpressie, we getransduceerd SNU1 en SNU16 met virusdeeltjes, pLenti6.3-V5 /DEST (controle) of DPY30-ORF-over constructies. DPY30-overexpressie SNU1 of SNU16 cellen vertoonden hogere expressie van DPY30 2,1 of 2,5 maal hoger dan mock cellen, respectievelijk (Fig 2C). De ORF-targeting siRNA tot neerwaartse regulering van DPY30 expressieniveaus met meer dan 75% in mock en DPY30-overexpressie cellen. De 3'-UTR-targeting siRNA down-gereguleerd de DPY30 expressie door meer dan 85% in mock cellen, terwijl in de DPY30 overexpressie cellen, daalde de DPY30 expressie tot een niveau dat vergelijkbaar is met dat van SCR siRNA-getransfecteerde cellen ( figuur 2C). Dit resultaat geeft aan dat de exogene DPY30-ORF DNA is bestand tegen de 3'-UTR-targeting siRNA en wordt uitgedrukt op een vergelijkbaar niveau met dat van endogeen DPY30 mRNA. De ORF-targeting siRNA remde proliferatie van cellen ongeacht de exogene expressie DPY30 (figuur 2D). Proliferatie werd ook geremd door de 3'UTR-targeting siRNA in mock-cellen, maar het was gedeeltelijk geremd in DPY30-overexpressie cellen. In DPY30-cellen tot overexpressie brengen, de ORF-targeting siRNA verlaagde de proliferatie van SNU1 en SNU16 vergeleken met SCR siRNA met 74% en 66%, respectievelijk, maar de 3'-UTR-gericht siRNA daalde met 20% en 8%, respectievelijk . Dit resultaat geeft aan dat exogeen DPY30 redt de remming van proliferatie geïnduceerd door de 3'-UTR-gericht siRNA en de fenotypen door DPY30 specifieke siRNA niet off-target effecten.

Omdat DPY30 is een component van afdelingen onderzochten we uitingen en de rol van andere onderdelen van afdelingen. Real-time PCR toonde aan dat mRNA niveaus van WDR5 en RBBP5 in SNU1, SNU16, SNU216 en SNU638 waren vergelijkbaar met die van HFE145. Echter, het mRNA niveau van ASH2L waren significant hoger (fold change > 3) in SNU1 en SNU16 dan in HFE145 cellen (Fig 3A) als DPY30 in figuur 1E. Om te onderzoeken of WRAD componenten geassocieerd zijn met proliferatie van cellen maagkanker, we knockdowned WRAD elke component via hun specifieke siRNA en gecontroleerd knockdown efficiëntie door real-time PCR (Figuur 3B). Elke siRNA (100 nM) verlaagde de mRNA niveaus in SNU1 en SNU16 cellen vergeleken met SCR met 65% -75%. Knockdown van WDR5 en RBBP5 remde de proliferatie van SNU1 en SNU16 cellen vergeleken met SCR met 30-48% (Figuur 3C). Echter, ASH2L remde de proliferatie van SNU1 en SNU16, waarbij het expressieniveau van ASH2L was hoog, vergeleken met SCR met 85% en 75%, respectievelijk.

Rollen van DPY30 bij de migratie en invasie van gastrische kankercellen

We volgende onderzocht of DPY30 regelt de migratie van maagkanker cellen. Knockdown van DPY30 verlaagde de FBS-geïnduceerde migratie van SNU1 en SNU16 cellen versus SCR met 35% en 45%, respectievelijk (figuur 4). Daarentegen DPY30 overexpressie verhoogde de FBS-geïnduceerde migratie van SNU216 en SNU638 cellen versus cellen mock van 2,5 en 2,2 maal, respectievelijk (figuur 4). Dit resultaat leidde ons naar de rol van DPY30 bij de invasie van maagkanker cellen onderzocht. In een Matrigel invasie assay DPY30 siRNA remde de FBS geïnduceerde invasies van SNU1 en SNU16 cellen versus SCR siRNA met 65% en 84%, respectievelijk (Fig 5A en 5C). Bovendien DPY30 overexpressie verhoogde de FBS-geïnduceerde invasies van SNU216 en SNU638 cellen versus mock-cellen met 3,2 en 2,9 maal, respectievelijk (Fig 5B en 5C). Deze resultaten tonen dat DPY30 bevordert de migratie en invasie van maagkanker cellen.

Discussie

Rollen van DPY30 in kankerbiologie zijn slecht gekarakteriseerd hoewel zijn rol in differentiatie SER en hematopoietische progenitorcellen had gemeld [10, 12]. In de huidige studie, toonden we nieuwe rollen van DPY30 bij maagkanker. DPY30 geamplificeerd (gegevens niet getoond) en sterk tot expressie (figuur 1) in sommige maagkanker weefsels. Bovendien zijn knockdown of overexpressie regelde de proliferatie, migratie en invasie van maagkanker cellen. Veranderingen in de expressie, chromosomale translocaties en somatische mutaties van genen die coderen voor subeenheden van SET1 /MLL complexen zijn bij talrijke kankers. Deze resultaten ondersteunen de cruciale rol van de leden van SET1 /MLL complex in de progressie van kanker.

Up-regulatie van DPY30 expressie werd alleen in SNU1 en SNU16 maagkanker cellen onder zes maagkanker cellen die we hebben onderzocht waargenomen. Echter up-regulation waargenomen bij meer dan de helft van maagkanker weefsel Wij hebben onderzocht (figuur 1). Het is moeilijk om deze discrepantie te verklaren. Het is echter duidelijk dat het aantal maagkanker weefsel Wij hebben onderzocht is niet genoeg. Dus, is een uitgebreide expressie studie met behulp van veel meer aantal weefsels nodig is om de klinische waarde in de toekomst te evalueren.

Rollen van SET1 /MLL H3K4 methyltransferase complex in de biologie van kanker is complex. Regulerende subeenheden van SET1 /MLL-complexen, met inbegrip van WRAD, bevatten zowel potent oncoproteïnen en tumor onderdrukkers. Bijvoorbeeld, de MEN1 gen codeert menin, integraal subeenheid van MLL1 en MLL2 en gemuteerd bij patiënten met multiple endocriene neoplasie type 1 (MEN1) [18, 19]. Bovendien menin reguleert p18 (CDKN2C) en p27 (CDKN1B) door het aantrekken van MLL1 complex [20]. Daarentegen WDR5, een component van WRAD complex, is gemeld om als oncoprotein van prostaatkanker, waarin het tot overexpressie wordt gebracht en cruciaal voor de androgeen geïnduceerde proliferatie van tumorcellen [21]. ASH2L, een andere component van WRAD complex en kan samenwerken met de oncoprotein MYC [22], is cruciaal voor de MYC /Ha-RAS-afhankelijke omvorming van rat fibroblasten. Bovendien wordt tot overexpressie gebracht in veel soorten tumoren en is essentieel voor de proliferatie van tumorcellen [23]. In de huidige studie, hebben we laten zien rollen van DPY30 als oncoprotein in de maagkanker.

Wat zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen rollen van DPY30 bij maagkanker? Hoewel we niet onthullen, kan verschillende hypotheses worden voorgesteld op basis van eerdere studies. Eén van de mogelijke hypotheses is dat DPY30 overexpressie leidt tot de overexpressions van oncogenen via verhoogde H3K4MT activiteit. Uitputting van DPY30 of ASH2L leidt tot een afname in H3K4me3, terwijl WDR5 RBBP5 en zijn cruciaal voor de drie soorten H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 en H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Bovendien kan de overexpressie van alleen DPY30 H3K4MT activiteit [10] te verhogen. Aangezien H3K4me2 /3 is een actieve markering voor transcriptie [3, 24], verhoogde H3K4MT mogelijkheid om direct vele genen, zoals oncogenen, of alternatief indirecte wijze reguleren tumor suppressors upregulate. Een eerdere rapport ondersteunt deze hypothese is dat ASH2L, een kritische component van SET1 /MLL complex, is aangetoond dat spelen als oncoprotein [25, 26]. Een ander vorige rapport is dat DPY30 direct activeert de uitingen van ID eiwitten via H3K4 methylering [13, 27]. ID eiwitten remde activiteiten van ETS1 en ETS2 die kan induceren een van de tumor suppressor gen p16. In de huidige studie hebben we aangetoond dat onderdelen van WRAD (WDR5, RBBP5 en ASH2L) proliferatie van maagkanker cellen (Figuur 3) kunnen remmen, wat erop wijst dat DPY30 handeling door de verhoogde H3K4MT activiteit. Meer studies zijn nodig om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de rol van DPY30 bij maagkanker cellen te onthullen.

• PLoS ONE: Analyse van ontregelde microRNA's en hun target genen bij maagkanker
• PLoS ONE: MED30 Regelt de verspreiding en de beweeglijkheid van maagkanker Cells