PLoS One: Szerepét DPY30 a és -motilitást a gyomorrák sejtek

absztrakt

Különböző típusú hiszton metiláció összefüggésbe hozták a rák progressziójának. Attól függően, hogy a metilezés helyszínen hiszton fehérjék, annak hatása a transzkripciós különböző. DPY30 közös tagja HALMAZ1 /MLL hiszton H3K4 metil komplexek. Azonban a kifejezés és szerepek gyomorrák már rosszul jellemzi. Annak megállapítására, hogy DPY30 van kórélettani szerepet gyomorrák, a véleménynyilvánítás és a szerepek vizsgáltuk. Immunhisztokémia és a valós idejű PCR mutatta, up-regulációját DPY30 expresszió bizonyos gyomor rákos sejtvonalban és a betegek szöveteiben. A leütés siRNS csökkentette a szaporodás, a migráció, és invázió gyomorrák sejtek, míg a túltermelése megmutatta az ellenkező hatást. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy DPY30 van kritikus szerepet töltenek be a proliferáció, migráció, és invázió gyomorrák sejtek, és azt sugallják, DPY30 lehet terápiás célpont a gyomorrák. Katalógusa

Citation: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) Szerepét DPY30 a és -motilitást gyomorrák sejtek. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10,1371 /journal.pone.0131863 katalógusa

Szerkesztő: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: március 3, 2015; Elfogadva: június 8, 2015; Megjelent: július 6, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Lee et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát segítette a Bio & Medical Technology Development Program (É2M3A9C6050213, OSO) és a Basic Science Research Foundation (É2R1A1A3010521, HME), a Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF) finanszírozza a koreai kormány (MEST), valamint a támogatás a Nemzeti R &D Program Rákellenes, egészségügyi Minisztérium, Szociális és Családügyi Minisztérium, a Koreai Köztársaság (\0050, OSO). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

kovalens módosítás a hiszton farok, mint például a, acetiláció, foszforiláció, ubikvitináció, és metilezés, modulálják a kromatin szerkezetének és döntő fontosságú szerepet játszanak a szabályozásában a sejtciklus progresszióját, gén transzkripció, a DNS-javítás, embrionális fejlődés, és sejtdifferenciálódás [1, 2]. Míg fokozott hiszton acetilezés általában társított transzkripciós aktiválás, a metilezése hiszton összefügg a transzkripciós aktivációs és elnyomás. Például metilezése hiszton H3 lizin 9., 20., vagy a 27. maradékok (H3K9, H3K20 vagy H3K27) részt vesz a transzkripciós géncsendesítés, de a másik viszont, metilezése H3K4, H3K36, vagy H3K79 társul nyitott kromatin és aktív gén transzkripció [3].

emlősök, mono-, di- és tri-metilezésével H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, és H3K4me3) végzi hat különálló SET1 /MLL család komplexek (SET1A, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3, és MLL4) [4, 5]. Ezek H3K4 metiltranszfe- (H3K4MT) tartalmaznak különböző katalitikus alegységek, valamint a tevékenységek mind a hat család komplexek által vezérelt közös többalegységes alapvető összetevők, amelyek magukban foglalják WDR5, RBBP5, ASH2L és DPY30, és szintén nevezik WRADs. [6-9]. A veszteség bármely alegységét WRAD komplex módon csökkentett H3K4 metiláció. WDR5 és RBBP5 alapvető fontosságú az összes háromféle metilezése H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, és H3K4me3), míg ASH2L és DPY30 elsősorban szükséges H3K4me3 [6, 8, 10, 11].

DPY30 egy tagja minden emberi SET1 /MLL komplexek, és szükséges a teljes SET1 /MLL metiltranszferáz aktivitást [10, 12]. DPY30 hozták összefüggésbe a differenciálódási potenciáljának embrionális őssejtek (gszt) mentén a neuronális sorok száma [10], és nélkülözhetetlen a megfelelő differenciálódását és proliferációját hematopoetikus progenitor sejtek [12]. Továbbá, az ózonréteg DPY30 hatására a sejtek meg egy öregedés-szerű állapot és upregulate p16 (CDKN2A) és p15 (CDKN2B), amelyek közvetlenül részt vesznek az öregedés [13]. Katalógusa

A gyomorrák egyik vezető oka a rák okozta halál világszerte [14]. Bár a legutóbbi diagnosztikai és terápiás vívmányok kiváló szenvedő betegek túlélési korai gyomorrák, a betegség általában diagnosztizálják késői szakaszában, amikor a prognózis rossz [15]. A gyomor carcinogenesis jár fokozatos felhalmozódása a különböző genetikai és epigenetikai változások, amelyek miatt szerezni funkció-onkogének által és a veszteség-of-function a tumor szupresszor gének. Továbbá, mivel a gén transzkripció erősen támaszkodik a kromatin struktúráját, megváltozott vagy abnormális hisztonmetiláció már jellemzően társuló tumor progresszió és a prognózis a rák [16], és bár a státusát a hiszton-metiláció leírták számos típusú rák, ez a szempont tisztázatlan maradt a gyomorrák [16, 17]. katalógusa

Ebben a vizsgálatban, annak megállapítása, hogy DPY30 van kórélettani szerepet gyomorrák, a véleménynyilvánítás és a szerepek vizsgáltuk. katalógusa

anyagok és módszerek

Sejtkultúra és siRNS transzfekció katalógusa

a gyomorrák-sejtvonalak, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, és az NCI-N87 vásároltunk a koreai sejtvonal Bank (Szöul). A gyomornyálkahártya sejtvonal HFE145 voltak tehetséges professzortól Hassan Ashktorab (Howard Egyetem). A gyomorrák sejtvonalakat tenyésztettünk 37 ° C-on, nedvesített, 5% CO _{2/95% levegő atmoszférában RPMI1640 egészítve 25 mM HEPES, 10% magzati borjúszérumot (FBS) (GE Healthcare Life Science, Dél Logan , UT, USA) és 100 ng /ml penicillin /sztreptomicint (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). DMEM (GE Healthcare Life Science) táptalajban, amely 10% FBS-sel és 100 ng /ml penicillin /sztreptomicint használtunk HFE145 kultúra. A sejteket transzfektáltuk a kis interferáló RNS-t (siRNS-t) vagy a kódolt (SCR) siRNS alkalmazásával DhamaFECT reagens 1 vagy 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, USA), a gyártó utasításai szerint. siRNS-szekvenciák a következők voltak: DPY30 siRNS duplex (ORF) (Bioneer, Daejeon, Korea), 5'-CAC UCU GAG UAC GGU CUC A (dTdT) -3 ', 5'-CUC UGA GUA CGG UCU CAC A (dTdT) 3 ', 5'CUC ACU UAU UCU AGG UAC U (dTdT) -3'; DPY30 siRNS duplex (3'-UTR) (Bioneer); 5'CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) 3 ', 5'-GAG GCA GCU UUA AUU GCC augusztus AUC A (dTdT) -3'; WDR5 siRNS duplex (Bioneer), 5'GUC CUU GUG AAG CUC GUC U (dTdT) 3 ', 5'GUC GUG AUC UCA ACA GCU U (dTdT) 3', 5'-CAG AUU CUA ACC UUC UUG U (dTdT) -3 '; RBBP5 siRNS duplex (Bioneer), 5'GUG UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) 3 ', 5'-CAG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) 3', 5'GUG GUU GAG AUU AGU AGA U (dTdT) -3 '; ASH2L siRNS duplex (Bioneer), 5'GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) 3 ', 5'-CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) 3', 5'GUC UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) -3 '; rántotta (SCR) siRNS (Thermo Scientific), 5'GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '. katalógusa}

DPY30 túltermelése katalógusa

A DPY30 cDNS-t pLenti6.3 -V5 /cÉL vektor (lentivirális célállomás vektor) a in vivo katalógusa rekombináció alapú Gateway klónozó rendszer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A donor vektor (pDONR221) hordozó cDNS szekvenciáját DPY30 vásárolt Ultimate ORF klónok (Invitrogen), és egyesítjük az ellen-szelekciós ccdB katalógusa génje pLenti6.3-V5 /DEST segítségével LR clonase enzim keverék (Invitrogen). Az üres vektor pLenti6.3 /V5-DEST használtunk MOCK ellenőrzés. Rekombináns lentivírusok gyártottak 293FT sejtekben, és fertőzésére alkalmaztuk SNU216 és SNU638 sejtek, a gyártó utasításai szerint (ViraPower lentivirális rendszer; Invitrogen). DPY30 overexpresszáló stabil sejteket létre szelekcióval Blasticidin (7,5 ng /ml) (Invitrogen). Katalógusa

A mentési vizsgálatok módosítottuk, majd a protokoll "siRNS interferencia segítségével Precision Lenti ORF gyűjtemény" (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Röviden, a sejteket fertőzünk rekombináns lentivírusok (pLenti6.3-V5 /DEST vagy DPY30-over konstrukciók). 24 órával a transzdukció, a média tartalmazó vírust eltávolítottuk és helyettesítettük komplett tápközegben. A következő napon, Blasticidin adtunk koncentrációban 7,5 ug /ml. A sejteket szelekciós körülmények között hat napig, felváltva közepes vagy passzálással 2-3 naponta, ha szükséges. A kiválasztott populációi kontroll sejtek vagy expresszáló sejtek DPY30 használtunk transzfekciós kísérletekben DPY30 siRNS célzás a nyitott leolvasási keret (ORF) vagy a 3'-nem transzlatált régió (UTR).

Real-time PCR

Tissue vettünk 23 független koreai primer gyomorrákos betegek átesett sebészi eltávolítását a Pusani Nemzeti Egyetemi Kórház és Pusani Nemzeti Egyetem Yangsan Kórház és írásos beleegyezését adta. A tanulmány által jóváhagyott Pusani Nemzeti Egyetemi Kórház-Institutional Review Board (PNUH-IRB), valamint a Pusan ​​Nemzeti Egyetem Yangsan Kórház-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). A teljes RNS-re szöveteket és sejteket extraháltuk Trizol reagens (Invitrogen), vagy egy RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) szerint a gyártó utasításainak megfelelően. Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (valós idejű PCR) alkalmaztunk, hogy ellenőrizze DPY30 mRNS szinteket. cDNS-eket szintetizáltuk MMLV reverz transzkriptáz (Promega, Madison, WI, USA), dNTP-t, és az oligo-dT láncindítók. A primer szekvenciák használhatók a következők voltak: DPY30, 5'-AAC GCA GGT TGC AGA AAA TCC T -3 'és 5'-TCT GAT CCA GGT AGG CAC GAG -3'; WDR5, 5'TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 és az 5'-CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT-3 '; RBBP5, 5'AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3 'és 5' TCA CAG TCG CCT GAA AGA AC-3 '; ASH2L, 5'TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC-3 'és 5' CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG-3 '; GAPDH, 5'TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'és 5' CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG-3 '. Real-time PCR-t végeztünk egy LightCycler ™ 96 Real-time PCR System (Roche, Nutley, NJ), és FastStart esszenciális DNS Zöld Master (Roche), a gyártó utasításai szerint. GAPDH használtuk belső kontrollként.

Immunhisztokémia

immunhisztokémiai festésre nyúl anti-humán DPY30 poliklonális antitesttel (Sigma-Aldrich) végeztük a gyomorrák szövet array (n = 59) vásárolt -től SUPER BIO-chipek (Szöul), vagy 4-um szakaszain paraffinba ágyazott mintákat. Röviden, miután deparaffinization és rehidratálás, csúszdák kezeltük 0,3% -os hidrogén-peroxid 30 percig, hogy gátolják az endogén peroxidáz aktivitás, és blokkoltuk 10% normál szamár-szérum (NDS), és 1% BSA-val 1 × foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). A lemezeket azután éjszakán át inkubáljuk 4 ° C-blokkoló pufferben tartalmazó nyúl anti-humán DPY30 primer antitesttel (1:80, Sigma-Aldrich). Másodlagos antitestet (HRP-konjugált) kötést végeztünk hígításban 1: 200 blokkoló pufferben 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük. Detektálás HRP (Vector Laboratories), és a tárgylemezeket ellenfestettük kezelni őket, 1 percig hematoxilin festést pufferrel (Sigma-Aldrich).

Cell proliferációs vizsgálati

Egy nap után sejtek transzfektálása siRNS-sel, a tápközeget helyettesítettük 1% FBS-t közepes és négy nappal később, 10 ul EZ-Cytox (ITSBIO, Szöul) adtunk hozzá, és inkubáltuk 0,5-2 órán át. Annak érdekében, hogy ellenőrizze a hatása DPY30 overexpressziója a sejtproliferációra sejtet oltottunk le 10% FBS tápközegben, és három nap után a kultúra, 10 ul EZ-Cytox (ITSBIO) adtunk hozzá, és inkubáltuk 0,5-2 órán át. Sejtéletképesség mérésével lettek meghatározva abszorbancia 450 nm-nél VICTOR3 többszörös olvasók (Perkin-Elmer, MA, USA).

Boyden-kamra vizsgálat

Egy módosított Boyden transwell kamrába (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) használtunk. Az alsó kamrába 50 ul RPMI, amely 10% FBS-t. Annak vizsgálata hatásait DPY30 ismert lefelé, SNU1 és SNU16 (nem tapadt sejtek) transzfektált az ORF-célzási siRNS. Egy nap a transzfektálás után a sejteket mostuk, felfüggesztett sűrűségben 5 × 10 ^{5 sejt /ml 50}

• PLoS One: Elemzés a szabályozatlan mikroRNS és a célzott gének Gyomor- Cancer
• PLoS One: MED30 Szabályozza a és -motilitást gyomorrák Cells