PLoS ONE: TWIST1 fördert Magenkrebs-Zellproliferation durch Hochregulation von FoxM1

Abstrakt

Twist-related protein 1 (TWIST1), auch als Klasse A bekannt basischen Helix-Loop-Helix-Protein 38 (bHLHa38) hat in Zelllinie Bestimmung und Differenzierung beteiligt. Frühere Studien zeigen, dass TWIST1 Ausdruck ist mit einer schlechten klinischen Ergebnisse bei Magenkrebs hochreguliert. Außerdem TWIST1 wird vorgeschlagen, in das Fortschreiten der menschlichen Magenkrebs beteiligt. Jedoch bleiben ihre biologischen Funktionen weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass Twist 1-Überexpression führt zu einer deutlichen Hochregulation von FoxM1, die eine Schlüsselrolle bei der Zellzyklus-Progression bei Magenkrebszellen spielt. Im Gegensatz dazu Knockdown Twist 1 reduziert FoxM1 Ausdruck, was darauf hindeutet, dass FoxM1 könnte eine direkte Transkriptionsziel von Twist 1. Auf molekularer Ebene sein, zeigen wir weiter, dass Twist 1 an die Promotorregion von FoxM1 binden konnte und anschließend p300 rekrutieren zu induzieren FoxM1 mRNA-Transkription. Daher aufdecken unsere Ergebnisse einer früheren unbekannt Twist 1 /FoxM1 Regulationsweg, die die Mechanismen von Magenkrebs Proliferation zu verstehen, kann dazu beitragen,

Citation:. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) TWIST1 fördert Magenkrebs-Zellproliferation durch Hochregulation von FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 31. Mai 2013; Akzeptiert: 3. September 2013; Veröffentlicht: 24. Oktober 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:.. Die Autoren, dass keine Interessenkonflikte bestehen erklärt haben

Einführung

Epithelial-mesenchymale-Transition (EMT) a Verfahren, bei dem Epithelzellen verlieren Polarität und Zell-Zell-Adhäsion und unterziehen dramatischen Remodellierung des Zytoskeletts [1,2]. Gleichzeitig mit Verlust von epithelialen Zelladhäsion und Zytoskelett-Komponenten, erfährt Zellen die Expression von mesenchymalen Komponenten und Migrations Phänotyp EMT erwerben [2,3].

Mehrere wichtige Induktoren von EMT sind Transkriptionsfaktoren, einschließlich Twist 1, Schnecke, und Slug, die E-Cadherin-Expression [4,5] drücken. TWIST1 gehört zur Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktor-Familie [6]. Zunächst wurde TWIST1 vorgeschlagen in der Entwicklung von aus dem Mesoderm abgeleiteten Gewebe wesentlich zu sein, einschließlich der Muskeln und osteogenen Zelllinien [7,8]. Nachfolgende Studien haben gezeigt, dass Twist 1 fördert EMT und spielt eine wesentliche Rolle bei der Metastasierung in mehreren Tumormodellen [9,10]. Die Expression von Twist 1 hat sich auch in der Förderung der Metastasierung und invasive pathologischen Subtypen in verschiedenen Arten von Karzinomen [11] in Verbindung gebracht. Daher Twist 1 wurde vorgeschlagen onkogenen Eigenschaften zu haben. Beispielsweise die Überexpression von Twist in Rhabdomyosarkom hemmt Myc-induzierte Apoptose und interferiert mit p53 Tumorsuppression [12]. Hochregulierung von Twist mit maligner Transformation in T-Zell-Lymphom [13] verbunden. Erzwungene Expression von Twist löst Widerstand von menschlichen Krebszellen zu Arzneimitteln, die Mikrotubulusbildung [14] zu hemmen.

Allerdings bleiben die Wirkung und den Mechanismus der Twist-Gen auf die Proliferation von Magenkarzinom rätselhaft. Jüngste Studien haben gezeigt, dass TWIST1 Ist bei Magenkrebs-assoziierten Fibroblasten mit einer schlechten klinischen Ergebnisse hochreguliert [15]. Außerdem Herunterregulierung des Twist-1-Gens unterdrückt, die Proliferation von Magenkrebszellen durch negativ auf die AP-1-Aktivität regulieren in der Cyclin D1-Expression resultierende Abnahme [16]. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Zelllinien wurden Magenkrebs eingesetzt, um die Wirkung und den Mechanismus der Twist-1-Gens auf die Zellproliferation zu untersuchen.

Materialien und Methoden

Cell Culture

Vier epithelialen Zelllinien (NCI-N87, AGS, HGC-27 und MGC80-3) aus Magenkarzinom abgeleitet wurden von der American Type Culture Collection (USA) erhalten. Zellen wurden in DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 10% fötalem Rinderserum (Gibco, Beijing). Die Kulturen wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO _{2 gehalten.}

small interfering RNA, die RNA-Extraktion und Analyse in Echtzeit

Die Zellen wurden ausgesät auf 6- Well-Platten dann mit 50 nM siRNA Oligos transfiziert Targeting menschlichen Twist 1 (Dharmacon, USA). Die siRNA-Molekül spezifisch für grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurde als negative Kontrolle verwendet. Gesamt-RNAs wurden aus den Zellen durch TRIzol Reagenz extrahiert und Reverse Transkriptionen wurden von Takara RNA PCR-Kit (Takara, China) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Um die Transkripte der Gene Interesse, Echtzeit-PCR unter Verwendung eines SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japan) auf Light Cycler 480 (Roche, Schweiz) durchgeführt wurde, zu quantifizieren.

transienten Transfektionen und Luciferasetests

Human FOXM1-Promotor wurde aus der humanen genomischen DNA-Matrize amplifiziert und in pGL4.15 Basisvektor (Promega). Mutant TWIST1 Bindungsmotiv wurde unter Verwendung eines PCR-Mutagenese-Kit (Toyobo) erzeugt wird mit einem Primer (Mutationsstellen unterstrichen): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'und ein reverses Komplement Primers. Alle transienten Transfektionen wurden mit Lipofectamine 2000 durchgeführt (Invitrogen, Shanghai), nach den Anweisungen des Herstellers. Für den Luciferase-Reporter-Assays wurden die Zellen in 24-well-Platten ausgesät und mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Luciferaseaktivitäten gemessen, um den Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Co-Immunpräzipitation

Die Zellen wurden geerntet, in Lysis-Puffer resuspendiert, enthaltend 50 mM Tris- HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% TRITON X-100) und Protease-Inhibitoren. Die Lysate wurden mit 2,5 ug p300 oder IgG über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Protein-A-Kügelchen wurden für weitere 4 Stunden zugegeben. Perlen enthaltende Immunkomplexe wurden mit 1 ml eiskaltem Lysis-Puffer viermal gewaschen. Die Niederschläge wurden für 10 min in Laemmli (Gel-Beladung) Puffer bei 95 ° C denaturiert.

Western Blot

Zellen durch Trypsinierung, lysiert in Laemmli-Puffer bei 80 ° für 10 min denaturiert geerntet C, und auf SDS /PAGE-Gelen aufgelöst. Nach Immunoblotting wurden die Membranen in PBS /0,1% Tween-20 mit 7,5% fettfreier Trockenmilch blockiert und primären Antikörper wurden in PBS /0,1% Tween-20 mit 0,1% bis 5% fettfreier Trockenmilch inkubiert. Antikörper, die gegen Twist 1 wurden FoxM1 von Santa Cruz Biotechnology (USA) erworben. Anti-p300 und GAPDH-Antikörper wurden von Abcam Company (USA) erhalten. Anti-p21, p27, Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D2, Cyclin E und E-Cadherin-Antikörper waren von Cellsignaling (USA).

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) -Test

Chromatinimmunpräzipitation ( ChIP) Assay-Kits wurden verwendet (Upstate, USA). Kurz gesagt, Upstate des ChIP-Test unter Verwendung Kits Die Zellen wurden mit 1% Formaldehyd fixiert und weiterverarbeitet. Lösliche Chromatin wurde mit Anti-Twist 1 und IgG-Antikörper immunpräzipitiert. Nach der Reinigung wurden die DNA-Proben durch quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung von Primern umfasst proximalen Region des humanen Promotors FoxM1 quantifiziert.

Statistische Analyse

Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Unterschiede wurden durch einen zweiseitigen t-Test bestimmt. Die statistische Signifikanz wird als * (P < 0,05) gezeigt, ** (P < 0,01) oder *** (P < 0,001).

Ergebnisse

• PLoS ONE: c-Met als prognostischer Marker in Magenkrebs: Eine systematische Überprüfung und Meta-Analysis
• PLoS ONE: Schlechte Prognose von Phosphatase von Regenerations Leber 3 Expression in Magenkrebs: Eine Meta-Analyse