PLoS ONE: Twist1 promovira želudac proliferacije stanica karcinoma kroz regulaciji FoxM1

Sažetak pregled

Twist-povezan protein 1 (Twist1), također poznat kao klasu osnovni spirala-loop-Helix protein 38 (bHLHa38) je naveden u određivanju stanične linije i diferencijacije. Prethodne studije pokazuju da Twist1 izraz up-regulirana raka želuca s lošim kliničkim rezultatima. Osim toga, Twist1 sugerira da je uključen u progresiju humanog raka želuca. Međutim, njegova biološka funkcija u velikoj mjeri ostaju neistraženi. U ovom istraživanju, pokazali smo da twist 1 prekomjerna ekspresija rezultira značajnim doreguliranjem FoxM1, koji ima ključnu ulogu u napredovanju staničnog ciklusa u želučanom stanica raka. Nasuprot tome, obaranje pomaka 1 smanjuje ekspresiju FoxM1, sugerirajući da FoxM1 može biti izravna transkripcijski meta pomaka 1. Na molekularnoj razini, daljnje otkrivaju da twist 1 može se vezati na promotorske regije FoxM1 i zatim privući P300 za induciranje FoxM1 mRNA transkripcije. Dakle, naši rezultati otkrivaju prethodnom nepoznati obrat 1 /FoxM1 regulatorni puteve, koji mogu pomoći da razumiju mehanizme širenja raka želuca pregled

Izvor:. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 Promiče želudac proliferacije stanica karcinoma kroz up-regulaciji FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625 pregled

Urednik: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, United States of America pregled

Primljeno: 31. svibnja 2013; Prihvaćeno: 3. rujna 2013; Objavljeno: 24. listopad 2013 pregled

Copyright: © 2013 Qian i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa.. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

epitela-mezenhimalne-prijelaza (EMT) je Postupak kojim epitelne stanice gube polarnosti i stanice na stanične adhezije, te prolaze dramatičan pregradnja citoskeleta [1,2]. Istodobno s gubitkom stanične adhezije i citoskeletnih komponenti epitelne, stanice prolaze EMT steći izraz mczcnhimnog komponenti i migracijskog fenotipa [2,3]. pregled

Nekoliko ključnih induktori EMT su faktori transkripcije, uključujući Twist 1, puž i cjevčica, koja potisnuti izraz E-kadherina [4,5]. Twist1 pripada osnovnom helix-loop-helix faktora transkripcije obitelji [6]. U početku, Twist1 predloženo je da je bitna u razvoju mesodermally izvedeni tkiva, uključujući mišiće i osteogenim loza stanica [7,8]. Naknadne studije su pokazale da twist 1 potiče EMT i igra bitnu ulogu u metastazi u nekoliko tumorskih modela [9,10]. Ekspresija pomaka 1 također je uključena u poticanje metastazama i invazivnih patoloških podtip u nekoliko tipova karcinoma [11]. Stoga, Kružni 1 je sugerirano da onkogene svojstva. Na primjer, pojačanom ekspresijom Twist u rabdomiosarkom inhibira Myc apoptozi i ometa suzbijanje tumora p53 [12]. Doreguliranje pomaka povezana s malignom transformacijom T-stanica limfoma [13]. Prisilno izraz Twist izaziva otpor ljudskih stanica raka na lijekove koji inhibiraju nastajanje mikrotubula [14]. pregled

Međutim, učinak i mehanizam Twist gena na proliferaciju želučanog karcinoma i dalje zagonetna. Nedavne studije su pokazale da Twist1 Je viša u rak želuca povezane fibroblasta s lošim kliničkim rezultatima [15]. Osim toga, dolje regulacija gena Twist 1 potisnuti proliferaciju stanica želuca raka negativno regulira aktivnost AP-1 je rezultiralo u izrazu ciklin D1 smanjuje [16]. U ovom radu, dvije raka želuca stanične linije su zaposleni istražiti utjecaj i mehanizam Twist 1 gena na proliferaciju stanica. Pregled

Materijali i metode

Kultura stanica pregled

Četiri epitelne stanične linije (NCI-N87, AGS, HGC-27 i MGC80-3) dobivene iz želuca karcinoma dobivene su od American Type Culture Collection (USA). Stanice su uzgajane u DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Gibco, Beijing). Kulture su održavane na 37 ° C u vlažnoj atmosferi s 5% CO _{2. Pregled}

Mali ometa RNA, ekstrakcija RNA i real-time analiza pregled

Stanice su posađene na 6 i ploče su zatim transficirane sa 50 nM siRNA oligonukleotidima ciljaju humani twist 1 (Dharmacon, USA). SiRNA molekula specifična za zeleni fluorescentni protein (GFP), upotrijebljen je kao negativna kontrola. Ukupno RNA su iz stanica Trizol reagensa i preokrenuti transkripti su obavljali Takara RNA PCR kit (Takara, Kina) slijedeći protokol proizvođača. Kako bi se kvantificirati transkripte kamatnih gena, real-time PCR je provedena korištenjem SYBR Green premiks Ex Taq (Takara, Japan) na svjetlo Cycleru 480 (Roche, Švicarska). pregled

transfekcije i Luciferaze Testovi pregled

Human FOXM1 promotor je amplificirano iz humane genomne DNA kalupa i umetnut pGL4.15 osnovni vektor (Promega). Mutant Twist1 vezujući motiv su pomoću PCR mutageneze kita (Toyobo) sa primjer (mutacija stranice podvučeno): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'i reverznog komplementa početnica. Sve transfekcije provedene su lipofektamin 2000 (Invitrogen, Šangaj), u skladu s uputama proizvođača. Za luciferaze testove, stanice su nasađene u 24 jažica, a transfektirane s naznačenim plazmida. 48 sati nakon transfekcije, aktivnosti luciferaze mjerena je korištenjem Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, SAD). Pregled

Co-imunoprecipitaciju pregled

Stanice su prikupljene, resuspendirane u puferu za lizu koji sadrži 50 mM tris HCl (pH 7.3-7.5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) i inhibitori proteaze. Lizati su inkubirani s 2.5 ug P300 ili IgG preko noći na 4 ° C. A kuglice proteina se doda dodatnih 4 sata. Kuglice sadrže imuno komplekse se isperu s 1 ml ledeno hladnog pufera za lizu po četiri puta. Precipitati su denaturirane u Laemmli (gel učitavanje) puferu pri 95 ° C tijekom 10 minuta. Pregled

Western blot pregled

Stanice su sakupljane tripsinizacijom, liziraju u Laemmli puferu, denaturirani tijekom 10 minuta na 80 ° C C, te riješiti na SDS /PAGE gelovima. Nakon imunoblot membrane su blokirane u PBS /0.1% Tween-20 s 7,5% nemasnog suhog mlijeka, primarnih protutijela su inkubirana u PBS /0.1% Tween-20 s 0,1% do 5% nemasnim suhim mlijekom. Antitijela protiv Twist 1 FoxM1 su nabavljeni od Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-P300 i GAPDH antitijela su dobiveni od Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, ciklin B1, ciklin D1, D2 Ciklin, ciklin E i E-kadherina antitijela su iz Cellsignaling (SAD). Pregled

kromatina Imunoprecipitacija (chip) Test pregled

kromatina imunotaloženje ( čip) pokus koji su korišteni (Upstate, USA). Ukratko, stanice su fiksirane s 1% formaldehida i dalje obrađeni Upstate je čip kit za ispitivanje. Topljivi kromatina je imunoprecipitiran s protu zakretanja 1 i IgG antitijela. Nakon pročišćavanja, DNA uzorci su kvantificirani kvantitativno u realnom vremenu PCR korištenjem primera koji obuhvaćaju proksimalna regija humanog FoxM1 promotora. pregled

Statistička analiza pregled

Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Statističke razlike su određene pomoću dvo-repog t testom. Statistička značajnost je prikazan kao * (P 0,05), ** (P 0,01) i *** (p 0.001). pregled

Rezultati

Utjecaj Twist1 na proliferaciju pregled

U prvom, istražiti funkcionalnu ulogu Twist 1 u staničnoj proliferaciji, mi prenesen NCI-N87 ili AGS želučane stanice raka stanice s adenovirusima sadrže twist 1 ili praznim vektorom (slika 1A i 1B). U skladu s prethodnim istraživanjima, izraz E-kadherina, biomarkera EMT procesa [4,5], je dolje regulirano Twist 1 ekspresijom (Slika S1A-1B). Osim toga, Twist 1 prekomjerna ekspresija je rezultiralo značajnim povećanjem broja stanica svih testiranih stanica (Slika 1C i 1D). Dosljedno, bromodeoksiuridin (BrdU) Analiza je također potvrdila da Twist 1 pojačana ekspresija promovira proliferaciju stanica (Slika 1E i 1F). Osim toga, Kružni 1 hipereksprimiraju stanicama imali su značajno manji postotak stanica u G1 /G0 i povećanje postotka stanica u S fazi, u odnosu na prazni vektor transficiranih stanica (Slika 1G-1H). Pregled

Dalje , NCI-N87 ili AGS stanice su transfektirane s mala interferirajuća RNA (siRNA) ciljanja twist 1. siRNA oligo pokazao učinkovit obrat 1 obaranje na ove dvije stanice, u usporedbi sa GFP siRNA transduciranih stanica (Slika 2A-2D). Kao rezultat toga, down-regulacije Twist 1 dovelo je do značajnog smanjenja broja stanica i razmnožavanje u tim stanicama (Slika 2E-2h). Osim toga, prigušenje pomaka 1 značajno povećava postotak stanica u G0 /G1 fazi smanjen postotak stanica u S fazi (slika 2I-2j). Naime, usporedili smo proliferacije aktivnost NCI-N87 i AGS stanica sa ili bez transfekcijom prazan vektor ili GFP siRNA. Naši rezultati pokazuju da niti prazna vektor ili GFP siRNA utjecati na proliferaciju stanica aktivnost (Slika S2A). Osim toga, sposobnost rasta stanica koje izlučuju veću Twist 1 razina (NCI-N87 i AGS stanice) je relativno veći od ostalih (HGC-27 i MGC80-3 stanice) (Slika S2C). Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da Twist jedan bi mogao biti važan pozitivni propis proliferacije želučane stanice raka. Pregled

Twist1 utječe na ekspresiju regulatora staničnog ciklusa

Kao Twist 1 unaprijeđen proliferaciju stanica, ispitali smo njegove funkcije na ekspresiju gena koji reguliraju G1 /s tranziciju, uključujući i CDK inhibitora p21 ^{CIP1, p27 Kip1 je CDK regulator ciklin B1, ciklin D1, D2 i ciklin Ciklin E. Rezultati iz realnom time PCR i western blot analize u NCI-N87 stanica sugerira da ekspresija p21 CIP1, p27 Kip1 su regulirani, a ciklin B1, ciklin D1, ciklinski D2 i ciklin E su razine reguliran u twist 1 transfektiranih stanica, u odnosu na prazan vektor transfektirane stanice (slika 3A-3B). Slični rezultati se također promatraju za AGS stanici (Slika 3C-3D), što dalje potvrđuje da twist 1 može utjecati na proliferaciju stanica želuca raka. Dosljedno, obaranje Twist 1. povećana p21 CIP1 i p27 Kip1 izraz dok je smanjen Ciklin B1, ciklin D1, D2 Ciklin i ciklin E izraz u NCI-N87 i AGS stanica (Slika 4A-4D). Pregled}

Twist 1 izravno usmjeren na faktor transkripcije FoxM1 u želučanim stanicama raka pregled

Prethodne studije su pokazale da je nekoliko transkripcijski faktori mogu regulirati niz gena na koje se odnosi na stanični ciklus, uključujući p21 ^{CIP1, p27 Kip1 i ciklin B1. Dakle, analizirali smo potencijalne transkripcijske čimbenike koji sudjeluju u regulaciji stanične proliferacije. Od pet ispitanih transkripcijskih faktora, FoxM1 pronađeni su samo da bi se značajno povećao u NCI-N87 stanica ekspresijom Twist 1 (slika 5A-5b). Indukcija FoxM1 također je zabilježena u AGS stanica (Slika 5C-5D). Osim toga, FoxM1 izraz je smanjen u tim stanicama ispražnjen od Twist 1 (Slika 6A-6D), što ukazuje da FoxM1 mogao biti meta Twist 1. pregled}

Twist 1 regulira povišenje ekspresije FoxM1 kroz zapošljavanje P300 Netlogu

Nakon toga, usredotočili smo se na molekularnoj mehanizma Twist 1 regulacije FoxM1 transkripcije. Analiza sekvenci je pokazala da je promotorska regija ljudskog gena sadržavalo FoxM1 potencijalni twist 1 vezno mjesto (između -357 i -352 bp) (Slika 7A). Luciferaze izvještaj pokazao da transkripcijsku aktivnost divljeg tipa FoxM1 promotor dramatično regulirano Twist 1, a transkripcijska aktivnost ukinuta u promotora koji nosi mutacije u Twist mjestima 1 vežu (Slika 7B). Nadalje, čip testovi su pokazali da Twist 1 jedinstveno mogao vezati za FoxM1 promotor (slika 7c). Da bi se utvrdilo da li je potrebna indukcija FoxM1 strane Twist 1 za proliferativni učinak, proveli smo pokuse sa FoxM1 obaranje pomoću siRNA oligonukleotida u NCI-N87 stanica (Slika S3A-S3B). Kao posljedica toga, siRNA spasio stanica iz proliferativnog učinka twist 1 ekspresijom (Slika S3C). Dosljedno, funkcije Twist 1 na razinama ekspresije regulatora staničnog ciklusa također su poništena od strane FoxM1 siRNA oligonukleotidima (Slika S3D), što ukazuje da FoxM1 je potreban za uloge Twist 1 u želučanih stanica raka. pregled

Kao transkripcijski faktor, Twist 1 može zaposliti koaktivatori u regulaciji ekspresije ciljnih gena. Prethodna proučavanja pokazala da P300 može djelovati kao koaktivatora za mnoge faktore transkripcije. Mi na taj način ispitati da li P300 može biti koaktivator za Twist 1 regulaciju FoxM1 izražavanja. Kao što je prikazano na slici 7D, Kružni 1 može komunicirati s P300 prema coimmunoprecipitation. Transkripcijsku aktivnost promotora FoxM1 dodatno regulirano kotransfekcije P300 i okretati 1 (Slika 7E). Osim toga, mi i dalje ukinuta P300 izraza pomoću siRNA oligonukleotida u NCI-N87 stanica (Slika 7f). Kao što se očekivalo, Twist 1-inducirana FoxM1 ekspresija značajno je otupjela od šutnje P300 (Slika 7G-7H). Navedeni podaci pokazuju da Twist 1 regulira prema gore FoxM1 izraz kroz zapošljavanje transkripcijskih koaktivator kompleksa, uključujući i P300. Pregled

Rasprava pregled

U trenutnoj studiji, naši rezultati upućuju Twist 1 kao kritične regulator želuca napredovanja raka. Na to upućuje nekoliko linija dokaza. Prvo, Kružni 1 hiperekspresija potiče a njegov nedostatak inhibira proliferaciju stanica kako je prikazano na BrdU i analizu staničnog ciklusa. Drugo, Kružni 1 utječe gena izražavanja modulatora staničnog ciklusa, uključujući inhibitore CDK p21Cip1, p27Kip1, regulator CDK ciklin B1, ciklin D1, D2 ciklin i ciklin E Treće, Kružni 1 direktno regulira povišenje ekspresije FoxM1 na razini transkripcije putem zapošljavanje P300. Osim toga, obaranje endogenog FoxM1 ekspresije prigušuje proliferativni učinak pomaka 1, što ukazuje da je neophodno FoxM1 za uloge pomaka 1 u želučanom stanica raka. pregled

U odraslih, Twist 1 uglavnom se izražava u stanica prekursora uključujući osteoblasta, myogenic, odontoblastic i mijelomonocitna loza, održavajući njihov nediferencirani stanje [17]. Osim toga, Twist1 je također važan regulator mnogih drugih bioloških procesa, uključujući razvoj mczcnhimnog i smeđeg metabolizam masti. Na primjer, Twist1 vjeruje se da inhibiraju djelovanje osteoblasta diferencijacije negativno regulirajućom Runx2 [17]. Osim toga, Twist-1 selektivno izražen u masnom tkivu, u interakciji s PGŽ-1 a, potisnuti mitohondrijsku metabolizam i odvajanje. Kao posljedica toga, ekspresijom transgenični miševi twist-1 u masnom tkivu su skloni visoke masnoće dijetom inducirane pretilosti, dok njegova heterozigotnih knockout miševi su otporni pretilost [18]. Štoviše, Twist jedan nuklearni ekspresija također je uočena u ne-noncancerous epitela, što ukazuje da Twist 1 može imati fiziološku ulogu u normalnim stanicama [19]. Naknadne studije pokazuju da twist 1 ekspresija povezana s jakim invazivnosti te lošom prognozom u karcinom epitela. Kod karcinoma želuca, nedavno izvješće je pokazalo ekspresiju gena Twist 1 se češće naći u difuzna tipa tkiva karcinoma s ekspresije gena visoke N-kadherina [20]. Međutim, nema definitivne rezultati pokazuju Twist potiče proliferaciju raka želuca. Naši nalazi sugeriraju Twist vjerojatno promovira želučane proliferaciju stanica raka, koristeći inkorporiranja BrdU. Osim toga, FoxM1 prvo je identificiran kao novi transkripcije meti Twist 1. pregled

FoxM1 veže promotorske regije s sklonost za [TAAACA] sekvence za prepoznavanje konsenzus, iako s manjim afinitetom nego druge forkhead proteina [21]. Njegov izraz je ograničena na proliferacijom stanica, a isključena iz mirnih i terminalno diferenciranim stanicama. Ona kontrolira ekspresiju gena potrebnih za oba G1 /S i G2 /M prijelazu i neophodna je za ulazak u mitozu i napredovanje, osiguranje održavanja stabilnosti kromosoma [22,23]. Amplifikacije od FoxM1 gena opisano je u mnogim tumorima, kao što su karcinomi gušterače, raka dojke i hepatocelularnog karcinoma [24-27]. U karcinomu želuca, FoxM1 ekspresija je doregulirana i ta inhibicija dovodi do stanične starenjem, koji je barem djelomično, ovisno o p27 kip1 [28,29]. Osim pozitivnom uloge na proliferaciju stanica, FoxM1 je pokazano da igraju ulogu u drugim postupcima rakom, kao što je invazija i metastaza, [30]. Njegova razina ekspresije korelira s lošom prognozom i metastaza u različitim tumorima uključujući želučanog karcinoma [31], što upućuje na mogućnost korištenja FoxM1 kao prognozu i /ili marker dijagnoze. Uzeti zajedno, FoxM1 je obećavajuće i atraktivna meta za liječenje raka. Dakle, važno je razumjeti kako FoxM1 regulirano kako bi odredio boljih terapijskih pristupa. pregled

izraz FoxM1 čvrsto regulirana kako na mRNA i proteina razinama. Obiljem povećava na ulazu u S-fazi, vrhova tijekom G2 i M, te se razgrađuje tijekom diobenog izlaza. Slično tome, njegova transkripcijska aktivnost čvrsto regulirana tijekom staničnog ciklusa višestranično fosforilacije različitih kinaza, i njegove suzbijanje fosfataze, dosežu maksimalne aktivnosti u G2 fazi staničnog ciklusa [32]. Nedavno je objavljeno da FoxM1 ekspresija može se modulirati mikroRNA. FoxM1 je identificiran kao izravna meta Mir-134, čija je razina u obrnutoj korelaciji s invazivni potencijal nekih NSCLC stanica [33]. Štoviše, FoxM1 također potisnuta Mir-370 u želučanim stanicama raka [29], što upućuje da su daljnja istraživanja potrebna da istraži da li Twist 1 mogu surađivati ​​te regulatorne putova. pregled

Na kraju, mi ovdje pokazati da Twist 1 prekomjerna ekspresija dovodi do značajnog regulaciji FoxM1, koji igra ključnu ulogu u progresiji staničnog ciklusa u želučanom stanica raka. Nasuprot tome, obaranje pomaka 1 smanjuje ekspresiju FoxM1, sugerirajući da FoxM1 može biti izravna transkripcijski meta pomaka 1. Nadalje se otkrilo da twist 1 može vezati na promotorske regije FoxM1 i zatim privući P300 da inducira FoxM1 mRNA transkripciju. Dakle, naši rezultati otkrivaju prethodnom nepoznati obrat 1 /FoxM1 regulatorni puteve, koji mogu pomoći da razumiju mehanizme širenja raka želuca. Pregled

popratne podatke
Slika S1. pregled (AB), mRNA i proteina E-kadherina u NCI-N87 (A) i AGS (B) transfektiranih sa adenovirusi koji eksprimiraju praznim vektorom (EV) ili twist 1.
doi: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001 pregled (TIF) pregled slika S2. pregled (A-B) proliferacije stanica potencijal (BrdU) je određena u NCI-N87 (A) ili AGS (B) stanica ili bez transfekcije praznim vektorom (EV) ili GFP siRNA. (C) Endogeni twist 1 bila je određena pomoću western blot četiri želuca stanica raka (NCI-N87, AGS, HGC-27 i MGC80-3). Krivulja rasta od četiri stanicama mjerena pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s002 pregled (TIF) pregled slika S3. pregled

(A-B) mRNA (A) i protein (B) razine FoxM1 u NCI-N87 stanica transficiranih siRNA oligonukleotidima protiv NCI-N87 ili negativnoj kontroli (Crtl). (C) stanične proliferacije aktivnost bila je mjerena BrdU testovima u NCI-N87 stanicama. Stanice su prethodno transficirane s siRNA oligonukleotida kroz 24 sata i potom transfektirane s praznim vektorom (EV) ili zakretati 1 za još 24 sata. Razina pregled (D) mRNA p21, p27, ciklin B1, ciklin D1, D2 i ciklin ciklin E su određene u realnom vremenu PCR u NCI-N87 stanicama. Stanice su prethodno transficirane s siRNA oligonukleotidima 24 sata, a potom transfektirane s praznim vektorom (EV) ili zakretati 1 za još 24 sata pregled doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s003 pregled (TIF)

• PLoS ONE: c-Met kao prognostički biljeg u rak želuca: sustavni pregled i meta-analiza
• PLoS ONE: Loše prognoze fosfataze regeneracije jetre 3 u rak želuca: meta-analiza