PLOS ONE: TWIST1 promove o câncer gástrico Proliferação celular através de aumento da regulação do FoxM1

Sumário

Relacionado com o Twist-protein 1 (TWIST1), também conhecido como classe A proteína hélice-volta-hélice 38 (bHLHa38), tem sido implicado na determinação linhagem celular e diferenciação. Estudos anteriores demonstram que a expressão TWIST1 é regulada para cima no câncer gástrico com resultados clínicos pobres. Além disso, é sugerido TWIST1 estar envolvidos na progressão de cancro gástrico humano. No entanto, suas funções biológicas permanecem largamente inexplorado. No presente estudo, mostramos que a torção uma sobre-expressão conduz a um significativo aumento da regulação do FoxM1, que desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular em células de cancro gástrico. Em contraste, knockdown da torção reduz a expressão de um FoxM1, sugerindo que FoxM1 pode ser um alvo da transcrição directa de torção 1. Ao nível molecular, que revelam ainda que uma torção pode ligar-se a região do promotor de FoxM1, e subsequentemente recrutar P300 para induzir a transcrição de mRNA FoxM1. Portanto, nossos resultados descobrem uma torção desconhecido anterior 1 /via reguladora FoxM1, o que pode ajudar a compreender os mecanismos de proliferação câncer gástrico

Citation:. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) TWIST1 promove o câncer gástrico Proliferação celular através de aumento da regulação do FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625

editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de maio de 2013; Aceito: 03 de setembro de 2013; Publicação: 24 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Qian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

epitelial-mesenquimal-transição (EMT) é um processo pelo qual as células epiteliais perder polaridade e adesão célula-a-célula, e submeter-se a remodelação dramática do citoesqueleto [1,2]. Concomitante com a perda de componentes do citoesqueleto e adesão celular epiteliais, células que sofrem EMT adquirir expressão de componentes mesenquimais e um fenótipo migratório [2,3].

Vários indutores fundamentais de EMT são fatores de transcrição, incluindo torção 1, Caracol, e Slug, que reprimir a expressão da caderina-E [4,5]. TWIST1 pertence à hélice-alça-hélice fator de transcrição da família básico [6]. Inicialmente, TWIST1 foi sugerida como sendo essencial para o desenvolvimento de tecidos mesodermally derivados, incluindo linhagens de células osteogénicas [7,8] e músculo. Estudos posteriores mostraram que a torção 1 promove EMT e desempenha um papel essencial na metástase em vários modelos de tumor [9,10]. Expressão de torção 1 também tem sido implicada na promoção da metástase e subtipos patológicos invasivos em vários tipos de carcinoma de [11]. Portanto, uma torção tem sido sugerido como tendo propriedades oncogénicas. Por exemplo, a sobreexpressão de torção em rabdomiossarcoma inibe a apoptose induzida por Myc e interfere com a supressão de tumores p53 [12]. A regulação da torção está associado com a transformação maligna em linfoma de célula T [13]. A expressão forçada de torção provoca a resistência de células de cancro humano com drogas que inibem a formação de microtúbulos [14].

No entanto, o efeito e mecanismo de gene torção sobre a proliferação do carcinoma gástrico permanece enigmático. Estudos recentes têm mostrado que TWIST1 é regulado para cima em fibroblastos associados ao câncer gástrico com resultados clínicos pobres [15]. Além disso, a infra-regulação do gene da torção 1 suprimiu a proliferação de células de cancro gástrico, regulando negativamente a actividade de AP-1, resultando na expressão da ciclina D1 diminuindo [16]. No presente trabalho, duas linhas celulares de cancro gástrico foram empregadas para investigar o efeito e mecanismo de torção 1 gene na proliferação celular

Materiais e Métodos

Cultura de Células

Four. linhas de células epiteliais (NCI-N87, AGS, HGC-27 e MGC80-3) derivadas de carcinoma gástrico foram obtidas da American Type Culture Collection (EUA). As células foram cultivadas em DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Gibco, Pequim). As culturas foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO _2.

pequeno ARN interferente, ARN de extracção e análise em tempo real

As células foram semeadas sobre a 6- bem placas, em seguida, transfectadas com os oligos 50 nM de ARNsi de segmentação torção humana 1 (Dharmacon, EUA). O siRNA molécula específica para a proteína fluorescente verde (GFP) foi utilizada como controlo negativo. Os ARNs totais foram extraídos a partir de células de reagente TRIzol, e transcrições reversas foram efectuadas por Takara RNA PCR kit (Takara, China) seguindo o protocolo do fabricante. De modo a quantificar os transcritos dos genes de interesse, PCR em tempo real foi realizado utilizando um SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japão) em luz Cycler 480 (Roche, Suíça).

transfecções transientes e de luciferase Ensaios

promotor FOXM1 humano foi amplificado a partir do molde de ADN genómico humano e inserido no vector de pGL4.15 básico (Promega). motivo de ligação do mutante TWIST1 foi gerado usando um kit de mutagénese por PCR (Toyobo) com um iniciador (locais de mutação sublinhados): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'e um iniciador reverso complementar. Todas as transf ecções transientes foram realizadas por Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Xangai), de acordo com as instruções do fabricante. Para os ensaios de repórter de luciferase, as células foram semeadas em placas de 24 cavidades e foram transfectadas com os plasmídeos indicados. 48 horas após a transfecção, as actividades da luciferase foram medidas usando o Ensaio de Luciferase Reporter sistema dual (Promega, EUA).

Co-imunoprecipitação

As células foram colhidas, ressuspensas em tampão de lise contendo Tris 50 mM HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,5% inibidores de Triton X-100) e protease. Os lisados ​​foram incubados com 2,5 ug de P300 ou IgG durante a noite a 4 ° C. grânulos de uma proteína foram adicionados durante 4 horas adicionais. As contas contendo complexos imunes foram lavados com tampão de lise frio 1 ml de gelo por quatro vezes. Os precipitados foram desnaturadas em Laemmli (carregamento de gel) tampão a 95 ° C durante 10 min.

Western Blot

As células foram recolhidas por tripsinização, lisaram-se em tampão de Laemmli, desnaturado durante 10 min a 80 ° C, e resolvidos em géis de SDS /PAGE. Depois de imunotransferência, as membranas foram bloqueadas em PBS /0,1% de Tween-20 com 7,5% de leite em pó magro, e os anticorpos primários foram incubadas em PBS /0,1% de Tween-20 com 0,1% -5% de leite seco sem gordura. Os anticorpos dirigidos contra a torção 1, FoxM1 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (EUA). Anti-P300 e GAPDH anticorpos foram obtidos a partir de Abcam Company (EUA). Anti-p21, p27, ciclina B1, de ciclina D1, ciclina D2, ciclina E e E-caderina anticorpos eram de Cellsignaling (EUA).

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

A cromatina imunoprecipitação ( Chip) kits de ensaio foram utilizados (Upstate, EUA). Resumidamente, as células foram fixadas com formaldeído a 1% e ainda processado utilizando kits de ensaio de chips da Upstate. cromatina solúvel foi imunoprecipitada com anti-torção 1 e anticorpos de IgG. Após a purificação, as amostras de ADN foram quantificadas por quantitativa PCR em tempo real utilizando iniciadores que abrangem a região proximal do promotor FoxM1 humano.
Análise

Estatística

Todos os dados são apresentados como média ± SEM. As diferenças estatísticas foram determinadas por um teste t de duas caudas. A significância estatística é mostrado como * (P < 0,05), ** (P < 0,01) ou *** (P < 0,001).

Resultados

Efeito da TWIST1 na proliferação de células de câncer gástrico

Na primeira, para explorar o papel funcional da torção 1 na proliferação celular, nós transduzidas NCI-N87 ou AGS células com adenovirus contendo uma torção ou vector vazio (Figura 1A e 1B). Consistente com os estudos anteriores, a expressão de E-caderina, um biomarcador de processo EMT [4,5], foi regulada para baixo por uma sobre-expressão da torção (Figura S1A-1B). Além disso, uma sobre-expressão da torção resultou num aumento significativo no número de células de todas as células testadas (Figura 1C e 1D). Consistentemente, bromodesoxiuridina análise (BrdU) também confirmou que a torção uma superexpressão promoveu a proliferação de células (Figura 1E e 1F). Além disso, as células que sobre-expressam torção 1 teve uma percentagem significativamente inferior de células na fase G1 /G0 e aumento da percentagem de células na fase S, em comparação com células transfectadas com vector vazio (Figura 1G-1H).

Próximo , as células NCI-AGS N87 ou foram transfectadas com pequeno ARN interferente (siRNA) segmentação torção 1. O oligo siARN mostrou torção eficiente um knockdown nestas duas células, em comparação com células de GFP siARN-transduzidas (Figura 2A-2D). Como resultado, a regulação negativa de torção 1 conduziu a uma diminuição marcada no número de células e proliferação nestas células (Figura 2E-2H). Além disso, o silenciamento de torção 1 aumentou significativamente a percentagem de células na fase G0 /G1 e diminuiu a percentagem de células na fase S (Figura 2I-2J). Notavelmente, comparou-se a actividade de proliferação de células AGS NCI-N87 e com ou sem transfecção do vector vazio ou GFP siARN. Os nossos resultados sugerem que nem o vector vazio ou GFP siARN afectar a actividade de proliferação de células (Figura S2A). Além disso, a capacidade de crescimento das células que expressam os níveis mais elevados de torção 1 (células NCI-N87 e AGS) é relativamente maior do que outras (HGC-27 e MGC80-3 células) (Figura S2C). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a torção 1 pode ser uma regulação positiva importante da proliferação de células de câncer gástrico.

TWIST1 afeta a expressão de reguladores do ciclo celular

Como torção 1 promoveu a proliferação celular, examinamos as suas funções na expressão dos genes que regulam a transição G1 /S, incluindo inibidores da CDK p21 ^{Cip1, p27 KIP1, o regulador de CDK ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 e ​​ciclina E. Resultados de real time PCR e análise de western blot em células NCI-N87 sugeriu que a expressão da p21 Cip1, p27 KIP1 foram reprimidos, enquanto a ciclina B1, os níveis de ciclina D1, ciclina D2 e ​​ciclina e foram upregulated em células torção 1 transfectadas, em comparação com células transfectadas com vector vazio (Figura 3A-3B). Resultados semelhantes foram também observados em células AGS (Figura 3C-3D), confirmando ainda que uma torção pode influenciar a proliferação de células de cancro gástrico. Consistentemente, knockdown de torção 1 aumentou p21 Cip1 e p27 expressão KIP1 enquanto reduzida ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 e ​​expressão da ciclina E em células NCI-N87 e AGS (Figura 4A-4D).}

torção 1 como alvo directamente o factor de transcrição FoxM1 em células de cancro gástrico

estudos anteriores revelaram que vários factores de transcrição pode regular uma série de genes relevantes para o ciclo celular, incluindo p21 ^{Cip1, p27 KIP1 e ciclina B1. Assim, foram analisados ​​os potenciais fatores de transcrição que participam na regulação da proliferação celular. Fora dos cinco factores transcricionais testadas, apenas FoxM1 foram encontrados para ser significativamente aumentada em células NCI-N87 que sobre-expressam uma torção (Figura 5A-5B). A indução de FoxM1 foi também observada em células AGS (Figura 5C-5D). Além disso, a expressão FoxM1 foi reduzida nestas células esgotado de torção 1 (Figura 6A-6D), sugerindo que FoxM1 pode ser um alvo de torção 1.}

Torção 1 aumenta a expressão FoxM1 através do recrutamento de p300

a seguir, destacamos sobre o mecanismo molecular de torção 1 regulação da FoxM1 transcrição. A análise da sequência mostrou que a região do promotor do gene humano FoxM1 continha um local de ligação do potencial de torção 1 (entre -357 e -352 pb) (Figura 7A). Ensaio de Luciferase relatório mostrou que a actividade de transcrição do promotor FoxM1 de tipo selvagem foi significativamente regulada positivamente por uma torção, ao passo que a actividade de transcrição foi abolida no promotor possuindo uma mutação nos locais de ligação de torção 1-(Figura 7B). Além disso, os ensaios mostraram que a torção ChIP 1 pode ligar-se exclusivamente a FoxM1 promotor (Figura 7C). Para determinar se é necessária a indução de FoxM1 por torção 1 por seu efeito proliferativo, realizamos experimentos com FoxM1 knockdown usando oligos siRNA em células NCI-N87 (Figura S3A-S3B). Como resultado, o siRNA resgatado a partir de células do efeito proliferativo de torção uma sobre-expressão (Figura S3C). Consistentemente, as funções de uma torção sobre os níveis dos reguladores do ciclo celular de expressão também foram revertidas por oligos FoxM1 siRNA (Figura S3D), sugerindo que FoxM1 é necessário para as funções de uma torção em células de cancro gástrico.

Como um fator de transcrição, torção 1 pode recrutar coactivators na regulação da expressão do gene alvo. Estudos anteriores demonstraram que o p300 poderia actuar como um coactivador por muitos factores de transcrição. Nós, portanto, examinar se p300 poderia ser um coativador para Torção 1 regulação da expressão FoxM1. Como mostrado na Figura 7D, uma torção podia interagir com p300 por coimmunoprecipitation. A atividade transcricional do promotor FoxM1 foi ainda regulada por co-transfecção de p300 e torcer 1 (Figura 7E). Além disso, eu aboli ainda mais expressão p300 usando oligos siRNA em células NCI-N87 (Figura 7F). Como esperado, torção 1-induzida expressão FoxM1 foi significativamente atenuada pelo silêncio de p300 (Figura 7G-7H). Os dados acima demonstram que a torção 1 upregulated expressão FoxM1 através de um recrutamento de complexos de co-ativadoras de transcrição, incluindo p300.

Discussão

No estudo atual, os nossos resultados implicam torção 1 como um regulador crítico do gástrica progressão do câncer. Isto é sugerido por várias linhas de evidência. Em primeiro lugar, uma sobre-expressão da torção promove ao mesmo tempo a sua deficiência inibe a proliferação celular, como mostrado pela BrdU e análise do ciclo celular. Em segundo lugar, uma torção afecta genes de expressão de moduladores do ciclo celular, incluindo os inibidores de CDK p21Cip1, p27Kip1, o regulador de CDK ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 e ​​ciclina E. Em terceiro lugar, uma torção directamente regula positivamente a expressão FoxM1 ao nível da transcrição, através recrutamento de P300. Além disso, knockdown da expressão endógena FoxM1 atenua o efeito proliferativo de torção 1, sugerindo que FoxM1 é essencial para as funções de uma torção em células de cancro gástrico.

Em adultos, a torção 1 é expressa principalmente em células precursoras incluindo os osteoblastos, miogênica, linhagens odontoblásticos e mielomonocítica, mantendo seu estado indiferenciado [17]. Além disso, é também TWIST1 um regulador importante de muitos outros processos biológicos, incluindo o desenvolvimento mesenquimais e o metabolismo da gordura marrom. Por exemplo, acredita-se que TWIST1 para inibir a diferenciação de osteoblastos, regulando negativamente Runx2 [17]. Além disso, Twist-1 é expresso selectivamente no tecido adiposo, interage com PGC-1α, para suprimir o metabolismo mitocondrial e desacoplamento. Como resultado, os ratinhos transgénicos que sobre-expressam Twist-1 no tecido adiposo são propensos para a obesidade de alta gordura induzida por dieta, enquanto que as suas ratinhos knockout heterozigóticos são resistentes obesidade [18]. Além disso, uma torção expressão nuclear foi também observada no epitélio não cancerosos, o que sugere que a torção 1 pode ter um papel fisiológico em células normais [19]. Estudos posteriores demonstraram que a expressão torção 1 está correlacionada com a invasão potente, bem como mau prognóstico no câncer epitelial. No cancro gástrico, um relatório recente mostrou superexpressão do gene torção 1 é mais frequentemente encontrada em tecidos de carcinoma do tipo difuso com a expressão do gene de alta N-caderina [20]. Torção no entanto, não houve resultados definitivos indicaram promove a proliferação do câncer gástrico. As nossas descobertas da torção sugeridos provavelmente promoveu a proliferação de células de cancro gástrico, utilizando-se os ensaios de incorporação de BrdU. Além disso, FoxM1 foi inicialmente identificado como um alvo transcricional novela de torção 1.

FoxM1 liga regiões promotoras com uma preferência por um [TAAACA] sequência de reconhecimento de consenso, embora com menor afinidade do que outras proteínas forkhead [21]. A sua expressão é restrita a células em proliferação, e excluídos a partir de células quiescentes e terminalmente diferenciadas. Ele controla a expressão de genes requeridos para ambos G1 /S e G2 transição /M e é essencial para a entrada mitótico e progressão, assegurando a manutenção da estabilidade cromossoma [22,23]. As amplificações de genes FoxM1 tem sido relatada em numerosos tumores tais como os carcinomas do pâncreas, cancro da mama e o carcinoma hepatocelular [24-27]. No cancro gástrico, FoxM1 expressão é também regulada para cima e a sua inibição conduz a senescência celular, a qual é, pelo menos em parte, dependente de p27 KIP1 [28,29]. Em adição ao seu papel na proliferação celular positiva, FoxM1 tem sido demonstrado que desempenham um papel em outros processos relacionados com o cancro, tais como invasão e metástase [30]. Os seus níveis de expressão correlacionar com prognóstico pobre e metástase em tumores diferentes, incluindo carcinoma gástrico [31], o que sugere a possibilidade de utilizar FoxM1 como um prognóstico e /ou marcador de diagnóstico. Tomados em conjunto, FoxM1 é um alvo promissor e atraente para a terapia do cancro. Portanto, é fundamental para entender como FoxM1 é regulamentada, a fim de projetar melhores abordagens terapêuticas.

expressão FoxM1 é rigidamente controlado, tanto a nível de mRNA e proteína. Sua abundância aumenta à entrada da fase S, picos durante G2 e M, e é degradada durante a saída mitótico. Da mesma forma, a sua actividade de transcrição é fortemente regulada em todo o ciclo celular por fosforilação em vários locais por diferentes quinases, fosfatases e seus neutralizando, atingindo o seu máximo de actividade na fase G2 do ciclo celular [32]. Recentemente, foi relatado que a expressão FoxM1 também pode ser modulado por microARNs. FoxM1 tem sido identificada como um alvo directo de miR-134, cujos níveis são inversamente correlacionados com o potencial invasivo de algumas células NSCLC [33]. Além disso, FoxM1 também é reprimida por miR-370 em células cancerosas gástricas [29], o que sugere que mais estudos são necessários para investigar se torção 1 poderiam cooperar estas vias regulamentares.

Em conclusão, nós aqui mostram que a sobre-expressão da torção 1 leva a um significativo aumento da regulação do FoxM1, que desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular em células de cancro gástrico. Em contraste, knockdown da torção reduz a expressão de um FoxM1, sugerindo que FoxM1 pode ser um alvo da transcrição directa de torção 1. Nós revelam ainda que uma torção pode ligar-se a região do promotor de FoxM1, e subsequentemente recrutar P300 para induzir a transcrição de ARNm FoxM1. Portanto, nossos resultados descobrem uma torção desconhecido anterior 1 /via reguladora FoxM1, o que pode ajudar a compreender os mecanismos de proliferação câncer gástrico.

Informações de Apoio
Figura S1. Os níveis de proteína de E-caderina em NCI-N87 (A) e AGS
(AB) de ARNm e (b) células transfectadas com adenovírus que expressam o vector vazio (EV) ou torção 1.
doi: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001
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Figura S2.
(A-B) A célula potencial proliferativo (BrdU) foi determinada em NCI-N87 (A) ou AGS (B) células sem ou com a transfecção do vector vazio (EV) ou GFP siARN. (C) endógena torção 1 expressão foi determinada por western blot em quatro células de câncer gástrico (NCI-N87, AGS, HGC-27 e MGC80-3). A curva de crescimento de quatro linhas celulares foi medida
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s002
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Figura S3.

(A-B) ARNm de (A) e de proteína (B) os níveis de FoxM1 em células NCI-N87 transfectadas com oligos ARNsi contra NCI-N87 ou um controlo negativo (Ctrl). (C) a actividade de proliferação celular foi medida por ensaios de BrdU nas células NCI-N87. As células foram pré-transfectadas com oligos siRNA durante 24 horas e, em seguida, transfectadas com vector vazio (EV) ou uma torção durante mais 24 horas.
Níveis (D) ARNm de p21, p27, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2 e ciclina E foram determinadas por PCR em tempo real em células NCI-N87. As células foram pré-transfectadas com oligos siRNA durante 24 horas, e, em seguida, transfectadas com vector vazio (EV) ou uma torção durante mais 24 horas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s003
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