PLoS ONE: TWIST1 Bevordert Gastric Cancer Cell Proliferation door middel van Up-verordening van FoxM1

Samenvatting

Twist-gerelateerd eiwit 1 (TWIST1), ook bekend als klasse A basic helix-loop-helix eiwit 38 (bHLHa38), is betrokken in cel lineage bepalen en differentiatie. Eerdere studies tonen aan dat TWIST1 expressie wordt up-gereguleerd in maagkanker met slechte klinische resultaten. Daarnaast TWIST1 wordt voorgesteld betrokken te zijn bij progressie van menselijke maagkanker. Echter, de biologische functies blijven grotendeels onontgonnen. In deze studie tonen we aan dat Twist 1 overexpressie leidt tot een aanzienlijke opwaartse regulatie van FoxM1, die een belangrijke rol in de celcyclus bij maagkanker cellen speelt. In contrast, knock-down van Twist 1 vermindert FoxM1 expressie, wat suggereert dat FoxM1 een directe transcriptie doelwit van Twist 1. Op moleculair niveau zou kunnen zijn, we verder zien dat Twist 1 kan aan de promotor regio FoxM1 binden en vervolgens p300 te werven voor het induceren FoxM1 mRNA transcriptie. Daarom is onze resultaten onthullen een eerder onbekende Twist 1 /FoxM1 regelgeving route, die kan helpen om de mechanismen van de maag-proliferatie begrijpen kanker

Visum:. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) TWIST1 Bevordert Gastric Cancer Cell Proliferation door middel van Up-verordening van FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625

Editor: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 31 mei 2013; Aanvaard: 3 september 2013; Gepubliceerd: 24 oktober 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

-mesenchymale transitie (EMT) is een proces waarbij epitheelcellen verliezen polariteit en cel-celadhesie, en ondergaan dramatische hermodellering van het cytoskelet [1,2]. Gelijktijdig met verlies van epitheliale cel adhesie en cytoskelet componenten, cellen die door expressie van mesenchymale componenten en een trekkende fenotype [2,3] EMT verwerven.

Een aantal belangrijke inductoren van EMT zijn transcriptiefactoren waaronder Twist 1, Slak, en Slug, die E-cadherine [4,5] te onderdrukken. TWIST1 behoort tot de basis helix-loop-helix transcriptiefactor familie [6]. Aanvankelijk werd gesuggereerd TWIST1 essentieel voor de ontwikkeling van mesodermally afgeleide weefsels, zoals spieren en osteogene cellijnen [7,8] is. Daaropvolgende studies hebben aangetoond dat Twist 1 bevordert EMT en speelt een essentiële rol in metastase in verschillende tumormodellen [9,10]. Expressie van Twist 1 is ook betrokken bij de bevordering van metastase en invasieve pathologische subtypes in verschillende soorten carcinomen [11]. Daarom is Twist 1 voorgesteld oncogene eigenschappen. Bijvoorbeeld, overexpressie van Twist rhabdomyosarcoom remt Myc-geïnduceerde apoptose en interfereert met p53 tumor suppressor [12]. Up-regulatie van Twist wordt geassocieerd met maligne transformatie in T-cellymfoom [13]. Geforceerde expressie van Twist triggers weerstand van menselijke kankercellen geneesmiddelen die de vorming van microtubuli [14] remmen.

Echter, het effect en het mechanisme van Twist-gen op de proliferatie van maagcarcinoom blijft raadselachtig. Recente studies hebben aangetoond dat TWIST1 Is opgereguleerd in gastrische kanker-geassocieerde fibroblasten met slechte klinische resultaten [15]. Daarnaast neerwaartse regulatie van de Twist 1 gen onderdrukt de proliferatie van maagkanker cellen door negatieve regulering van de AP-1-activiteit resulterend in de expressie van cycline D1 afnemende [16]. In het huidige werk werden twee maagkanker cellijnen gebruikt om het effect en het mechanisme van Twist 1-gen op cel proliferatie te onderzoeken.

Materialen en methoden

Cell Culture

Vier epitheliale cellijnen (NCI-N87, AGS, HGC-27 en MGC80-3) afkomstig van maagcarcinoom werden verkregen van American Type Culture Collection (USA). Cellen werden gekweekt in DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Gibco, Beijing). Kweken werden bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer gehouden met 5% CO _2.

kleine interfererende RNA, RNA-extractie en real-time analyse

De cellen werden gezaaid aan 6- putjesplaten vervolgens getransfecteerd met 50 nM siRNA oligo's gericht op humane Twist 1 (Dharmacon, USA). De siRNA-molecuul dat specifiek is voor groen fluorescerend eiwit (GFP) werd gebruikt als negatieve controle. Totaal RNA werd uit cellen geëxtraheerd door TRIzol reagens en reverse transcripties werden uitgevoerd door Takara RNA PCR kit (Takara, China) volgens het protocol van de fabrikant. Om de transcripten van belang genen kwantificeren, real-time PCR werd uitgevoerd onder toepassing van een SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japan) op Light Cycler 480 (Roche, Zwitserland).

Transient Transfecties en luciferasetests

Human FOXM1 promotor werd versterkt uit het menselijk genoom DNA-template en in pGL4.15 elementaire vector (Promega) geplaatst. Mutant TWIST1 bindende motief werd onder toepassing van een PCR-mutagenese kit (Toyobo) met een primer (mutatieplaatsen onderstreept): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'en een reverse primer complement. Alle transiënte transfecties werden uitgevoerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), volgens de instructies van de fabrikant. Voor de luciferase reporter assays, werden cellen gezaaid in 24-putjesplaten en getransfecteerd met de aangeduide plasmiden. 48 uur na transfectie werden luciférase activiteiten gemeten met de Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Co-immunoprecipitatie

De cellen werden geoogst, geresuspendeerd in lysisbuffer bevattende 50 mM Tris HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% TRITON X-100) en proteaseremmers. Lysaten werden geïncubeerd met 2,5 ug IgG p300 of overnacht bij 4 ° C. Proteïne A kralen werden gedurende nog eens 4 uur. Bolletjes, bevattende immuuncomplexen werden gewassen met 1 ml ijskoude lysisbuffer vier keer. Precipitaten werden gedenatureerd in Laemmli (gel loading) buffer bij 95 ° C gedurende 10 min.

Western Blot

De cellen werden geoogst door behandeling met trypsine, gelyseerd in Laemmli buffer, gedenatureerd gedurende 10 minuten bij 80 ° C en gescheiden op SDS /PAGE gelen. Na immunoblotting werden de membranen geblokkeerd in PBS /0,1% Tween-20 met 7,5% magere melkpoeder, en primaire antilichamen werden geïncubeerd in PBS /0,1% Tween-20 met 0,1% -5% niet vette droge melk. Antilichamen gericht tegen Twist 1, FoxM1 werden gekocht van Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-p300 en GAPDH antilichamen werden verkregen van Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, cycline B1, Cycline D1, D2 Cycline, Cycline E en E-cadherine antilichamen uit Cellsignaling (USA).

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) test

Chromatine immunoprecipitatie ( ChIP) testkits gebruikt (Upstate, USA). In het kort werden cellen gefixeerd met 1% formaldehyde en verder verwerkt met Upstate ChIP assay kits. Oplosbaar chromatine werd immunogeprecipiteerd met anti-Twist 1 en IgG-antilichamen. Na zuivering werden de DNA monsters gekwantificeerd door kwantitatieve real-time PCR met gebruik van primers omvattende proximale gebied van menselijk FoxM1 promoter.

Statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische verschillen werden bepaald door een tweezijdige t-test. Statistische significantie wordt getoond als * (P < 0,05), ** (P < 0,01) of *** (P < 0,001).

Resultaten

Effect van TWIST1 op de maag proliferatie van kankercellen

Bij de eerste, om de functionele rol van Twist 1 in cel proliferatie te verkennen, we getransduceerde NCI-N87 of AGS cellen met adenovirussen met Twist 1 of lege vector (Figuur 1A en 1B). Consistent met eerdere studies, de expressie van E-cadherine, een biomarker van EMT procedure [4,5], werd down-gereguleerd door overexpressie Twist 1 (Figuur S1A-1B). Daarnaast Twist 1 overexpressie resulteerde in een significante toename van het aantal cellen alle geteste cellen (figuur 1C en 1D). Consequent, broomdeoxyuridine analyse (BrdU) bevestigde ook dat Twist 1 overexpressie bevorderd cel proliferatie (figuur 1E en 1F). Daarnaast Twist 1 overexpressie cellen hadden een significant lager percentage van cellen in de G1 /G0 fase en verhoogd percentage cellen in de S-fase, in vergelijking met lege-vector getransfecteerde cellen (Figuur 1G 1H).

Next NCI-N87 of AGS cellen werden getransfecteerd met kleine interfererende RNA (siRNA) die gericht Twist 1. De siRNA oligo bleek efficiënt Twist 1 knockdown in deze twee cellen, vergeleken met GFP siRNA-getransduceerde cellen (figuur 2A-2D). Hierdoor neerwaartse regulatie van Twist 1 leidde tot een duidelijke afname van het aantal cellen en de proliferatie in deze cellen (Figuur 2E-2H). Bovendien silencing Twist 1 aanzienlijk verhoogd het percentage cellen in de G0 /G1 fase en verminderde het percentage cellen in de S fase (figuur 2I-2J). Met name, vergeleken we de proliferatie activiteit van NCI-N87 en AGS cellen met of zonder transfectie van lege vector of GFP siRNA. Onze resultaten suggereren dat geen lege vector of GFP siRNA beïnvloeden de celproliferatie activiteit (figuur S2A). Daarnaast groeivermogen van cellen die hogere niveaus Twist 1 (NCI-N87 en AGS cellen) relatief hoger dan andere (HGC-27 en MGC80-3 cellen) (Figuur S2C). Bij elkaar genomen, onze resultaten suggereren dat Twist 1 kan een belangrijke positieve regulering van de maag proliferatie kanker cel.

TWIST1 beïnvloedt expressie van celcyclus regulatoren

Als Twist 1 bevorderd cel proliferatie, we onderzocht de functies op de expressie van de genen die de G1 /S overgang reguleren, waaronder CDK remmers p21 ^{Cip1, p27 Kip1 de CDK regulator cycline B1, Cycline D1, D2 en Cycline cycline E. Resultaten van real- time PCR en westerse vlekanalyse in NCI-N87 cellen gesuggereerd dat de expressie van p21 Cip1, p27 Kip1 werden neerwaarts gereguleerd, terwijl cycline B1, cycline D1, cycline D2 en cycline E niveaus werden in Twist 1-getransfecteerde cellen opgereguleerd, vergeleken met lege-vector getransfecteerde cellen (Figuur 3A-3B). Soortgelijke resultaten werden ook waargenomen in AGS cellen (Figuur 3C-3D) bevestigen voorts dat Twist 1 kan de verspreiding van maagkanker cellen beïnvloeden. Consequent, knock-down van Twist 1 verhoogd p21 Cip1 en p27 Kip1 expressie terwijl verminderd Cycline B1, Cycline D1, D2 en Cycline cycline E expressie in NCI-N87 en AGS-cellen (Figuur 4A-4D).}

Twist 1 direct gericht op de transcriptiefactor FoxM1 bij maagkanker cellen

uit eerdere studies is gebleken dat een aantal transcriptiefactoren een reeks van genen aan de celcyclus, waaronder p21 ^{Cip1, p27 relevant kan reguleren Kip1 en cycline B1. Derhalve analyseerden we de potentiële transcriptiefactoren die deelnemen aan regulatie van celproliferatie. Van de vijf geteste transcriptionele factoren, alleen FoxM1 bleken aanzienlijk worden verhoogd in NCI-N87 overexpressie Twist 1 (figuur 5A-5B). De inductie van FoxM1 werd ook waargenomen in AGS cellen (Figuur 5C-5D). Daarnaast werd FoxM1 expressie verminderd deze cellen ontdane Twist 1 (Figuur 6A-6D), hetgeen suggereert dat FoxM1 doelwit Twist wellicht 1.}

Twist 1 upreguleert FoxM1 expressie door middel werving van p300

Vervolgens hebben we ons gericht op het moleculaire mechanisme van Twist 1 regulering van FoxM1 transcriptie. Sequentieanalyse toonde aan dat het promotorgebied van humane FoxM1 gen bevatte een potentiële Twist 1-bindingsplaats (tussen -357 en -352 bp) (figuur 7A). Luciferase assay is aangetoond dat de transcriptionele activiteit van wildtype FoxM1 promoter dramatisch werd opgereguleerd door Draai 1, terwijl de transcriptionele activiteit van de promotor die van een mutatie in Twist 1-bindingsplaatsen (Figuur 7B) werd afgeschaft. Bovendien ChIP assays toonde aan dat Twist 1 unieke wijze zou kunnen binden aan FoxM1 promotor (figuur 7C). Om te bepalen of de inductie van FoxM1 door Twist 1 benodigd is voor haar proliferatieve effect, voerden we experimenten met FoxM1 knock-down met behulp van siRNA oligo's in NCI-N87-cellen (Figuur S3A-S3B). Hierdoor de siRNA gered cellen van het proliferatieve effect van overexpressie Twist 1 (figuur S3C). Consequent, werden de functies van Twist 1 op de expressie van celcyclus regulatoren ook omgekeerd door FoxM1 siRNA oligo (figuur S3D), wat suggereert dat FoxM1 nodig is voor het rollen van Twist 1 bij maagkanker cellen.

Als een transcriptie factor, kan Twist 1 coactivatoren werven in de regulatie van doelwit genexpressie. Eerdere studies aangetoond dat p300 kan fungeren als een co-activator voor vele transcriptiefactoren. We onderzochten dus of p300 een coactivator voor Twist 1 regulering van FoxM1 expressie zou kunnen zijn. Zoals getoond in figuur 7D, kan Twist 1 interageren met p300 door co-immunoprecipitatie. De transcriptionele activiteit van FoxM1 promoter werd verder opgereguleerd door co-transfectie van p300 en Twist 1 (Figuur 7E). Bovendien hebben we verder afgeschaft p300 expressie met behulp van siRNA oligo's in NCI-N87-cellen (Figuur 7F). Zoals verwacht werd Twist 1-geïnduceerde FoxM1 expressie significant afgestompt door stilzwijgen van p300 (figuur 7G-7H). De bovenstaande gegevens laten zien dat Twist 1 opgereguleerd FoxM1 expressie door middel van een werving van transcriptie coactivator complexen, met inbegrip van p300.

Discussie

In de huidige studie, onze resultaten impliceren Twist 1 als een kritische regulator van de maag kankervooruitgang. Dit wordt gesuggereerd door verschillende lijnen van bewijs. Eerst Twist 1 overexpressie bevordert terwijl het tekort remt celproliferatie zoals getoond door BrdU en celcyclus analyse. Ten tweede, Twist 1 beïnvloedt genen expressie van celcyclus modulators, met inbegrip van de CDK-remmers p21Cip1, p27Kip1, de CDK regulator Cycline B1, Cycline D1, D2 en Cycline cycline E. Third, Twist 1 direct upregulates FoxM1 uitdrukking op het transcriptionele niveau, door middel van rekrutering van P300. Bovendien knockdown van endogene expressie FoxM1 verzwakt het proliferatieve effect van Twist 1, suggereert dat FoxM1 essentieel is voor de rol van Twist 1 bij maagkanker cellen.

Bij volwassenen, Twist 1, voornamelijk in voorlopercellen met inbegrip van de osteoblastische, myogene, odontoblastic en myelomonocytaire geslachten, met behoud van hun ongedifferentieerde staat [17]. Daarnaast TWIST1 is ook een belangrijke regulator van vele biologische processen, met inbegrip van mesenchymale ontwikkeling en bruine vetstofwisseling. Zo wordt aangenomen dat TWIST1 osteoblast differentiatie remmen door het negatief reguleren Runx2 [17]. Daarnaast wordt Twist-1 selectief tot expressie gebracht in vetweefsel, interageert met PGC-1α, mitochondriaal metabolisme en afkoppelen onderdrukken. Hierdoor transgene muizen met overexpressie Twist-1 in het vetweefsel gevoelig naar vetrijk dieet-geïnduceerde obesitas, terwijl de heterozygote knockout muizen resistent obesitas [18]. Bovendien werd Twist 1 nucleaire expressie ook waargenomen in niet-goedaardig epitheel suggereert dat Twist 1 kan een fysiologische rol in normale cellen [19] hebben. Latere studies tonen aan dat Twist 1 expressie is gecorreleerd met krachtige invasieve evenals slechte prognose in epitheliale kanker. In maagkanker, heeft een recent rapport blijkt overexpressie van de Twist 1-gen wordt vaker aangetroffen in diffuse-type carcinoom weefsels met een hoge N-cadherine genexpressie [20]. Echter geen definitieve resultaten gaven Twist bevordert de proliferatie van maagkanker. Onze bevindingen suggereerden Twist waarschijnlijk bevorderd maag kankercelproliferatie via de BrdU incorporatie assays. Bovendien werd FoxM1 eerst geïdentificeerd als nieuw transcriptioneel doel Twist 1.

FoxM1 bindt promotergebieden met een voorkeur voor een consensus [TAAACA] herkenningssequentie, hoewel met een lagere affiniteit dan andere forkhead eiwitten [21]. De expressie is beperkt tot prolifererende cellen, en worden niet in rustende en terminaal gedifferentieerde cellen. Het controleert de expressie van genen die nodig zijn voor zowel G1 /S- en G2 /M transitie en is essentieel voor mitose binnenkomst en progressie, het onderhoud chromosoom stabiliteit [22,23]. Amplificaties van FoxM1 gen is gerapporteerd in vele tumoren zoals pancreascarcinomen, borstkanker en hepatocellulair carcinoom [24-27]. Bij maagkanker, FoxM1 expressie is opgereguleerd en de remming ervan leidt tot cellulaire senescentie, dat ten minste gedeeltelijk afhankelijk van p27 Kip1 [28,29]. Naast de positieve rol in celproliferatie is FoxM1 aangetoond dat rollen in andere kankergerelateerde processen zoals invasie en metastase [30] spelen. De expressieniveaus correleren met een slechte prognose en metastase van verschillende tumoren, met inbegrip maagcarcinoom [31], wat suggereert de mogelijkheid om FoxM1 als prognose en /of diagnose marker. Tezamen FoxM1 is een veelbelovend en aantrekkelijk doelwit voor de behandeling van kanker. Daarom is het essentieel om te begrijpen hoe FoxM1 wordt gereguleerd om betere therapeutische benaderingen te ontwerpen.

FoxM1 expressie wordt strak gereguleerd zowel op mRNA en eiwitniveaus. Zijn overvloed verhogingen aan de ingang van de S-fase, pieken tijdens de G2 en M, en wordt afgebroken tijdens mitotische exit. Evenzo wordt de transcriptionele activiteit strak gereguleerd tijdens de celcyclus door multisite fosforylatie door verschillende kinasen en fosfatasen tegengaan en bereikte zijn maximale activiteit in de G2 fase van de celcyclus [32]. Onlangs is gerapporteerd dat FoxM1 expressie kan ook worden gemoduleerd door microRNAs. FoxM1 is geïdentificeerd als direct doelwit van miR-134, waarvan de spiegels omgekeerde correlatie met invasief potentieel van bepaalde NSCLC cellen [33]. Bovendien is FoxM1 ook onderdrukt door miR-370 bij maagkanker cellen [29], wat suggereert dat verdere studies nodig zijn om te onderzoeken of Twist 1 deze regulerende pathways zouden kunnen samenwerken.

Concluderend we hier laten zien dat Twist 1 overexpressie leidt tot een aanzienlijke opwaartse regulatie van FoxM1, die een belangrijke rol in de celcyclus bij maagkanker cellen speelt. Daarentegen knockdown Twist 1 vermindert FoxM1 expressie, wat suggereert dat FoxM1 een directe transcriptionele doel Twist 1. We kunnen zijn voorts bekend dat 1 Draai het promotorgebied van FoxM1 kunnen binden en vervolgens werven p300 tot FoxM1 mRNA transcriptie induceren. Daarom is onze resultaten onthullen een eerder onbekende Twist 1 /FoxM1 regelgeving route, die kan helpen om de mechanismen van de maag-proliferatie kanker te begrijpen.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
(AB) mRNA en eiwitniveaus van E-cadherine in NCI-N87 (A) en AGS (B) cellen die met adenovirus tot expressie lege vector (EV) or Twist 1.
doi: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001
(TIF)
Figuur S2.
(A-B) De cel proliferatieve potentiaal (BrdU) werd bepaald in NCI-N87 (A) of AGS (B) cellen zonder transfectie of lege vector (EV) of GFP siRNA. (C) Endogene Twist 1 expressie werd bepaald door western blot in vier maagkanker cellen (NCI-N87, AGS, HGC-27 en MGC80-3). De groeicurve van de vier cellijnen werd gemeten
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s002
(TIF)
Figuur S3.

(A-B) mRNA (A) en eiwit (B) niveaus FoxM1 in NCI-N87 cellen getransfecteerd met siRNA oligo tegen NCI-N87 of negatieve controle (Ctrl). (C) celproliferatie werd gemeten door BrdU assays NCI-N87 cellen. Cellen werden vooraf getransfecteerd met siRNA oligo gedurende 24 uur en vervolgens getransfecteerd met lege vector (EV) of Twist 1 nog eens 24 uur.
(D) mRNA niveaus van p21, p27, cycline B1, Cycline D1, D2 en Cycline cycline E werden bepaald door real-time PCR in NCI-N87 cellen. Cellen werden pre-getransfecteerd met siRNA oligo's voor 24 uur, en vervolgens getransfecteerd met lege vector (EV) of Twist 1 nog 24 uur
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s003
(TIF)

• PLoS ONE: c-Met als prognostische marker bij maagkanker: een systematische review en meta-Analysis
• PLoS ONE: slechte prognose van fosfatase van regenereren lever 3 Expressie bij maagkanker: A Meta-Analysis