PLoS One: Twist1 Elősegíti Gyomor rákos sejtek szaporodásának keresztül Up-rendelet FoxM1

absztrakt

Twist-related protein 1 (Twist1), más néven osztályú alap helix-loop-helix protein 38 (bHLHa38), szerepet játszik a sejtvonal meghatározása és differenciálódását. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy Twist1 kifejezést fel szabályozott gyomorrákban rossz klinikai kimenetelt. Emellett Twist1 javasolja, hogy vonják be progresszió az emberi gyomorrák. Azonban a biológiai funkciók nagyrészt feltáratlan. A jelen tanulmányban azt mutatják, hogy a Twist 1 túlzott expressziója vezet jelentős up-regulációját FoxM1, amely kulcsszerepet játszik a sejtciklus progresszió gyomor rákos sejtekben. Ezzel szemben, a kiütése Twist 1 csökkenti FoxM1 kifejezés arra utal, hogy FoxM1 lehet egy közvetlen transzkripciós célkitűzést Twist 1. A molekuláris szinten, további feltárják, hogy Twist 1 kötődni képes promoter régiójának FoxM1, és ezt követően toborozni P300 indukálni FoxM1 mRNS átírás. Ezért eredményeinket felfedik a korábbi ismeretlen Twist 1 /FoxM1 szabályozási út, ami segíthet megérteni azokat a mechanizmusokat gyomorrák elleni küzdelemben. Katalógusa

Citation: Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 Elősegíti Gyomor rákos sejtek szaporodásának keresztül Up-rendelet FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625 katalógusa

Szerkesztő: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: Május 31, 2013; Elfogadva: szeptember 3, 2013; Megjelent: október 24, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Qian et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A szerzők nincs támogatás vagy támogatási jelenteni. katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

A hámsejtek mesenchymalis átmenet (EMT) egy folyamat, amelynek során epiteliális sejtek elveszítik polaritás és a sejt-sejt adhézió, és mennek keresztül drámai átalakítás a citoszkeleton [1,2]. Egyidejű elvesztésével hámsejt tapadás és citoszkeleton alkatrészek, áteső sejtekben EMT szert kifejezése mesenchymalis elemek és a vándorló fenotípus [2,3].

Számos kulcsfontosságú induktoraival EMT transzkripciós faktorok, beleértve a Twist 1, Csiga, és csiga, amely elnyomni E-cadherin [4,5]. Twist1 tartozik az alap helix-loop-helix transzkripciós faktor család [6]. Kezdetben Twist1 javasolták, hogy esszenciális a fejlesztés a mesodermally származó szövetek, beleértve a izom- és oszteogén sejtvonal [7,8]. Későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy Twist 1 elősegíti EMT és alapvető szerepet játszik az áttétek számos tumor modellek [9,10]. Expression of Twist 1 szintén szerepet játszik a promóciós metasztázis és invazív patológiás altípusok többféle karcinóma [11]. Ezért, Twist 1 javasolták, hogy onkogén tulajdonságai. Például túlexpressziója Twist rhabdomyosarcoma gátolja Myc-indukálta apoptózis és beavatkozik a p53 tumor elnyomása [12]. Up-regulációját Twist társított malignus transzformáció a T-sejtes limfóma [13]. Kényszerített expressziója Twist kiváltja ellenállás az emberi rákos sejtek gátló gyógyszerek mikrotubulus képződését [14].

A hatás azonban a mechanizmusát és Twist gén elterjedése a gyomorrák továbbra is rejtély marad. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a Twist1 up-szabályozott gyomorrák-asszociált fibroblasztok rossz klinikai eredmények [15]. Emellett, down-regulációja a Twist 1 gén elnyomta a proliferációját gyomor rákos sejtek által negatívan szabályozzák az AP-1 aktivitás eredményeként a ciklin D1-expresszió csökkentésével [16]. Ebben a munkában, két gyomorrák sejtvonalat alkalmazunk hatásának vizsgálatára és mechanizmusa Twist 1 gén sejtburjánzást. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture katalógusa

Four epitheliális sejtvonalak (NCI-N87, AGS, HGC-27 és MGC80-3) származó gyomor karcinóma kaptuk az American Type Culture Collection (amerikai Egyesült Államok). A sejteket DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (Gibco, Peking). A tenyészeteket 37 ° C hőmérsékleten nedvesített atmoszférában, 5% CO _2.

kis interferáló RNS, RNS extrakció és valós idejű elemzésére

sejteket oltottunk, hogy 6- lyukú lemezekre, majd transzfektáltuk 50 nM siRNS oligonukleotidok célzott humán Twist 1 (Dharmacon, USA). Az siRNS-molekula specifikus zöld fluoreszcens fehérje (GFP) használtunk negatív kontrollként. Összesen RNS-eket kivontuk a sejtekből TRIzol reagens, és a fordított átiratokat végeztük Takara RNS PCR készlet (Takara, Kína), a gyártó utasításai szerint. Annak érdekében, hogy mennyiségileg a transzkriptumok a érdeklődés gének, valós idejű PCR-t végeztünk egy SYBR Green Premix Ex Taq (Takara, Japán) Fény Cycler 480 (Roche, Svájc).

tranziens és Luciferase Assay katalógusa

Az emberi FOXM1 promoter amplifikáltuk humán genom DNS-templát és beiktatjuk pGL4.15 basic vektor (Promega). Mutáns Twist1 kötőmotívum keletkezett PCR mutagenezis kit (Toyobo) egy primer (mutációs helyek aláhúzva): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'és a fordított komplement alapozó. Minden a tranziens transzfekció végeztük Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai), a gyártó utasításai szerint. A luciferáz riporter assay, sejteket szélesztettünk 24 mérőhelyes lemezeken, és transzfektált a jelzett plazmidokat. 48 órával a transzfekció után, a luciferáz aktivitásokat mértük a Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Co-immunprecipitációs

A sejteket összegyűjtöttük, majd lízis-pufferoldatban, amely 50 mM Tris HCl-t (pH = 7,3-7,5), 120 mM NaCi, 1 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) és a proteáz inhibitorok. A lizátumokat inkubáltunk 2,5 ug p300 vagy IgG éjszakán át 4 ° C-on. Protein A gyöngyök adtunk további 4 órán át. Gyöngyöket, amelyek immunkomplexek mossuk 1 ml jéghideg lízis pufferrel négyszer. A csapadékot denaturáltuk Laemmli (gél loading) puffert 95 ° C-on 10 percig.

Western Blot

A sejteket tripszines kezeléssel, lizáltuk Laemmli pufferben denaturáltuk 10 percig 80 ° C, és megoldódott SDS /PAGE gélen. Miután immunoblot a membránokat blokkoltuk PBS /0,1% Tween-20 7,5% zsírmentesített száraz tejet, és a primer antitestekkel inkubáltuk PBS /0,1% Tween-20, 0,1% -5% zsírmentesített száraz tejet. Ellen irányuló antitestek Twist 1, FoxM1 vásároltunk a Santa Cruz Biotechnology (USA). Anti-P300 és GAPDH antitesteket nyertünk ABCAM Company (USA). Anti-p21, p27, a ciklin B1, ciklin D1 ciklin, D2, a ciklin E és E-cadherin antitestek voltak Cellsignaling (USA). Katalógusa

A kromatin Immunoprecipitáció (chip) assay katalógusa

A kromatin immunprecipitációt ( chip) assay kit használtunk (Upstate, USA). Röviden, a sejteket fixáltuk 1% -os formaldehid és további feldolgozása segítségével Upstate chip assay kitek. Oldható kromatin volt immunoprecipitáltuk anti-Twist 1 és IgG antitesteket. A tisztítást követően, a DNS-mintákat mennyiségileg kvantitatív valós idejű PCR-primerek felhasználásával felölelő proximális régiója emberi FoxM1 promóter.

Statisztikai elemzés katalógusa

Az összes adatot átlag ± SEM. Statisztikai különbségek meghatározása egy kétmintás t próba. A statisztikai szignifikanciát csillaggal jelölve (P < 0,05), ** (P < 0,01) vagy *** (P < 0,001).

Eredmények katalógusa

Hatása Twist1 a gyomorrák sejtburjánzás katalógusa

Az első, hogy vizsgálja meg a funkcionális szerepe a Twist 1 sejtburjánzás, mi transzdukálódnak NCI-N87 vagy AGS sejtek adenovírusok tartalmazó Twist 1. vagy üres vektor (1A és 1B). Összhangban van a korábbi tanulmányok, a kifejezés a E-kadherin, egy biomarker EMT folyamat [4,5] ben alulszabályozott által Twist 1 túlexpresszió (ábra S1A-1B). Emellett, Twist 1 overexpresszió eredményezett jelentős növekedést a sejtek száma minden sejt vizsgált (ábra 1c és 1d). Egyenletesen, bróm-dezoxiuridin (BrdU) elemzése is megerősítette, hogy Twist 1 túltermelése elősegítette sejtek proliferációját (ábra 1E és 1F). Emellett, Twist 1 overexpresszáló sejtek szignifikánsan alacsonyabb volt sejtek százalékos arányát a G1 /G0 fázis és a megnövekedett sejtek százalékát az S fázisban, míg az üres vektorral transzfektált sejtek (ábra 1G-1H).

Következő , NCI-N87 vagy AGS sejteket transzfektáltunk kis interferáló RNS-t (siRNS-t) célzó Twist 1. Az siRNS oligo kimutatta hatékony Twist 1 knockdown e két sejt, szemben a GFP siRNS-transzdukált sejtek (ábra a 2A-2D). Ennek eredményeként a down-regulációja Twist 1 LED jelentős csökkenéséhez a sejtszám és proliferációját ezekben a sejtekben (ábra 2E-2H). Továbbá, csendesítése Twist 1 szignifikánsan növelte a sejtek százalékos arányát a G0 /G1 fázisban és csökkentette a sejtek százalékát az S fázisban (ábra 2I-2J). Figyelemre méltó, hogy összehasonlítottuk a proliferációs aktivitását NCI-N87 és AGS sejtek vagy anélkül transzfekciója üres vektorral vagy GFP siRNS. Eredményeink azt sugallják, hogy sem üres vektorral vagy a GFP siRNS befolyásolhatja a proliferációs aktivitás (ábra S2A). Különben is, a növekedési képesség expresszáló sejtek magasabb Twist 1 szint (NCI-N87 és AGS sejtek) viszonylag magasabb, mint a többiek (HGC-27 és MGC80-3 sejtek) (ábra S2C). Összegezve, eredményeink arra utalnak, hogy Twist 1 lehet fontos pozitív szabályozásában gyomorrák sejtek szaporodását. Katalógusa

Twist1 befolyásolja kifejezése sejtciklus-szabályozó

Twist 1 támogatni sejtburjánzást, megvizsgáltuk betöltött funkcióit gének expresszióját, amelyek szabályozzák a G1 /S átmenetet, beleértve a CDK-inhibitorok P21 ^{Cip1, p27 Kip1, a CDK szabályozó ciklin B1, ciklin D1 ciklin, D2, a ciklin E. Eredmények a valós time PCR és western blot analízis NCI-N87 cellák azt javasolta, hogy expressziója p21 Cip1, p27 Kip1 arra downregulált míg ciklin B1, ciklin D1 ciklin, D2 és a ciklin E szintek fokozódik Twist 1-transzfektált sejtekben, összehasonlítva az üres vektorral transzfektált sejtek (ábra a 3A-3B). Hasonló eredményeket figyeltek meg AGS cella (3C, ábra-3D), továbbá megerősíti, hogy Twist 1 befolyásolhatják a proliferációját gyomor rákos sejteket. Következetesen, kiütése Twist 1 fokozott p21 Cip1 és p27 Kip1 kifejezés miközben csökkentette a ciklin B1, ciklin D1 ciklin, D2, a ciklin E kifejezést NCI-N87 és AGS sejtek (4A-4D). Katalógusa}

Twist 1 közvetlenül célozza a transzkripciós faktor FoxM1 a gyomorrák sejtek

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy számos transzkripciós faktorok szabályozzák egy sor gén releváns a sejtciklus, beleértve a p21 ^{Cip1, p27 Kip1 és a ciklin B1. Így elemeztük a potenciális transzkripciós faktorok, amelyek részt vesznek szabályozásában sejtburjánzást. Az öt vizsgált transzkripciós faktorok, csak FoxM1 azt találták, hogy jelentősen nőtt az NCI-N87 túlzottan kifejező sejtek Twist 1 (5A ábra-5B). Az indukció FoxM1 is megfigyelhető volt AGS sejtekben (5C-5D). Emellett FoxM1 expresszió csökkent ezekben a sejtekben csökken a Twist 1 (6A-6D), ami arra utal, hogy FoxM1 lehet célpontja Twist 1. katalógusa}

Twist 1 upregulálja FoxM1 kifejezése révén toborzása p300 katalógusa

a következő összpontosítottunk molekuláris mechanizmusa Twist 1 szabályozásának FoxM1 átírás. A szekvencia analízis kimutatta, hogy a promoter régió a humán FoxM1 gén tartalmazott egy potenciális Twist 1 kötőhely (közötti -357 és -352 bp) (7a ábra). Luciferáz jelentés esszé azt mutatta, hogy a transzkripciós aktivitását vad típusú FoxM1 promoter drámaian fokozódik által Twist 1, mivel a transzkripciós aktivitást ben megszüntették a promoter hordozó egy mutációt Twist 1-kötő helyek (7B ábra). Továbbá, chip vizsgálatok azt mutatták, hogy Twist 1 lehet egyedileg kötődni FoxM1 promoter (ábra 7C). Annak eldöntésére, hogy indukció FoxM1 által Twist 1 van szükség annak proliferatív hatását végeztünk kísérleteket FoxM1 kiütése a siRNS oligo NCI-N87 sejtek (ábra S3A-S3B). Ennek eredményeként, az siRNS mentettek sejteket a proliferatív hatását Twist 1 túlexpresszió (ábra S3C). Folyamatosan, a funkciók Twist 1 expressziós szintjének a sejt-ciklus szabályozók is visszafordítható FoxM1 siRNS oligo (ábra S3D), ami arra utal, hogy a FoxM1 szükséges a szerepét Twist 1 gyomor rákos sejtekben.

A transzkripciós faktor, Twist 1 toborozni koaktivátorok szabályozásában a megcélzott génexpresszió. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a p300 működhetne koaktivátor számos transzkripciós faktorok. Mi tehát vizsgálni, hogy a p300 lehet koaktivátor Twist 1 szabályozására FoxM1 kifejezés. Ábrán látható a 7D, Twist 1 kölcsönhatásba léphet P300 által coimmunoprecipitation. A transzkripciós aktivitását FoxM1 promoter további upregulált ko-transzfekciója P300 és Twist 1 (ábra 7E). Sőt, tovább eltörölte p300 expresszió siRNS oligo NCI-N87 sejtek (ábra 7F). Ahogy az várható volt, Twist 1 indukált FoxM1 expresszió szignifikánsan tompította a csend a p300 (ábra 7G-7H). A fenti adatok azt mutatják, hogy a Twist 1 felülszabályozottak FoxM1 kifejezés egy felvételi a transzkripciós koaktivátor komplexek, beleértve a p300. Katalógusa

Vita katalógusa

A jelenlegi vizsgálat során, eredményeink azt Twist 1 kritikus szabályozója a gyomorsav daganatos progresszió. Erre utal számos bizonyíték. Először is, Twist 1 overexpressziója elősegíti míg a hiányosság gátolja a sejtproliferációt, amint azt a BrdU és a sejt-ciklus elemzés. Másodszor, Twist 1 befolyásolja a gének expresszióját a sejt-ciklus modulátorok, beleértve a CDK-inhibitorok p21Cip1, p27Kip1, a CDK szabályozó ciklin B1, ciklin D1 ciklin, D2, a ciklin E. Harmadszor, Twist 1 közvetlenül upregulálja FoxM1 expresszióját transzkripciós szinten keresztül toborzása P300. Továbbá, kiütése endogén FoxM1 kifejezés csillapítja a proliferatív hatását Twist 1, ami arra utal, hogy a FoxM1 elengedhetetlen szerepét Twist 1 gyomor rákos sejtekben.

A felnőttek, Twist 1 főleg kifejezett prekurzor sejtek többek között a osteoblastos, miogén, odontoblastic és myeiomonocytás vonalból, megtartják differenciálatlan állapotban [17]. Azonkívül, Twist1 szintén fontos szabályozója a sok más biológiai folyamatok, beleértve a mesenchymalis fejlődés és a barna zsír metabolizmusát. Például Twist1 úgy gondoljuk, hogy gátolják az osteoblast differenciálódást által negatívan szabályozó Runx2 [17]. Emellett, Twist-1 szelektíven expresszálódik a zsírszövetben, kölcsönhatásba lép a PGC-1α, hogy elnyomják a mitokondriális anyagcsere és szétkapcsolása. Ennek eredményeként a transzgenikus egerek overexpresszáló Twist-1 a zsírszövetben hajlamosak a magas zsírtartalmú-diéta által kiváltott elhízás, mivel annak heterozigóta knockout egerek elhízással rezisztens [18]. Sőt, Twist 1 nukleáris expressziót is megfigyelhető volt, a nem-rákos epitélium, ami arra utal, hogy a Twist 1 lehet egy élettani szerepe a normális sejtekben [19]. Későbbi tanulmányok azt mutatják, hogy Twist 1 expressziója korrelál a potens invazivitását valamint rossz prognózissal epiteliális rák. A gyomorrák, egy nemrégiben készült jelentés kimutatta túltermelése Twist 1 gén gyakrabban előforduló diffúz típusú carcinoma szövetekben magas N-cadherin génexpresszió [20]. Azonban nem végleges eredmények azt mutatták, Twist elősegíti elterjedése gyomorrák. Eredményeink azt Twist valószínűleg támogatni gyomorrák sejtburjánzást, a BrdU beépülését vizsgálatokban. Ezen túlmenően, FoxM1 először is azonosították mint új transzkripciós célkitűzést Twist 1.

FoxM1 kötődik promóter régiók, ahol a preferencia egy konszenzus [TAAACA] felismerő szekvenciát, bár kisebb affinitással, mint a többi forkhead fehérjék [21]. Expresszióját korlátozódik szaporodó sejtek, és kizárt nyugalmi és véglegesen differenciálódott sejteket. Ez vezérli a gének expresszióját szükséges mind a G1 /S és G2 /M átmenet, és nélkülözhetetlen a mitotikus belépést és progressziójában, karbantartásáért kromoszóma stabilitás [22,23]. Amplifikációkat a FoxM1 gén számoltak be számos daganat, mint például a hasnyálmirigy-karcinómák, emlőrák és hepatocelluláris karcinóma [24-27]. A gyomorrák, FoxM1 kifejezés is fel-szabályozott és a gátlás vezet sejtek elöregedése, ami legalábbis részben, függ a p27 kip1 [28,29]. Amellett, hogy a pozitív szerepet a sejtproliferációra FoxM1 kimutatták, hogy szerepet játszanak a más rákkal kapcsolatos folyamatok, például az invázió és metasztázis [30]. A expressziós szintje korrelál a gyenge prognózissal és metasztázis különböző tumorokban, beleértve a gyomor karcinóma [31], ami arra utal, a lehetőségét, FoxM1 mint egy prognózis és /vagy diagnosztizálására markert. Összefoglalva, FoxM1 egy ígéretes és vonzó célpont a rák terápiájában. Ezért fontos, hogy megértsük, hogyan FoxM1 szabályozza annak érdekében, hogy a hatékonyabb terápiás megközelítések.

FoxM1 kifejezés szigorúan szabályozott mind mRNS, mind fehérje szinten. A bőség növekszik a bejegyzést az S-fázisú, csúcsok alatt G2 és M degradálódik során mitózis. Hasonlóképpen, annak transzkripciós aktivitását szigorúan szabályozott a teljes sejtciklus által multisite foszforiláció különböző kinázok, és annak ellensúlyozva foszfatázok, elérve a maximális aktivitás a G2 fázisban a sejtciklus [32]. Újabban arról számoltak be, hogy a FoxM1 kifejezés is modulálható mikroRNS. FoxM1 azonosították közvetlen célpontja a miR-134, melynek szint fordítottan arányos a inváziós potenciált néhány NSCLC-sejtek [33]. Sőt, FoxM1 is elnyomta a miR-370 a gyomorrák sejtek [29], ami arra utal, hogy további vizsgálatokra van szükség annak vizsgálatára, hogy Twist 1 tudnának együttműködni e szabályozási utakat.

Összefoglalva, mi itt azt mutatják, hogy Twist 1 túlzott expressziója vezet jelentős up-regulációját FoxM1, amely kulcsszerepet játszik a sejtciklus progresszió gyomor rákos sejtekben. Ezzel szemben, a kiütése Twist 1 csökkenti FoxM1 kifejezés arra utal, hogy FoxM1 lehet egy közvetlen transzkripciós célkitűzést Twist 1. Azt további feltárják, hogy Twist 1 kötődni képes promoter régiójának FoxM1, és ezt követően toborozni P300 indukálni FoxM1 mRNS transzkripcióját. Ezért eredményeinket felfedik a korábbi ismeretlen Twist 1 /FoxM1 szabályozási út, ami segíthet megérteni azokat a mechanizmusokat gyomorrák elleni küzdelemben. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1.
(AB) mRNS és fehérje szinten az E-cadherin NCI-N87 (A) és AGS (B) transzfektált sejtek adenovírus expresszáló üres vektor (EV) vagy Twist 1.
doi: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
(A-B) a sejtproliferációs potenciál (BrdU) határoztuk meg NCI-N87 (A) vagy AGS (B) sejtek nélkül, vagy transzfekciója üres vektor (EV) vagy GFP siRNS. (C) Az endogén Twist 1 expresszióját határoztuk western blot négy gyomorrák sejtek (NCI-N87, AGS, HGC-27 és MGC80-3). A növekedési görbe négy sejtvonalak mértük. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0077625.s002 katalógusa (TIF) hotelben ábra S3.

(A-B) mRNS-t (A) és a fehérje (B) szintje FoxM1 NCI-N87 transzfektált sejtek siRNS oligonukleotidok ellen NCI-N87 vagy negatív kontroll (Ctrl). (C) proliferációs aktivitás mértük BrdU assay NCI-N87 sejteket. A sejteket előzetesen transzfektált siRNS oligonukleotidok 24 órán át, majd a transzfektált üres vektor (EV) vagy Twist 1 további 24 órán át.
(D) mRNS szinteket a p21, p27, ciklin B1, ciklin D1 ciklin, D2 és ciklin E határoztuk meg real-time PCR NCI-N87 sejteket. A sejteket előzetesen transzfektált siRNS oligonukleotidok 24 órán át, majd a transzfektált üres vektor (EV) vagy Twist 1 további 24 órán át.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0077625.s003 katalógusa (TIF)

• PLoS One: c-Met prognosztikus markerként gyomorrákban: rendszeres felülvizsgálatát és meta-Analysis
• PLoS One: rossz prognózis a foszfatáz májszövetéből 3 Expression gyomorrákban: A Meta-Analysis