Plos ONE: Twist1 Spodbuja želodca Cancer Cell širjenju skozi Up-uredbo FoxM1

Povzetek

povezane s Twist protein 1 (Twist1), znan tudi kot razred Osnovni helix-loop-helix protein 38 (bHLHa38), je bila vpletena v določanje celic rodu in diferenciacijo. Prejšnje študije kažejo, da je Twist1 izraz up-urejena raka želodca s slabimi klinične izide. Poleg tega je Twist1 predlagal, da se vključijo v napredovanje raka človeške želodčne. Vendar pa njegove biološke funkcije ostajajo v veliki meri neraziskana. V tej raziskavi smo pokazali, da Twist 1 čezmernim vodi do znatnega up-regulacije FoxM1, ki ima ključno vlogo pri napredovanju celičnega ciklusa v želodcu rakavih celic. V nasprotju s tem, rasklapanje Twist 1 zmanjšuje FoxM1 ekspresijo, kar kaže, da lahko FoxM1 neposredna transkripcijski cilj Twist 1. Na molekularnem nivoju, smo nadalje razkriva, da Twist 1 lahko vežejo na promotorsko regijo FoxM1 in nato zaposliti P300 inducira FoxM1 mRNA prepis. Torej, naši rezultati odkrili prejšnji neznani Twist 1 /FoxM1 regulativnega pot, ki lahko pripomore k razumevanju mehanizmov širjenja raka želodca

Navedba. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) Twist1 Spodbuja želodca Cancer Cell širjenju skozi regulacijo navzgor FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10,1371 /journal.pone.0077625

Urednik: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, Združene države Amerike

Prejeto: 31. maj 2013; Sprejeto: 3. september 2013; Objavljeno: 24. oktober 2013

Copyright: © 2013 Qian et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi.. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

epitelijskih-mezenhimskih-prehod (EMT) je proces, v katerem epitelne celice izgubijo polarnost in adhezijo celic v celici, in opraviti dramatično preoblikuje v citoskeleta [1,2]. Sočasno z izgubo epitelnih celic inercije in citoskeletnim komponent, celice doživlja EMT pridobiti izraz mezenhimskih komponent in migracijski fenotipa [2,3].

več ključnih spodbujevalci EMT so transkripcijski faktorji, vključno Twist 1, polž, in Slug, ki zatirajo E-kadherina izraz [4,5]. Twist1 pripada osnovno helix-loop-helix transkripcijskega faktorja družine [6]. Sprva je bil Twist1 predlagal bistvenega pomena pri razvoju mesodermally pridobljenih tkiv, vključno mišic in osteogenih celičnih linij [7,8]. Kasnejše študije so pokazale, da Twist 1 spodbuja EMT in igra pomembno vlogo pri metastaz v različnih modelih tumorjev [9,10]. Izražanje Twist 1 je bil vpleten tudi v promocijo metastaz in invazivnih patoloških podtipov na več vrst raka [11]. Zato je bila Twist 1 predlagano, da imajo onkogenih lastnosti. Na primer, čezmernim Twist v rabdomiosarcomom zavira myc-inducirano apoptozo in ovira zatiranje p53 tumorja [12]. Up-ureditev je Twist, povezane z maligno transformacijo v T-celičnega limfoma [13]. Prisilno izraz Twist sproži odpornost rakavih celic človeških do zdravil, ki zavirajo nastanek mikrotubulov [14].

Vendar učinek in mehanizem Twist gena o širjenju raka želodca ostaja skrivnosten. Nedavne študije so pokazale, da je Twist1 up-urejena v želodcu, povezanimi z rakom fibroblastov s slabimi kliničnih izidov [15]. Poleg tega dol-regulacija gena Twist 1 zatreti širjenje želodca rakavih celic, ki negativno regulacijo dejavnosti AP-1, ki izhaja v izrazu ciklin D1 zmanjšuje [16]. V tem delu so bili zaposleni dve celičnih linij raka želodca, naj preuči učinke in mehanizem Twist 1 gena na proliferacijo celic.

Materiali in metode

Cell Culture

Štiri epitelne celične linije (NCI-N87, AGS, HGC-27 in MGC80-3), ki izhajajo iz raka želodca so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection (ZDA). Celice smo kultivirali v DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma (Gibco, Beijing). Kulture so se ohranili pri 37 ° C v vlažni atmosferi s 5% CO _2.

male interferenčne RNA, ekstrakcijo RNA in v realnem času analize

Celice zasejemo na 6- tudi plošče nato transfekciji s 50nm siRNA oligov ciljajo ljudi Twist 1 (Dharmacon, ZDA). SiRNA molekula specifična za zeleni fluorescentni protein (GFP) smo uporabili kot negativno kontrolo. Skupaj RNA so bili pridobljeni iz celic, ki jih TRIzola reagenta in povratne prepisi so bile izvedene s Takara RNA PCR kit (Takara, Kitajska) po protokolu proizvajalca. Da izračunavanja prepise obrestnih genov, PCR v realnem času smo izvedli z uporabo SYBR Green premiks Ex Taq (Takara, Japonska) na svetlobo ciklerja 480 (Roche, Švica).

prehodne Transfekcije in luciferazni Testi

promotor Human FOXM1 je bila dopolnjena s predlogi človeške genomske DNA in vstavili v pGL4.15 osnovni vektor (Promega). Mutant Twist1 vezavo motiv je bil ustvarjen s pomočjo PCR mutagenezo komplet (Toyobo) s primerjem (mutacij strani podčrtano): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 ", in obratno dopolnilo primer. Vse prehodne Transfekcije smo izvedli Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Šanghaj), v skladu z navodili proizvajalca. Za luciferazno reporterskih testih smo celice zasejali v 24 vdolbinami in transfektirali z navedenimi plazmidov. 48 ur po transfekciji smo luciferazne aktivnosti meri z uporabo Dual luciferazno Reporter preskusnega sistema (Promega, ZDA).

Co-imuno

Celice so bile pridelane, resuspendirali v lize pufru, ki vsebuje 50 mM tris- HCl (pH 7,3-7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% inhibitorji Triton X-100) in proteaze. Lizate smo inkubirali s 2,5 ig p300 ali IgG preko noči pri 4 ° C. Kroglice proteinske A smo dodali dodatne 4 ure. Kroglice, ki vsebujejo imunske komplekse smo sprali z 1 ml ledeno hladnega liznega pufra za štirikrat. Precipitate smo denaturirali v Laemmli (gel nalaganja) varovalnega pri 95 ° C za 10 minut.

Western Blot

Celice požanjemo s trypsinization, lizirali v Laemmli pufru, denaturirana 10 minut pri 80 ° C C, in rešiti na SDS /PAGE gelov. Po imuno smo membrane v PBS blokiran /0,1% Tween-20 z 7,5% nemastno mleko v prahu, ter primarna protitelesa smo inkubirali v PBS /0,1% Tween-20 z 0,1% -5% nemastno mleko v prahu. Protitelesa proti Twist 1, so FoxM1 kupljene od Santa Cruz Biotechnology (ZDA). Anti-P300 in GAPDH protitelesa so bili pridobljeni iz Abcam Company (ZDA). Anti-p21, P27, so ciklin B1, ciklin D1, ciklin D2, ciklin E in E-kadherina protitelesa iz Cellsignaling (ZDA).

kromatina imuno (chip) test

kromatina imunoprecipitacije ( Chip) Test kompleti so bili uporabljeni (Upstate, ZDA). Na kratko, celice določena z 1% formaldehida in nadalje obdelujejo s pomočjo podeželju čipov testa s Kits. Topen v kromatin je imuno z anti-Twist 1 in IgG protiteles. Po čiščenju, so bili vzorci DNA količinsko s kvantitativno PCR v realnem času z uporabo primerjev ki zajemajo proksimalno regijo promotorja humanega FoxM1.

Statistična analiza

Vsi podatki so prikazani kot povprečje ± SEM. Statistične razlike smo določili z dvorepe testom t. Statistično značilnost je prikazana kot * (P < 0,05), ** (P < 0,01) ali *** (P < 0,001).

Rezultati

Vpliv Twist1 o širjenju

Na prvi, da razišče funkcionalno vlogo Twist 1 v celične proliferacije, smo transduciramo NCI-N87 ali AGS želodca rakave celice celice z adenovirusi vsebujejo Twist 1 ali prazno vektor (Slika 1A in 1B). Skladen s prejšnjimi študijami, izraz E-kadherina, biomarker za EMT postopka [4,5] je bila navzdol ureja Twist 1 prekomerno (Slika S1A-1B). Poleg tega Twist 1 čezmernim povzročilo znatno povečanje števila celic v vseh celicah testiranih (slika 1C in 1D). Dosledno, bromdeoksiuridina analiza (BrdU), prav tako potrdila, da Twist 1 prekomerno spodbujajo celično proliferacijo (slika 1E in 1F). Poleg tega je imel Twist 1 s prekomerno ekspresijo celice bistveno nižji odstotek celic v G1 /G0 fazi in povečan delež celic v fazi S, v primerjavi s praznimi vektorskih transfekcije celic (slika 1 G-1).

Naslednja , NCI-N87 ali AGS celice smo transfektirali z majhno vmešavanje RNA (siRNA) ciljnih Twist 1. siRNA oligo pokazala je učinkovito Twist 1 rasklapanje v teh dveh celicah, v primerjavi z GFP siRNA transduciranih celic (slika 2A-2D). Kot rezultat, navzdol ureditev Twist 1 privedla do znatnega zmanjšanja števila celic in proliferacijo teh celic (slika 2E-2H). Poleg tega utišanje Twist 1 bistveno povečal delež celic v G0 /G1 fazi zmanjšala odstotek celic v fazo S (slika 2I-2J). Predvsem smo primerjali aktivnost širjenju NCI-N87 in AGS celic z ali brez transfekciji praznega vektorja ali GFP siRNA. Naši rezultati kažejo, da niti prazen vektor ali GFP siRNA vplivajo na aktivnost proliferacije celic (slika S2A). Poleg tega je sposobnost rast celic, ki izražajo višjo Twist 1 ravneh (NCI-N87 in AGS celice) je sorazmerno višja od drugih (HGC-27 in MGC80-3 celic) (Slika S2C). Skupaj, naši rezultati kažejo, da Twist 1 je lahko pomemben pozitiven regulacijo proliferacije želodčnega raka celic.

Twist1 vpliva na izražanje regulatorjev celičnega cikla

Kot Twist 1 spodbuja proliferacijo celic, smo pregledali njegove funkcije na izražanje genov, ki regulirajo G1 /s prehoda, vključno z CDK inhibitorjev p21 ^{Cip1, P27 Kip1 je CDK regulator ciklin B1, ciklin D1, ciklin D2 in ciklin E. Rezultati iz realnem PCR v realnem času in western blot analiza NCI-N87 celic, je predlagal, da izraz p21 Cip1, P27 Kip1 so navzdol reguliranih medtem ciklin B1, so ciklin D1, ciklin D2 in ciklin E ravni povečana pri Twist 1-transfekciji celic, v primerjavi s praznimi vektorskih transfekcije celic (Slika 3A-3B). so opazili tudi pri AGS celice (slika 3C-3D) Podobne rezultate, dodatno potrjuje, da je Twist 1 lahko vpliva na širjenje želodca rakavih celic. Dosledno, rasklapanje Twist 1 povečalo p21 Cip1 in P27 Kip1 izraz, medtem ko zmanjša ciklin B1, ciklin D1, ciklin D2 in ciklin E izraz v NCI-N87 in AGS celic (slika 4A-4D).}

Twist 1 neposredno cilja na transkripcijski faktor FoxM1 v želodčnih rakavih celic

Prejšnje študije so pokazale, da lahko več transkripcijske dejavnike urediti vrsto genov, ki so pomembni za celični ciklus, vključno z p21 ^{Cip1, P27 Kip1 in ciklin B1. Tako smo analizirali možne transkripcijske dejavnike, ki sodelujejo pri regulaciji celične proliferacije. Od petih testiranih transkripcijskih dejavnikov, so našli le FoxM1, da je v NCI-N87 celic s prekomerno ekspresijo Twist 1 (slika 5A-5B) bistveno povečala. Indukcija FoxM1 so opazili tudi pri AGS celic (slika 5C-5D). Poleg tega je bila FoxM1 izraz zmanjšala v teh celic osiromašenega Twist 1 (slika 6A-6d), kar kaže, da bi lahko FoxM1 tarča Twist 1.}

Twist 1 upregulates FoxM1 izražanje z zaposlovanjem P300

Nato smo se osredotočili na molekularni mehanizem Twist 1 urejanja FoxM1 prepisu. sekvenčna analiza pokazala, da promotorska regija gena humanega FoxM1 vseboval potencialno Twist 1 vezavno mesto (med -357 in -352 bp) (slika 7A). Luciferaza poročilo testa so pokazali, da je transkripcijski aktivnost divjega tipa FoxM1 promotorja močno navzgor regulirana z Twist 1, medtem ko je bila transkripcijski aktivnost odpravljena promotorja, ki nosi mutacijo v Twist 1-vezavna mesta (slika 7b). Poleg tega Chip testi so pokazali, da bi Twist 1 enolično veže FoxM1 promotor (slika 7C). Da bi ugotovili, ali je potrebna indukcija FoxM1 s Twist 1 za njeno proliferativno namen smo izvedli poskuse z FoxM1 rasklapanje uporabo siRNA olige v NCI-N87 celic (Slika S3A-S3B). Kot rezultat, siRNA rešili celice iz proliferativni učinek Twist 1 prekomerno (slika S3C). Dosledno so funkcije Twist 1 na ravni ekspresije regulatorjev celičnega cikla obrnil tudi FoxM1 siRNA oligov (slika S3D), kar kaže, da je FoxM1 potrebna za vloge Twist 1 v želodcu rakavih celic.

Kot transkripcijski faktor, lahko Twist 1 zaposli coactivators pri urejanju ciljne genske ekspresije. Prejšnje študije so pokazale, da lahko P300 deluje kot coactivator za mnoge transkripcijski faktorji. Tako smo preverili, ali bi P300 je coactivator za Twist 1 regulacijo FoxM1 izražanja. Kot je prikazano na sliki 7D, lahko Twist 1 interakcijo z p300 po coimmunoprecipitation. Transkripcijski aktivnost FoxM1 promotor je bil nadalje molekul, ki so-transfekciji p300 in Twist 1 (slika 7E). Poleg tega smo dodatno odpravijo P300 izraz uporablja siRNA olige v NCI-N87 celic (Slika 7F). Kot je bilo pričakovati, je Twist 1 inducirane FoxM1 izraz bistveno posneti s tišini p300 (Slika 7G-7H). Zgoraj navedeni podatki so pokazali, da je Twist 1 molekul FoxM1 izražanje skozi zaposlovanje transkripcijskih coactivator kompleksov, vključno p300.

Pogovor

V sedanji raziskavi, naši rezultati kažejo Twist 1 kot kritični regulator želodca napredovanje raka. To je predlagal več vrstah dokazov. Najprej Twist 1 čezmernim spodbuja medtem ko je njegova pomanjkljivost inhibira celično proliferacijo, kot je prikazano z BrdU in analize celičnega cikla. Drugič, Twist 1 vpliva na gene izražanje modulatorji celičnega cikla, vključno z CDK zaviralci p21Cip1, p27Kip1 je CDK regulator ciklin B1, ciklin D1, ciklin D2 in ciklin E. Tretjič, Twist 1 neposredno upregulates FoxM1 izraz na transkripcijski ravni, prek zaposlovanje P300. Poleg tega, rasklapanje endogenega FoxM1 izražanja ublaži proliferativni učinek Twist 1, kar pomeni, da je FoxM1 bistvenega pomena za vloge Twist 1 v želodcu rakavih celic.

Pri odraslih je Twist 1. izraža predvsem v predhodnikov celic, vključno z osteoblastnimi, myogenic, odontoblastic in mielomonocitno linij, ohranjajo svojo neraznovrstne stanja [17]. Poleg tega Twist1 je tudi pomemben regulator številnih drugih bioloških procesov, vključno z razvojem mezenhimskega in presnove rjave maščobe. Na primer, Twist1 verjel, da zavira diferenciacijo osteoblastne, ki negativno regulacijo RUNX2 [17]. Poleg tega je Twist-1 selektivno izražena v maščobnem tkivu, komunicira z PGC-1 a, zatreti mitohondrijske presnovo in odpenjanje. Kot rezultat, transgenske miši prekomerno ekspresijo Twist-1 v maščobnem tkivu so nagnjeni k mastnim-dieti povzročene debelosti, medtem ko so njeni heterozigotnih knockout miši debelost odporen [18]. Poleg tega so opazili tudi v ne-noncancerous epitela Twist 1 jedrska izraz, kar kaže, da Twist 1 ima lahko fiziološko vlogo pri normalnih celic [19]. Kasnejše študije kažejo, da Twist 1 izraz, povezana z močnim invazivnosti kot tudi slabo prognozo raka epitela. Pri raku želodca, je nedavno poročilo pokazale prekomerno izražanje gena Twist 1 pogosteje najdemo v difuzna tipa karcinoma tkivih z visoko N-kadherina genske ekspresije [20]. Vendar pa so dokončni rezultati kažejo Twist spodbuja širjenje raka želodca. Naše ugotovitve predlagane Twist verjetno spodbuja proliferacijo želodčni rak celic, s pomočjo vključitvi teste brdu. Poleg tega je bila FoxM1 najprej opredeljena kot nova transkripcijske cilj Twist 1.

FoxM1 veže območij promotorja z prednost zaporedje soglasno [TAAACA] priznanje, čeprav z manjšo afiniteto kot drugi forkhead proteinov [21]. Njen izraz je omejena na razraščajo celice, in izključene iz mirnih in končno diferenciranih celic. Obvladuje izražanje genov, ki so potrebni za tako G1 /S in G2 /M prehodu in je bistvenega pomena za mitotičnem vstop in napredovanje, vzdrževanje stabilnosti kromosomov [22,23]. Ojačitve FoxM1 gena so poročali v številnih tumorjih kot pankreasni karcinom, rak dojk in hepatocelularni karcinom [24-27]. V raka želodca, FoxM1 izraz je tudi navzgor regulirano in njegovo zaviranje povzroča celično staranje, ki je vsaj deloma odvisna od P27 kip1 [28,29]. Poleg njegovo pozitivno vlogo v celični proliferaciji, FoxM1 je bilo dokazano, da igrajo vlogo v drugih procesov, povezanih z rakom, kot invazija in metastaz [30]. Njegove vrednosti izraz v korelaciji s slabo prognozo in metastaze v različnih tumorjev, vključno z rakom želodca [31], kar kaže na možnost uporabe FoxM1 kot prognozo in /ali diagnostični marker. Skupaj, FoxM1 je obetaven in privlačna tarča za terapijo raka. Zato je pomembno, da razumemo, kako je FoxM1 urediti, da bi oblikovali boljše terapevtskih pristopov.

FoxM1 izraz je strogo nadzorovana tako na ravni mRNA in beljakovin. Njegove številčnosti poveča ob vstopu S-fazi, vrhovi med G2 in M, in se razgradi v mitotičnem izhoda. Podobno je njena transkripcijsko aktivnost dobro urejena v celotnem celičnega cikla, ki ga na več mestih fosforilaciji različne kinaze, in njenih zoperstavi fosfataze, ki je znašala maksimalno aktivnost v G2 fazi celičnega cikla [32]. Nedavno je bilo poročali, da lahko FoxM1 izraz treba prilagoditi tudi microRNAs. FoxM1 je bila opredeljena kot neposredni cilj miR-134, katerega količino obratno povezana z invazivno potencial nekaterih nedrobnoceličnim rakom pljuč celic [33]. Poleg tega je FoxM1 zatrta tudi miR-370 v želodčnih rakavih celic [29], kar kaže, da so potrebne nadaljnje študije, da razišče, ali bi Twist 1 sodelovati teh regulativnih poti.

Na koncu smo tukaj pokazali, da Twist 1 čezmernim vodi do znatnega up-regulacije FoxM1, ki ima ključno vlogo pri napredovanju celičnega ciklusa v želodcu rakavih celic. V nasprotju s tem, rasklapanje Twist 1 zmanjšuje FoxM1 ekspresijo, kar kaže, da lahko FoxM1 neposredna transkripcijski cilj Twist 1. Nadaljevali smo razkrili, da Twist 1 lahko veže na promotorsko regijo FoxM1 in nato zaposliti P300 inducira FoxM1 mRNA transkripcijo. Torej, naši rezultati odkrili prejšnji neznani Twist 1 /FoxM1 regulativnega pot, ki lahko pripomore k razumevanju mehanizmov širjenja raka želodca.

Podpora Informacije
Slika S1.
(AB) mRNA in vsebnosti beljakovin v E-kadherina v NCI-N87 (A) in AGS celice (B) transfekciji s adenovirusi izražajo prazno vektor (EV) ali Twist 1.
doi: 10,1371 /journal.pone .0077625.s001
(IOD)
Slika S2.
(A-B) celične proliferacije potencial (BrdU) je bila določena v NCI-N87 (A) ali AGS (B) celic z ali brez transfekciji prazne vektorja (EV) ali GFP siRNA. (C) Endogeni Twist 1 izraz, je bila določena z Western Blot v štirih želodčne rakavih celic (NCI-N87, AGS, HGC-27 in MGC80-3). Krivulja rasti štirih celičnih linij je bila izmerjena
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s002
(IOD)
Slika S3.

(A-B) mRNA (A) in beljakovin (B) ravni FoxM1 v NCI-N87 celic transfekciji s siRNA oligov proti NCI-N87 ali negativne kontrole (Ctrl). (C) aktivnost celic proliferacijo merimo s brdu testih v NCI-N87 celic. Celice so bile predhodno transfektirali z siRNA oligov 24 ur in nato transfektirali s praznim vektorjem (EV) ali Twist 1 za nadaljnjih 24 ur. Nivoje
(D) mRNK iz p21, P27, ciklin B1, ciklin D1, D2 in ciklin ciklin E smo določili z PCR v realnem času v NCI-N87 celic. Celice so bile predhodno transfektirali z siRNA oligov 24 ur, nato transfektiramo s praznim vektorjem (EV) ali Twist 1 za nadaljnjih 24 ur
doi. 10,1371 /journal.pone.0077625.s003
(IOD)

• Plos ONE: c-Met kot prognostičnih Marker želodčnega raka: sistematični pregled in Meta-Analysis
• Plos ONE: Slabo Prognoza fosfataze Sanacija jeter 3 Expression želodčnega raka: A Meta-Analysis