PLOS ONE: TWIST1 favorise le cancer gastrique prolifération cellulaire grâce à une régulation de FoxM1

Résumé

protéine apparentée Twist-1 (TWIST1), également connu sous le nom de classe A base de protéine hélice-boucle-hélice 38 (bHLHa38) , a été impliquée dans la détermination de la lignée cellulaire et la différenciation. Des études antérieures démontrent que l'expression TWIST1 est régulée à la hausse dans le cancer gastrique avec les résultats cliniques pauvres. D'ailleurs, TWIST1 est suggéré d'être impliqués dans la progression du cancer de l'estomac humain. Cependant, ses fonctions biologiques restent largement inexplorées. Dans la présente étude, nous montrons que Twist 1 surexpression conduit à une régulation à la hausse significative de FoxM1, qui joue un rôle essentiel dans la progression du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses gastriques. En revanche, knockdown de Twist 1 réduit l'expression de FoxM1, suggérant que FoxM1 pourrait être une cible transcriptionnelle directe de Twist 1. Au niveau moléculaire, nous révélons en outre que Twist 1 pourrait se lier à la région promotrice du FoxM1, et recruter ensuite p300 à induire FoxM1 transcription de l'ARNm. Par conséquent, nos résultats découvrir un Twist inconnu précédent 1 /voie réglementaire FoxM1, ce qui peut aider à comprendre les mécanismes de la prolifération du cancer gastrique

Citation:. Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X ( 2013) TWIST1 favorise le cancer gastrique prolifération cellulaire grâce à une régulation de FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. doi: 10.1371 /journal.pone.0077625

Editeur: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, États-Unis d'Amérique

Reçu: 31 mai 2013; Accepté: 3 Septembre 2013; Publié le 24 Octobre, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Qian et al. C'est un article à accès ouvert distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation illimitée, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) est un procédé par lequel les cellules épithéliales perdent la polarité et l'adhésion de cellule à cellule et subissent un remodelage dramatique du cytosquelette [1,2]. Parallèlement à la perte d'adhérence des cellules et des composants du cytosquelette epitheliales, les cellules subissant l'acquisition EMT expression de composants mésenchymateux et un phénotype migratoire [2,3].

Plusieurs inducteurs clés de EMT sont des facteurs de transcription, y compris Twist 1, Escargot et Slug, qui réprime l'expression E-cadhérine [4,5]. TWIST1 appartient à la famille de base du facteur de transcription hélice-boucle-hélice [6]. Dans un premier temps, TWIST1 a été considérée comme essentielle dans le développement des tissus dérivées du mésoderme, y compris les muscles et les lignées de cellules ostéogéniques [7,8]. Des études ultérieures ont montré que Twist 1 favorise EMT et joue un rôle essentiel dans les métastases dans plusieurs modèles tumoraux [9,10]. L'expression de torsion 1 a également été impliquée dans la promotion des métastases et des sous-types pathologiques invasifs dans plusieurs types de cancer [11]. Par conséquent, une torsion a été proposé d'avoir des propriétés oncogéniques. Par exemple, la surexpression de Twist dans le rhabdomyosarcome inhibe l'apoptose induite par Myc et interfère avec la suppression de tumeur p53 [12]. La régulation de Twist est associée à une transformation maligne dans le lymphome T [13]. L'expression forcée de torsion déclenche la résistance des cellules cancéreuses humaines à des médicaments qui inhibent la formation des microtubules [14].

Cependant, l'effet et le mécanisme du gène Twist sur la prolifération du cancer gastrique reste énigmatique. Des études récentes ont montré que TWIST1 est régulée à la hausse dans les fibroblastes associés au cancer gastrique avec les résultats cliniques pauvres [15]. En outre, la régulation négative du gène twist 1 a supprimé la prolifération des cellules du cancer de l'estomac en régulant négativement l'activité de l'AP-1 résultant de l'expression de la cycline D1 décroissante [16]. Dans le présent travail, deux lignées cellulaires de cancer gastrique ont été utilisés pour étudier l'effet et le mécanisme de Twist 1 gène sur la prolifération cellulaire.

Matériel et méthodes

Culture
Cell

Four des lignées de cellules epitheliales (NCI-N87, AGS, HGC-27 et MGC80-3) dérivées d'un carcinome gastrique ont été obtenus auprès de American type Culture Collection (USA). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 10% de sérum fœtal bovin (Gibco, Pékin). Les cultures ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO _2.

petits ARN interférents, l'extraction de l'ARN et analyse en temps réel

Les cellules ont été ensemencées sur 6- bien des plaques puis transfectées avec oligos 50nM siARN ciblant Twist 1 humain (Dharmacon, États-Unis). Le siRNA molécule spécifique pour la protéine fluorescente verte (GFP) a été utilisé comme témoin négatif. Les ARN totaux des cellules sont extraites par le réactif Trizol et la transcription inverse a été réalisée par le kit Takara RNA PCR (Takara, Chine) suivant le protocole du fabricant. Afin de quantifier la transcription des gènes d'intérêt, PCR en temps réel a été réalisée en utilisant un vert Premix Ex Taq SYBR (Takara, Japon) sur Light Cycler 480 (Roche, Suisse).

Transient transfections et luciférase Assays

promoteur FOXM1 humain a été amplifié à partir de la matrice d'ADN génomique humain et inséré dans pGL4.15 vecteur de base (Promega). un motif de liaison Mutant TWIST1 a été généré en utilisant un kit de mutagenèse par PCR (Toyobo) avec une amorce (sites de mutation sont soulignés): 5 'CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3' et une amorce inverse complémentaire. Toutes les transfections transitoires ont été effectuées en 2000 Lipofectamine (Invitrogen, Shanghai), selon les instructions du fabricant. Pour les dosages de rapporteur de luciférase, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et transfectées avec les plasmides indiqués. 48 heures après la transfection, les activités luciférase ont été mesurées en utilisant le système à double luciférase Reporter Assay (Promega, USA).

Co-immunoprécipitation

Les cellules ont été récoltées, remises en suspension dans du tampon de lyse contenant 50 mM de Tris- HCl (pH 7,3 à 7,5), 120 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 0,5% d'inhibiteurs TRITON X-100) et la protéase. Les lysats ont été incubés avec 2,5 pg d'IgG ou P300 pendant une nuit à 4 ° C. Des billes de protéine A ont été ajoutées pendant 4 heures supplémentaires. Perles contenant des complexes immuns ont été lavés avec un tampon de lyse froid 1 ml de glace pendant quatre fois. Les précipités ont été dénaturés dans Laemmli (chargement de gel) tampon à 95 ° C pendant 10 min.

Western Blot

Les cellules ont été récoltées par trypsinisation, lysées dans un tampon Laemmli, dénaturé pendant 10 min à 80 ° C, et résolu sur des gels SDS /PAGE. Après immunoblot, les membranes sont bloquées dans du PBS /0,1% Tween-20 à 7,5% de lait écrémé sec et des anticorps primaires dans du PBS ont été incubées /0,1% de Tween-20 à 0,1% à 5% de lait sec non gras. Des anticorps dirigés contre Twist 1, FoxM1 ont été achetés auprès Santa Cruz Biotechnology (USA). et des anticorps GAPDH-p300 Anti ont été obtenus à partir de Abcam Company (USA). Anti-p21, p27, cycline B1, cycline D1, cycline D2, cycline E et E-cadhérine anticorps étaient de Cellsignaling (USA).

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dosage

Immunoprécipitation de la chromatine ( ChIP) kits de dosage ont été utilisés (Upstate, États-Unis). En bref, les cellules ont été fixées avec 1% de formaldéhyde et traitées en utilisant ChIP Kits de dosage de Upstate. chromatine soluble a été immunoprécipités avec un anti-torsion 1 et des anticorps IgG. Après purification, les échantillons d'ADN ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel en utilisant des amorces englobant la région proximale du promoteur FoxM1 humain.
Analyse

statistique

Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. différences statistiques sont déterminées par un test t à deux queues. La signification statistique est indiquée par * (P < 0,05), ** (P < 0,01) ou *** (P < 0,001).

Effet de résultats de TWIST1 sur gastrique prolifération des cellules cancéreuses

Lors de la première, pour explorer le rôle fonctionnel de Twist 1 dans la prolifération cellulaire, nous transduites NCI-N87 ou AGS cellules avec adénovirus contenant Twist 1 ou vecteur vide (Figure 1A et 1B). Conformément aux études précédentes, l'expression de la E-cadhérine, un biomarqueur du processus EMT [4,5], a été régulée à la baisse par Twist 1 surexpression (Figure S1A-1B). En outre, une torsion surexpression conduit à une augmentation significative du nombre de cellules de toutes les cellules testées (Figure 1C et 1D). Cohérente, la bromodésoxyuridine (BrdU) L'analyse a également confirmé que Twist 1 surexpression favorisé la prolifération cellulaire (figure 1E et 1F). Par ailleurs, Twist 1 des cellules surexprimant ont un pourcentage significativement plus faible de cellules dans la phase G1 /G0 et un pourcentage accru de cellules dans la phase S, par rapport aux cellules vides vecteur transfectées (figure 1G-1 H).

Suivant , NCI-N87 ou les cellules AGS ont été transfectées avec des petits ARN interférents (siRNA) ciblant Twist 1. oligo siRNA a montré Twist efficace 1 knockdown dans ces deux cellules, par rapport aux cellules GFP siRNA-transduction (Figure 2A-2D). Par conséquent, la régulation négative de torsion 1 a conduit à une diminution marquée du nombre de cellules et la prolifération de ces cellules (Figure 2E-2H). En outre, le silençage de torsion 1 a augmenté de manière significative le pourcentage de cellules dans la phase G0 /G1 et une diminution du pourcentage de cellules dans la phase S (figure 2I-2J). Notamment, nous avons comparé l'activité de prolifération des NCI-N87 et les cellules AGS avec ou sans transfection de vecteur vide ou GFP siRNA. Nos résultats suggèrent que ni le vecteur vide ou GFP siRNA affectent l'activité de prolifération cellulaire (Figure S2A). En outre, la capacité des cellules exprimant Twist plus 1 niveaux (cellules NCI-N87 et AGS) la croissance est relativement plus élevé que les autres (HGC-27 et MGC80-3 cellules) (Figure S2C). Pris ensemble, nos résultats suggèrent que Twist 1 pourrait être une régulation positive importante de l'estomac prolifération des cellules cancéreuses.

TWIST1 affecte l'expression des régulateurs du cycle cellulaire

Comme Twist 1 promu la prolifération cellulaire, nous avons examiné ses fonctions sur l'expression des gènes qui régulent la transition G1 /S, y compris les inhibiteurs de CDK p21 ^{Cip1, p27 Kip1, le régulateur de CDK cycline B1, cycline D1, cycline D2 et cycline E. Résultats du réel PCR en temps et de l'analyse western blot dans les cellules NCI-N87 ont suggéré que l'expression de p21 Cip1, p27 Kip1 ont été downregulated tandis cycline B1, cycline D1, cycline D2 et cycline E niveaux ont été surexprimés dans les cellules Twist 1 transfectées, par rapport aux cellules transfectées par des vecteurs vides (figure 3A-3B). Des résultats similaires ont également été observés dans les cellules AGS (figure 3C-3D), ce qui confirme en outre que Twist 1 peut influencer la prolifération des cellules cancéreuses gastriques. Constamment, knockdown de Twist 1 a augmenté p21 Cip1 et p27 expression Kip1 alors réduite cycline B1, cycline D1, cycline D2 et cycline E expression dans les cellules NCI-N87 et AGS (figure 4A-4D).}

Twist 1 vise directement le facteur de transcription FoxM1 dans les cellules de cancer gastrique

des études antérieures ont révélé que plusieurs facteurs de transcription peuvent réguler une série de gènes pertinents pour le cycle cellulaire, y compris p21 ^{Cip1, p27 Kip1 et cycline B1. Par conséquent, nous avons analysé les facteurs de transcription potentiels qui participent à la régulation de la prolifération cellulaire. Sur cinq facteurs de transcription testés, seuls FoxM1 se sont révélés être augmenté de manière significative dans les cellules NCI-N87 surexprimant Twist 1 (figure 5A-5B). L'induction de FoxM1 a également été observée dans les cellules AGS (Figure 5C-5D). En outre, l'expression FoxM1 a été réduite dans ces cellules appauvri Twist 1 (figure 6A-6D), ce qui suggère que FoxM1 pourrait être une cible de Twist 1.}

Twist 1 upregulates expression FoxM1 par le recrutement de p300

ensuite, nous nous sommes concentrés sur le mécanisme moléculaire de Twist 1 régulation de FoxM1 transcription. L'analyse de séquence a montré que la région du promoteur du gène humain FoxM1 contenait un site de liaison de torsion 1 potentiel (entre -357 et -352 pb) (figure 7A). rapport luciférase test a montré que l'activité transcriptionnelle de type sauvage FoxM1 promoteur a été considérablement augmentée par Twist 1, alors que l'activité transcriptionnelle a été abolie dans le promoteur portant une mutation dans les sites Twist 1 de liaison (Figure 7B). En outre, les essais ChIP ont montré que Twist 1 pourrait se lier uniquement à FoxM1 promoteur (Figure 7C). Pour déterminer si l'induction de FoxM1 par Twist 1 est nécessaire pour son effet prolifératif, nous avons réalisé des expériences avec FoxM1 knockdown utilisant oligos ARNsi dans les cellules NCI-N87 (Figure S3A-S3B). En conséquence, l'ARNi a sauvé les cellules de l'effet prolifératif de torsion 1 surexpression (figure S3C). Constamment, les fonctions de Twist 1 sur les niveaux de régulateurs du cycle cellulaire expression ont également été inversés par oligos FoxM1 siRNA (Figure S3D), ce qui suggère que FoxM1 est nécessaire pour les rôles de Twist 1 dans les cellules de cancer gastrique.

En tant que facteur de transcription, Twist 1 peut recruter coactivateurs dans la régulation de l'expression du gène cible. Des études antérieures ont démontré que P300 pourrait agir comme un co-activateur pour de nombreux facteurs de transcription. Nous avons examiné si p300 ainsi pourrait être un coactivateur pour Twist 1 régulation de l'expression FoxM1. Comme on le voit sur la figure 7D, une torsion peut interagir avec p300 par co-immunoprécipitation. L'activité transcriptionnelle du promoteur FoxM1 a encore été augmentée par la co-transfection de P300 et de la torsion 1 (figure 7E). De plus, nous avons encore aboli l'expression de p300 en utilisant les oligos siRNA dans les cellules NCI N87 (Figure 7F). Comme prévu, Twist 1 induite par FoxM1 expression était significativement atténuée par le silence de p300 (Figure 7G-7H). Les données ci-dessus ont démontré que Twist 1 upregulated FoxM1 expression à travers un recrutement de complexes de coactivateurs transcriptionnels, y compris p300.

Discussion

Dans l'étude actuelle, nos résultats impliquent Twist 1 comme un régulateur critique de l'estomac la progression du cancer. Ceci est suggéré par plusieurs sources de données. Tout d'abord, une torsion favorise la surexpression tandis que sa déficience inhibe la prolifération cellulaire comme le montre la BrdU et de l'analyse du cycle cellulaire. Deuxièmement, Twist 1 affecte l'expression des gènes de modulateurs du cycle cellulaire, y compris les CDK inhibiteurs p21Cip1, p27Kip1, le régulateur de CDK cycline B1, cycline D1, cycline D2 et cycline E. Troisième, Twist 1 upregulates directement l'expression de FoxM1 au niveau de la transcription, par l'intermédiaire recrutement de P300. En outre, knockdown de l'expression endogène FoxM1 atténue l'effet prolifératif de Twist 1, suggérant que FoxM1 est essentiel pour les rôles de Twist 1 dans les cellules de cancer gastrique.

Chez les adultes, Twist 1 est principalement exprimé dans les cellules précurseurs, y compris les ostéoblastes, myogène, lignées odontoblastiques et myélomonocytaire, le maintien de leur état indifférencié [17]. Par ailleurs, TWIST1 est également un régulateur important de nombreux autres processus biologiques, y compris le développement mésenchymateuses et le métabolisme de la graisse brune. Par exemple, TWIST1 est censé inhiber la différenciation des ostéoblastes en régulant négativement Runx2 [17]. Par ailleurs, Twist-1 est exprimée de manière sélective dans le tissu adipeux, interagit avec PGC-1α, pour supprimer le métabolisme mitochondrial et de désaccouplement. Par conséquent, des souris transgéniques surexprimant Twist-1 dans le tissu adipeux sont sujettes à l'obésité, riche en matières grasses, l'alimentation induite, alors que les souris knock-out hétérozygotes sont résistants à l'obésité [18]. De plus, Twist 1 expression nucléaire a également été observée dans l'épithélium non-noncancerous, ce qui suggère que Twist 1 peut avoir un rôle physiologique dans les cellules normales [19]. Des études ultérieures démontrent que Twist 1 expression est corrélée avec l'invasivité puissant ainsi que de mauvais pronostic dans le cancer épithélial. Dans le cancer gastrique, un récent rapport a montré une surexpression du gène Twist 1 est plus fréquemment trouvée dans les tissus de carcinome de type diffus avec l'expression des gènes de haute N-cadhérine [20]. Twist Cependant, aucun résultat définitif ont indiqué favorise la prolifération du cancer gastrique. Nos résultats ont été proposées Torsion probablement favorisé gastrique prolifération des cellules cancéreuses, en utilisant les tests d'incorporation de BrdU. En outre, FoxM1 a d'abord été identifié comme une nouvelle cible de transcription Twist 1.

FoxM1 lie les régions du promoteur avec une préférence pour un [TAAACA] séquence de reconnaissance de consensus, mais avec une affinité plus faible que d'autres protéines forkhead [21]. Son expression est restreinte aux cellules proliférantes, et exclu de cellules au repos et différenciées. Il contrôle la manifestation des gènes nécessaires à la fois G1 /S et G2 /M transition et est essentielle pour l'entrée et la progression mitotique, en assurant le maintien de la stabilité des chromosomes [22,23]. Amplifications de gène FoxM1 a été rapportée dans de nombreuses tumeurs telles que les cancers du pancréas, le cancer du sein et le carcinome hépatocellulaire [24-27]. Dans le cancer gastrique, FoxM1 expression est régulée à la hausse et son inhibition conduit à la sénescence cellulaire, qui est au moins en partie dépendante de p27 Kip1 [28,29]. En plus de son rôle positif sur la prolifération cellulaire, FoxM1 a été montré pour jouer un rôle dans d'autres processus liés au cancer, comme l'invasion et les métastases [30]. Les niveaux d'expression sont en corrélation avec un mauvais pronostic et des métastases dans différentes tumeurs, y compris le carcinome gastrique [31], ce qui suggère la possibilité d'utiliser FoxM1 comme un pronostic et /ou d'un marqueur de diagnostic. Pris ensemble, FoxM1 est une cible prometteuse et attractive pour le traitement du cancer. Par conséquent, il est essentiel de comprendre comment FoxM1 est réglementée afin de concevoir de meilleures approches thérapeutiques.

expression FoxM1 est étroitement régulée tant au niveau d'ARNm et de protéines. Son abondance augmente à l'entrée de la phase S, pics pendant G2 et M, et est dégradée lors de la sortie de mitose. De même, son activité de transcription est étroitement régulée au cours du cycle cellulaire par phosphorylation multisite par les différentes kinases, phosphatases et ses contrecarrant, atteignant son activité maximale dans la phase G2 du cycle cellulaire [32]. Récemment, il a été rapporté que l'expression FoxM1 peut également être modulée par microARN. FoxM1 a été identifié comme une cible directe de miR-134, dont les niveaux sont inversement corrélés avec le potentiel invasif de certaines cellules NSCLC [33]. En outre, FoxM1 est également réprimée par miR-370 dans des cellules de cancer gastrique [29], ce qui suggère que d'autres études sont nécessaires pour déterminer si Twist 1 pourrait coopérer ces voies de régulation.

En conclusion, nous montrons ici que Twist 1 surexpression conduit à une régulation à la hausse significative de FoxM1 qui joue un rôle clé dans la progression du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses gastriques. En revanche, knockdown de Twist 1 réduit l'expression de FoxM1, suggérant que FoxM1 pourrait être une cible transcriptionnelle directe de Twist 1. Nous révélons en outre que Twist 1 pourrait se lier à la région promotrice du FoxM1, puis recruter p300 à induire FoxM1 transcription de l'ARNm. Par conséquent, nos résultats découvrir un Twist inconnu précédent 1 /voie réglementaire FoxM1, ce qui peut aider à comprendre les mécanismes de la prolifération du cancer gastrique.

Informations complémentaires
Figure S1.
(AB) niveaux de E-cadhérine dans NCI-N87 (A) et AGS ARNm et de protéines (B) cellules transfectées avec des adénovirus exprimant le vecteur vide (EV) ou Twist 1.
doi: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001
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Figure S2.
(A-B) La cellule potentiel prolifératif (BrdU) a été déterminée dans NCI-N87 (A) ou AGS (B) cellules avec ou sans transfection de vecteur vide (EV) ou GFP siRNA. (C) Endogène Twist 1 expression a été déterminée par western blot en quatre cellules de cancer gastrique (NCI-N87, AGS, HGC-27 et MGC80-3). La courbe de quatre lignées cellulaires de croissance a été mesurée
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s002
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Figure S3.

(A-B) ARNm (A) et de protéines (B) les niveaux de FoxM1 dans les cellules NCI-N87 transfectées avec oligos siARN contre NCI-N87 ou le contrôle négatif (Ctrl). (C) l'activité de prolifération cellulaire a été mesurée par des tests de BrdU dans les cellules NCI-N87. Les cellules ont été pré-transfectées avec oligos siARN pendant 24 heures et ensuite transfectées avec le vecteur vide (EV) ou Twist 1 pendant 24 heures.
Niveaux (D) d'ARNm de p21, p27, cycline B1, cycline D1, cycline D2 et cycline E ont été déterminés par PCR en temps réel dans les cellules NCI-N87. Les cellules ont été pré-transfectées avec oligos siARN pendant 24 heures, puis transfectées avec le vecteur vide (EV) ou Twist 1 pendant 24 heures
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077625.s003
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