PLoS ONE: Twist1 Способствует рака желудка пролиферации клеток посредством повышающей регуляции FoxM1

Абстрактный
<р> Twist-белок, связанный с 1 (Twist1), также известный как класс Базовая спираль-петля-спираль белок 38 (bHLHa38) , участвует в определении клеточных клонов и дифференцировки. Предыдущие исследования показали, что экспрессия Twist1 является повышающей регуляции в рак желудка с плохими клиническими результатами. Кроме того, Twist1 предлагается участвовать в прогрессии рака желудка человека. Тем не менее, его биологические функции остаются в значительной степени неизученными. В настоящем исследовании мы показали, что Twist 1 избыточная экспрессия приводит к значительному повышающего регулирования FoxM1, который играет ключевую роль в прогрессии клеточного цикла в клетках рака желудка. В противоположность этому, нокдаун Twist 1 уменьшает экспрессию FoxM1, предполагая, что FoxM1 может быть прямым транскрипционный мишенью Twist 1. На молекулярном уровне, мы также показывают, что Twist 1 может связываться с промоторной областью FoxM1, а затем набирать p300, чтобы побудить FoxM1 транскрипции мРНК. Таким образом, наши результаты выявления предыдущего Неизвестного Twist 1 /FoxM1 регулирующую путь, который может помочь понять механизмы желудка пролиферации рака
<р> Цитирование:. Цянь J, Ло Y, Гу X, W Чжань, Ван X ( 2013) Twist1 Способствует рака желудка пролиферации клеток посредством повышающей регуляции FoxM1. PLoS ONE 8 (10): e77625. DOI: 10.1371 /journal.pone.0077625
<р> Редактор: Девананд Саркар, Университет Содружества Вирджиния, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 31 мая 2013 года; Принято 3 сентября 2013 года; Опубликовано: 24 октября 2013
<р> Copyright: © 2013 Цянь и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:.. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Эпителиальные-мезенхимальных-перехода (EMT) является процесс, при котором эпителиальные клетки теряют полярность и клетки к клеточной адгезии, и подвергаются драматическое ремоделирования цитоскелета [1,2]. Одновременно с потерей эпителиальных клеточной адгезии и цитоскелета компонентов клетки подвергаются ЕМТ приобретают экспрессию компонентов мезенхимальных и миграционным фенотипом [2,3].

Несколько ключевых индукторами EMT являются факторами транскрипции, включая Twist 1, Улитка и Slug, что подавляют экспрессию Е-кадгерина [4,5]. Twist1 принадлежит основной спираль-петля-спираль фактора транскрипции семейства [6]. Первоначально Twist1 было предложено иметь важное значение в развитии mesodermally производных тканей, включая мышцы и остеогенных клеточных клонов [7,8]. Последующие исследования показали, что Twist 1 способствует EMT и играет существенную роль в метастазировании в нескольких моделях опухолей [9,10]. Экспрессия Twist 1 также участвует в продвижении метастазирования и инвазивных патологических подтипов в нескольких типах рака [11]. Поэтому, Twist 1 было предложено обладать онкогенными свойствами. Например, избыточная экспрессия Twist в рабдомиосаркома ингибирует Мус-индуцированный апоптоз и препятствует супрессии опухолей р53 [12]. Повышающая регуляция Twist связано со злокачественной трансформацией в Т-клеточной лимфомы [13]. Принудительная экспрессия Twist вызывает сопротивление раковых клеток человека к лекарственным препаратам, которые ингибируют образование микротрубочек [14].
<р> Тем не менее, эффект и механизм гена Twist на пролиферацию рака желудка остаются загадочными. Недавние исследования показали, что Twist1 ли повышающей регуляции в рака желудка ассоциированных с фибробластами с плохими клиническими результатами [15]. К тому же, понижающая регуляция гена твист 1 подавляло пролиферацию клеток рака желудка путем негативной регуляции активности АР-1, что приводит к экспрессии циклина D1 убывающую [16]. В настоящей работе, две линии рака желудка клеток были использованы для изучения влияния и механизм Twist 1 гена на пролиферацию клеток.

Материалы и методы

Культура клеток
<р> Четыре эпителиальные клеточные линии (NCI-N87, AGS, ТЖК-27 и MGC80-3), полученные из рака желудка, были получены из американской коллекции типовых культур (США). Клетки культивировали в среде DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Пекин). Культуры поддерживали при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO <югу> 2.

Малые интерферирующих РНК, экстракции РНК и анализа в реальном времени
<р> Клетки высевали на 6- луночные планшеты затем трансфицировали 50nm миРНК олиго таргетингом человека Twist 1 (Dharmacon, США). Молекула конкретных миРНК для зеленого флуоресцентного белка (GFP), был использован в качестве отрицательного контроля. Тотальную РНК экстрагировали из клеток с помощью реагента TRIzol, так и в обратном транскрипции были выполнены Такара РНК ПЦР-комплект (Takara, China) в соответствии с протоколом производителя. Для того, чтобы количественно оценить стенограммы генов интереса, ПЦР в реальном времени проводили с использованием SYBR Green премикса Ex Taq (Takara, Japan) на Light Cycler 480 (Roche, Швейцария).

Трансфекция и пролетного люциферазы
Assays <р> промотор Человеческий FOXM1 амплифицировали из шаблона геномной ДНК человека и вставляли в pGL4.15 основной вектор (Promega). Мутант Twist1 связывающий мотив был сгенерирован с использованием мутагенеза набора ПЦР (Тоёбо) с праймером (мутационные сайты подчеркнуты): 5'-CGCATTACGAATCAGGTTAAGCCAGTT-3 'и обратный праймер комплемента. Все переходные трансфекцию были выполнены Липофектамином 2000 (Invitrogen, Шанхай), в соответствии с инструкциями изготовителя. Для люциферазы анализов, клетки высевали в 24-луночные планшеты и трансфицировали указанными плазмидами. Через 48 часов после трансфекции, люцифераза мероприятия были измерены с использованием системы двойного люциферазы анализа (Promega, США).

Со-иммунопреципитации
<р> Клетки собирали, ресуспендировали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ трис HCl (рН 7,3-7,5), 120 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% ингибиторы Тритон Х-100) и протеазы. Лизаты инкубировали с 2,5 мкг р300 или IgG в течение ночи при температуре 4 ° С. шарики с протеином А были добавлены в течение дополнительных 4 часов. Гранулы, содержащие иммунные комплексы промывают 1 мл ледяного буфера для лизиса холодной четыре раза. Преципитаты денатурированный в Laemmli (гель загрузки) буферной при 95 ° С в течение 10 мин.

вестерн-блот
<р> Клетки собирали трипсином, лизировали в буфере Лэммли, денатурировали в течение 10 мин при 80 ° С C и разделяли на SDS /PAGE гелей. После того, как иммуноблоттинга мембраны блокировали в PBS /0,1% твин-20 с 7,5% обезжиренного сухого молока, а также первичные антитела инкубировали в PBS /0,1% твин-20 с 0,1% -5% обезжиренного сухого молока. Антитела, направленные против Twist 1, FoxM1 были приобретены у Santa Cruz Biotechnology (США). Анти-P300 и GAPDH антитела получали из Abcam Company (США). Анти-p21, p27, циклин В1, циклин D1, циклин D2, циклин Е и Е-кадгерина антитела были из Cellsignaling (США).

иммунопреципитации хроматина (ЧИП) анализ
<р> иммунопреципитации хроматина ( CHIP) комплекты анализа были использованы (Upstate, США). Если коротко, то клетки фиксировали 1% формальдегида и дальнейшей обработке с использованием аналитических наборов ChIP Upstate в. Растворимый хроматин иммунопреципитации с использованием анти-твист 1 и IgG-антител. После очистки образцы ДНК были определены количественно с помощью количественного ПЦР реального времени с использованием праймеров, охватывающих проксимальной области промотора FoxM1 человека.

Статистический анализ
<р> Все данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистические различия определяли с помощью двустороннего теста т. Статистическая значимость показана как * (Р &ЛТ; 0,05), ** (P &ЛТ; 0,01) или *** (Р &л; 0,001).

Результаты

Влияние Twist1 на желудочную пролиферации раковых клеток
<р> На первом, чтобы исследовать функциональную роль Twist 1 в клеточной пролиферации, мы трансдуцированная NCI-N87 или AGS клетки с аденовирусов, содержащих Twist 1 или пустой вектор (рис 1А и 1В). В соответствии с предыдущими исследованиями, экспрессия Е-кадгерина, биомаркером EMT процесса [4,5], был вниз регулируется Twist 1 оверэкспрессии (рис S1A-1B). К тому же, твист 1 избыточная экспрессия приводит к значительному увеличению количества клеток всех клеток, протестированных (рис 1C и 1D). Последовательно, бромдезоксиуридин (BrdU) анализ также подтвердил, что Twist 1 избыточная экспрессия способствует пролиферации клеток (рис 1E и 1F). Кроме того, Twist 1 сверхэкспрессией клетки имели значительно меньший процент клеток в фазе G0 /G1 и увеличение доли клеток в фазе S, по сравнению с пустыми вектор трансфицируют клетки (рис 1G-1H).
<Р> Далее , NCI-N87 или AGS клетки трансфицировали малых интерферирующих РНК (киРНК) нацеливание Twist 1. миРНК олиго показал эффективный Twist 1 нокдаун в этих двух клетках, по сравнению с GFP миРНК-трансдуцированных клеток (Фигура 2А-2D). В результате, понижающая регуляция закручивания 1 привело к заметному уменьшению числа клеток и пролиферации в этих клетках (рис 2E-2H). Кроме того, глушение Twist 1 значительно увеличился процент клеток в фазе G1 /G0 и уменьшил процент клеток в фазе S (рис 2I-2J). Следует отметить, что мы сравнили пролиферативную активность NCI-N87 и клетки AGS с или без трансфекции пустого вектора или GFP миРНК. Наши результаты свидетельствуют о том, что ни один пустой вектор или GFP миРНК влияют на активность пролиферации клеток (рис S2A). К тому же, способность роста клеток, экспрессирующих высокий Twist 1 уровней (NCI-N87 и AGS клетки) относительно выше, чем у других (ТЖК-27 и MGC80-3 клеток) (рис S2C). Взятые вместе, наши результаты свидетельствуют о том, что Twist 1 может быть важным позитивным регуляции пролиферации раковых клеток желудка.

Twist1 влияет на экспрессию регуляторов клеточного цикла
<р> Как Twist 1 способствует пролиферации клеток, мы исследовали его функции на экспрессию генов, которые регулируют /S переход G1, включая ингибиторы р21 CDK Cip1, p27 Kip1, регулятор CDK циклин В1, циклин D1, циклин D2 и циклин Е. Результаты из вещественно время ПЦР и вестерн-блоттинга в клетках NCI-N87 предположил, что экспрессия р21 Cip1, p27 Kip1 были подавляются в то время как циклин В1, уровни циклин D1, циклин D2 и циклин E были повышающей регуляции в Twist 1-трансфицированных клеток, по сравнению с пустыми векторно-трансфицированных клеток (Фигура 3А-3В). Аналогичные результаты наблюдались также в AGS клетки (рис 3C-3D), далее подтверждая, что Twist 1 может влиять на пролиферацию клеток рака желудка. Последовательно, нокдаун Twist 1 увеличилась р21 cip1 и p27 выражение Kip1 в то время как уменьшается циклин В1, циклин D1, циклин D2 и экспрессию циклина Е в NCI-N87 и AGS клетки (рис 4A-4D).

закрутки 1 непосредственно нацелен на фактор транскрипции FoxM1 в клеток рака желудка
<р> показали Предыдущие исследования, что несколько факторов транскрипции можно регулировать ряд генов, имеющих отношение к клеточного цикла, в том числе р21 ^{Cip1, p27 Kip1 и циклин В1. Таким образом, мы проанализировали потенциальные факторы транскрипции, которые участвуют в регуляции клеточной пролиферации. Из пяти протестированных транскрипционных факторов, были найдены только FoxM1 быть значительно увеличена в клетках NCI-N87 с гиперэкспрессией Twist 1 (рис 5А-5В). Индукция FoxM1 также наблюдалась в AGS клетках (рис 5C-5D). Кроме того, экспрессия FoxM1 была уменьшена в этих клеточных обедненной Twist 1 (6А-6D), предполагая, что FoxM1 может быть объектом Twist 1.}

Twist 1 выражение FoxM1 активирует посредством набора р300
<р> Далее, мы сосредоточились на молекулярном механизме Twist 1 регулирования FoxM1 транскрипции. Анализ последовательности показал, что область промотора гена FoxM1 человека содержит потенциальную Twist 1 сайт связывания (между -357 и -352 б.п.) (рис 7А). Люциферазы отчет показал, что транскрипционный активность FoxM1 промотора дикого типа резко активируемых Twist 1, в то время как активность транскрипционных была отменена в промотор, несущий мутацию в Twist 1-сайтов связывания (рис 7б). Кроме того, чиповых анализы показали, что Twist 1 может однозначно связываться с FoxM1 промотора (рис 7С). Для того, чтобы определить, является ли индукция FoxM1 по Twist 1 необходим для его пролиферативной эффекта, мы провели эксперименты с FoxM1 нокдаун с использованием миРНК олигонуклеотидов в клетках NCI-N87 (рис S3A-S3B). В результате киРНК спасена клеток из пролиферативного эффекта закручивания 1 сверхэкспрессии (рис S3C). Последовательно, функции Twist 1 на уровне экспрессии регуляторов клеточного цикла также были отменены FoxM1 миРНК олиго (рис S3D), предполагая, что FoxM1 требуется для роли Twist 1 в клетках рака желудка.
<р> как транскрипционный фактор, Twist 1 может набирать коактиваторов в регуляции экспрессии гена-мишени. Предыдущие исследования показали, что P300 может выступать в качестве коактиватора для многих факторов транскрипции. Таким образом, мы исследовали, может ли p300 быть коактиватор для Twist 1 регуляции экспрессии FoxM1. Как показано на рисунке 7D, Twist 1 может взаимодействовать с p300 по коиммунопреципитации. Транскрипционной активности промотора FoxM1 дополнительно активируется путем совместной трансфекции p300 и Twist 1 (рис 7E). Кроме того, мы также отменили выражение р300 с помощью миРНК олигонуклеотидов в клетках NCI-N87 (рис 7F). Как и следовало ожидать, Twist 1-индуцированная экспрессия FoxM1 была значительно притупляется молчания p300 (рис 7G-7Н). Приведенные выше данные показали, что Twist 1 выражение FoxM1 усиливает свою активность через набора транскрипционных коактиватора комплексов, в том числе p300.

Обсуждение
<р> В текущем исследовании, наши результаты означают Twist 1 в качестве важнейшего регулятора желудка прогрессирование рака. Об этом свидетельствуют несколько линий доказательств. Во-первых, Twist 1 избыточная экспрессия способствует в то время как его дефицит ингибирует клеточную пролиферацию, как показано на BrdU и анализа клеточного цикла. Во-вторых, Twist 1 влияет на экспрессию генов модуляторов клеточного цикла, в том числе ингибиторы p21Cip1 CDK, p27Kip1, регулятор CDK циклин В1, циклин D1, циклин D2 и циклин Е. В-третьих, Twist 1 непосредственно активирует экспрессию FoxM1 на уровне транскрипции, через набор P300. Кроме того, нокдаун экспрессии эндогенного FoxM1 затухает пролиферативный эффект Twist 1, предполагая, что FoxM1 имеет важное значение для роли Twist 1 в клетках рака желудка.
<р> У взрослых, Twist 1 в основном экспрессируется в клетках-предшественниках, включая остеобластов, Миогенный, odontoblastic и миеломоноцитарным родословных, сохранении их недифференцированного состояния [17]. Кроме того, Twist1 также является важным регулятором многих других биологических процессов, включая развитие мезенхимальной и коричневый жировой обмен. Например, Twist1, как полагают, ингибируют дифференцировки остеобластов путем негативной регуляции Runx2 [17]. Кроме того, Twist-1 селективно экспрессируется в жировой ткани, взаимодействует с PGC-1alpha, для подавления митохондриального метаболизма и разобщение. В результате, у трансгенных мышей с гиперэкспрессией твист-1 в жировой ткани склонны к высоким содержанием жира диеты индуцированной ожирением, в то время как его гетерозиготные мыши нокаута являются ожирение устойчивостью [18]. Кроме того, Twist 1 ядерная экспрессия также наблюдалась в не доброкачественное эпителия, предполагая, что Twist 1 может иметь физиологическую роль в нормальных клетках [19]. Последующие исследования показали, что экспрессия Twist 1 коррелирует с мощным инвазии, а также плохим прогнозом при эпителиального рака. При раке желудка, недавний отчет показал, избыточная экспрессия гена Twist 1 чаще всего встречается в тканях карциномы диффузного типа с высокой экспрессии гена N-кадгерин [20]. Тем не менее, не законченные результаты не показали закрутки способствует распространению рака желудка. Наши результаты свидетельствуют о Twist, вероятно, способствовало пролиферации раковых клеток желудка, используя учредительные анализы BrdU. Кроме того, FoxM1 был впервые идентифицирован как новый целевой транскрипционный Твист 1.
<р> FoxM1 связывает промоторные области с предпочтением консенсуса [TAAACA] последовательности распознавания, хотя и с более низкой аффинностью по сравнению с другими Forkhead белками [21]. Его экспрессия ограничивается пролиферирующих клеток, и исключены из покоящихся и терминально дифференцированных клеток. Он контролирует экспрессию генов, необходимых как для G1 /S и G2 /M перехода и имеет важное значение для митотического входа и прогрессии, обеспечивая поддержание стабильности хромосом [22,23]. Амплификацию гена FoxM1 сообщалось в многочисленных опухолей, таких как поджелудочной карцином, рака молочной железы и гепатоцеллюлярной карциномы [24-27]. При раке желудка, экспрессия FoxM1 также повышающей регуляции и его ингибирование приводит к возникновению клеточного старения, которая является по меньшей мере частично, зависит от p27 Kip1 [28,29]. В дополнение к своей положительной роли на пролиферацию клеток, FoxM1 было показано, играют роль в других процессах, связанных с раком, таких как инвазии и метастазированию [30]. Его уровни экспрессии коррелирует с плохим прогнозом и метастазирования в различных опухолей, включая рак желудка [31], что указывает на возможность использования FoxM1 в качестве прогноза и /или диагностики маркера. Взятые вместе, FoxM1 является перспективной и привлекательной мишенью для терапии рака. Поэтому крайне важно, чтобы понять, как FoxM1 регулируется с целью разработки лучших терапевтических подходов. Выражение
<р> FoxM1 жестко регулируется как на уровне мРНК и белка. Ее обилие увеличивается на входе S-фазы, достигает пика в G2 и М, и разлагается во время выхода из митоза. Точно так же, его транскрипционной активности жестко регулируется в течение всего клеточного цикла путем мультисайтовой фосфорилирования различными киназ, и его противодействующих фосфатазы, достигая максимального активности в G2-фазе клеточного цикла [32]. В последнее время сообщалось, что экспрессия FoxM1 также можно модулировать микроРНК. FoxM1 был идентифицирован как прямая мишень микроРНК-134, чьи уровни обратно коррелирует с инвазивный потенциал некоторых клеток с немелкоклеточным раком легких [33]. Кроме того, FoxM1 также подавляется микроРНК-370 в клетках рака желудка [29], предполагая, что необходимы дальнейшие исследования, чтобы исследовать вопрос о том Twist 1 может взаимодействовать эти регуляторные пути.
<р> В заключение мы хотели бы здесь показать, что твист 1 избыточная экспрессия приводит к значительному повышающего регулирования FoxM1, который играет ключевую роль в прогрессии клеточного цикла в клетках рака желудка. В противоположность этому, нокдаун Twist 1 уменьшает экспрессию FoxM1, предполагая, что FoxM1 может быть прямым транскрипционный мишенью Twist 1. Мы также показывают, что Twist 1 может связываться с промоторной областью FoxM1, а затем набирать p300, чтобы побудить FoxM1 транскрипцию мРНК. Таким образом, наши результаты выявления предыдущего Неизвестного Twist 1 /FoxM1 регулирующую путь, который может помочь понять механизмы желудочного распространения рака.

Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
(AB) мРНК и уровни белка Е-кадгерина в NCI-N87 (А) и AGS (B) клетки, трансфицированные аденовирусов, выражающие пустой вектор (EV) или Twist 1.
DOI: 10.1371 /journal.pone .0077625.s001
(TIF)
Рисунок S2.
(А-В) Клетка пролиферативный потенциал (BrdU) определяли в NCI-N87 (А) или AGS (В) клеток без или с трансфекцией пустым вектором (EV) или GFP миРНК. (С) экспрессии эндогенного Twist 1 определяли с помощью Вестерн-блоттинга в четырех клеток рака желудка (NCI-N87, AGS, ГГК-27 и MGC80-3). Измеряли кривая роста четырех клеточных линий
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s002
(TIF) Рисунок S3
.
<р> (А-В) мРНК (А) и белка (B) уровни FoxM1 в клетках NCI-N87, трансфицированных миРНК олиго против NCI-N87 или отрицательного контроля (Ctrl). (С) пролиферативной активности клеток измеряли с помощью BrdU анализов в клетках NCI-N87. Клетки предварительно трансфицированы киРНК олиго в течение 24 часов, а затем трансфицировали пустым вектором (EV) или раскручивают 1 в течение еще 24 ч. Уровни
(D) мРНК р21, р27, циклин В1, циклин D1, циклин D2 и циклин Е определяли с помощью ПЦР в реальном времени в клетках NCI-N87. Клетки предварительно трансфицированы киРНК олиго в течение 24 часов, а затем трансфицировали пустым вектором (EV) или раскручивают 1 в течение еще 24 часов
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0077625.s003
(TIF)

• PLoS ONE: с-Met в качестве прогностического маркера рака желудка в: систематический обзор и мета-анализ
• PLoS ONE: Плохо Прогноз фосфатазы регенерирующей печени 3 Выражение в рака желудка: Мета-анализ