PLoS ONE: Tetrandrin Induziert Mitochondrien-vermittelte Apoptose in menschlichen Magenkrebs BGC-823 Zellen

Abstrakt

Tetrandrin, ein Bis-Benzylisochinolin Alkaloid isoliert aus der getrockneten Wurzel der Hang-Fang-Chi ( Stephania
tetrandra
S. Moore), wurde berichtet Anti-Krebs-Wirkung auf vielen Tumoren zu besitzen. In dieser Studie haben wir Tetrandrin-induzierte Apoptose auf die menschliche Magenkrebs BGC-823-Zellen In-vitro-
und in vivo
sucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Tetrandrin signifikant inhibiert die Lebensfähigkeit der Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise und induziert Apoptose. Es erhöht die Apoptose; Hochregulation von Bax, Bak und Bad; und Herabregulation von Bcl-2 und Bcl-XL in BGC-823-Zellen. Darüber hinaus erhöht Tetrandrin die Aktivierung von Caspase-3 und -9, Freisetzung von Cytochrom c
und Hochregulation von apaf-1, was darauf hindeutet, dass Tetrandrin-induzierte Apoptose auf die mitochondriale Weg verbunden war. Inzwischen Vorbehandlung mit dem Pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk in BGC-823-Zellen reduziert Tetrandrin-induzierte Apoptose durch Aktivierung von Caspasen blockieren. Darüber hinaus Tetrandrin effektiv Tumorwachstum durch Induktion der Apoptose gehemmt, die durch immunhistochemischen Analyse in einem Nacktmaus Xenograftmodell verifiziert. Insgesamt schlossen wir, dass Tetrandrin signifikant die Proliferation von Magenkrebs BGC-823-Zellen durch die Mitochondrien-abhängige Apoptose gehemmt, die eine vielversprechende Rolle bei Magenkrebs-Therapie spielen kann

Citation:. Qin R, Shen H, Cao Y, Fang Y, Li H, Chen Q, et al. (2013) Tetrandrin Induziert Mitochondrien-vermittelte Apoptose in menschlichen Magenkrebs BGC-823 Zellen. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10.1371 /journal.pone.0076486

Editor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 16. Dezember 2012; Akzeptiert: 27. August 2013; Veröffentlicht: 1. Oktober 2013

Copyright: © 2013 Qin et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch die folgenden Zuschüsse wurde unterstützt: die Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81070423 und 81101677), die Zuschüsse aus dem Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK 2.010.332). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

In China, Magenkrebs, eine der häufigsten bösartigen Tumoren, die sich aus einer Ansammlung von genetischen und epigenetischen Ereignisse, hat immer noch eine hohe Inzidenz und Sterblichkeit [1-3]. Es gibt mehrere Faktoren das Auftreten von Magenkrebs verursachen, wie Helicobacter Pylori
Infektion, Ernährung, Tabakkonsum, und so weiter [4]. Je nach den Umständen, die meisten Patienten mit Magenkrebs benötigen Chirurgie, Chemotherapie und /oder Radiochemotherapie [5]. Frühere Studien haben gezeigt, dass Magenkrebs ist eine komplexe genetische Erkrankung im Zusammenhang mit Onkogenen oder Tumorsuppressoren [6].

Tetrandrin (C _{38H 42N 2 O 6, MW 622,730 ) ist ein bis-Benzylisochinolin Alkaloid isoliert aus der getrockneten Wurzel der Hang-Fang-Chi ( Stephania
tetrandra
S. Moore). In letzter Zeit wurden die vielfältigen biologischen Aktivitäten von Tetrandrin studierte intensiv wegen seiner breiten Verwendung bei Arthritis, Herzrhythmusstörungen, Entzündungen, Silikose, verschiedene Arten von Tumoren und Reverse multi-drug resistance [7,8]. Es wird berichtet, dass Tetrandrin erhebliche Auswirkungen auf Tumoren, einschließlich Verlangsamung des Tumorwachstums und steigenden Tierüberlebenszeit und die Überlebensrate [9-12] hat. Tetrandrin verursacht eine G1 Zellzyklusblockade und induziert Apoptose in verschiedenen Zelltypen. Jedoch apoptosis die genauen Mechanismen, durch die Tetrandrin initiiert und hemmt das Zellwachstum in Magentumorzellen bleiben unklar [13]. Es wird berichtet, dass die codelivery von Paclitaxel (Ptx) und Tetrandrin durch Nanopartikel effektiv die Zytotoxizität von Ptx durch sequentielle Hemmung der ROS-abhängige Akt Signalweg und die Aktivierung von apoptotischen Wege auf Basis von Oxidations Therapie gegen Magenkrebs verbessern kann [14]. Jedoch als therapeutisches Mittel hat Ptx zwangsläufig schwere Nebenwirkungen aufgrund ihrer unspezifischen toxischen Wirkungen und spezielle Lösungsmittel, und die Tumorzellen können beständiger gegen Ptx-induzierte Apoptose werden [15-17]. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass Tetrandrin eine synergistische Wirkung mit chemotherapeutischen Mitteln auf die Apoptose von Magenkrebszelllinien hat [18]. Ferner übt ein Derivat (H1) von Tetrandrin gute Anti-Multidrug-Resistenz-Aktivität durch die intrinsische Apoptoseweg Initiierung und Hemmen der Aktivierung von ERK1 /2 und Akt1 /2 [19]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Tetrandrin könnte Ptx als die erste Zeile Chemotherapie bei Magenkrebs zu ersetzen.}

Da Tetrandrin hat ein großes Potenzial in der Anti-Krebs-Therapie ist es wichtig, sie zu studieren, systematisch seinen Mechanismus zu verstehen. Daher wird in dieser Studie untersuchten wir die möglichen Mechanismen der Tetrandrin auf menschlichen Magenkrebszellen In-vitro-
und in vivo
.

Materialien und Methoden

Materialien und Reagenzien

Tetrandrin von Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, China) erhalten. Antikörper wurden aus den folgenden Quellen erhalten: Antikörper gegen Bcl-2, Bax, Bcl-xl, Caspase-3, -8, -9, Cytochrom c
, Apaf-1 und β-Actin wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); Anti-Bad und Bak waren von Bioworld Technologie (St. Louis Park, MN, USA). Das Trizolreagenz Kit wurde von Invitrogen (Grand Island, NY, USA) erworben. MTT (3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid) wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erworben.

Zellkultur

der menschliche Magenkrebszelllinie BGC-823 wurde von Shanghai Cell Biology, chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone, Logan, UT, USA), 1% Penicillin und 1% Streptomycin in einer kultivierten befeuchteten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO _{2 bei 37 ° C.}

Zelllebensfähigkeitstest

die Lebensfähigkeit der Zellen durch den MTT-Test gemessen wurde. Kurz gesagt, wurden die Zellen in 96-well-Platten ausgesät in einer Dichte von 1 × 10 ^{4 Zellen /Vertiefung. Nach 36 h wurden die Zellen mit oder ohne Tetrandrin bei variablen Konzentrationen für 24, 48, behandelt und 72 h; und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) diente als negative Kontrolle. Dann wurden 20 ul MTT-Farbstofflösung (0,5 mg /ml, in PBS gelöst und filtriert durch ein 0,2-mm-Membran) wurde in jede Vertiefung gegeben und für 4 h bei 37 ° C inkubiert. Danach wurden 150 ul Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden bei 37 ° C für weitere 10 min inkubiert. Die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung einer 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Die IC _{50 -Wert wurde als die Konzentration des Arzneimittels definiert, die verglichen mit der Kontrolle 50% des Zellwachstums hemmt.}}

Western Blotting

Magenkrebszellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann 100 ul RIPA-Lysepuffer (Beyotime, China) wurde etwa 20 min zu lysieren Zellen zu jeder Vertiefung zugegeben. Als nächstes wurde die Mischung bei 12.000 zentrifugiert g
für 15 min, und der Überstand wurde gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China) detektiert gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gesamtprotein wurde durch SDS-PAGE auf 8% abgetrennt, 10% und 12% Polyacrylamid-Gelen und elektrophoretisch auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen (Millipore, Bedford, MA, USA) überführt. Nach Blockieren für 2 h oder über Nacht mit 5% fettfreier Trockenmilch (gelöst in Tris-gepufferter Kochsalzlösung-Tween 20-Puffer; TBST) wurden die Membranen mit primärem Antikörper inkubiert (1: 500-1: 1000 Verdünnung) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C gewaschen und dann dreimal mit TBST (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 136 mM NaCl, 0,1% Tween 20) vor der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörpern (1 Umsetzen: 5000 -1: 10000) für 1 h bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen für 10 min jeweils mit TBST wurden die Membranen mit ECL Western Blotting Reagent Detektion behandelt.

Quantitative polymerase chain reaction in Echtzeit

Zelluläre Gesamt-RNA wurde isoliert unter Verwendung von Trizol-Reagenz ( Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers und in DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Die Konzentration der Gesamt-RNA wurde durch UV-Absorptionsspektroskopie gemessen. Reverse Transkription wurde durchgeführt, eine RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, USA) unter Verwendung von folgenden Protokoll des Herstellers. Der neu synthetisierte cDNA wurde durch Polymerasekettenreaktion (Fermentas) amplifiziert. Die Sequenzen von jedem Primer in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 Die Polymerase-Kettenreaktionsbedingungen aufgeführt sind wie folgt dargestellt: 95 ° C für 3 min, 95 ° C für 5 min, 58 ° C für 30 min, und 72 ° C für 30 min von 40 Zyklen bei 94 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min. Alle Tests wurden in dreifacher Ausführung.
Gene
Sense-Primer (5 'bis 3')
Antisense-Primer (5 'durchgeführt, um 3’)
bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. Sequenzen der Primer für die Gene in dieser Studie verwendet.
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Annexin V-Propidiumiodid-Bindungsassay

Kurz-Zellen in 6-Well-Platten ausgesät und mit verschiedenen behandelten Konzentrationen von Tetrandrin für 24 h, und PBS als negative Kontrolle diente. Dann wurden die Zellen in 500 ul kaltem Bindungspuffer resuspendiert. Die Zellsuspensionen gegen Annexin-V und Propidiumiodid gefärbt wurden (BD Pharmingen ^{TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers, und dann Zytometrie Analyse fließen wurde durch eine FACS (Coulter, Becton Dickinson) durchgeführt.}

Caspase-3-Aktivitätstest

kurz gesagt, Zellen in einer 6-Well-Platte wurden 4 in einer Konzentration von x 10 inkubiert ^{5 /Vertiefung und mit der angegebenen Konzentration von Drogen. ein gleiches Volumen von PBS verwendet wurde, als eine negative Kontrolle. Caspase-3-Aktivität behandelt wurde, unter Verwendung einer gemessenen Caspase-3-Aktivitätsassay-Kit (Beyotime, China) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Absorption wurde dann bei 405 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Alle Versuche wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.}

Ethik-Anweisung

Verfahren Tiere und ihre Pflege beteiligt sind, wurden in Übereinstimmung durchgeführt mit NIH-Richtlinien (NIH Pub. No.85-23, überarbeitet 1996) und von der Animal Care und Use Committee der angeschlossenen Volkskrankenhaus, Jiangsu Universität genehmigt.

Tierversuche

Weibliche Nacktmäuse (Balb /c nu /nu), 4-6 Wochen alt, wurden aus dem Experimental Animal Center der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in einem biologischen Schrank bei der Versuchstierhaltung der Jiangsu-Universität gehalten. Die Tiere wurden in einem 12-h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Raumtemperatur bei etwa 20 ° C gehalten und Feuchtigkeit wurde auf etwa 50% in einem Raum mit einem gefilterten Luftzufuhr gehalten.

Tetrandrin Behandlung von subkutanen BGC-823-Tumoren in Mäusen

Um festzustellen, eine BALB /c Maus-Xenograft-Modell des menschlichen Magenkrebs, BGC-823-Zellen in einer Konzentration von 5,0 x 106/150 &mgr; l wurden in die rechte Flanke jedes BALB /c Nacktmaus injiziert. Etwa 10 Tage später (Tumorgröße erreicht 120-150 mm3), nackte Mäuse zufällig in drei Gruppen eingeteilt wurden (N = 5) und angesichts der folgenden Behandlungen: Kontrolle (Behandlung mit physiologischer Kochsalzlösung), niedrige Dosisgruppe (behandelt mit 40 mg /Tetrandrin kg) und Gruppe mit hoher Dosis (120 mg /kg Tetrandrin behandelt). BALB /c-Mäuse wurden intraperitoneal mit Tetrandrin (200 ul, 40 mg /kg oder 120 mg /kg) injiziert, oder ein gleiches Volumen physiologischer Kochsalzlösung, einmal täglich für 3 Wochen, respectively. TV = Länge (mm) × Breite ^{2 (mm 2) × 0,5: Die Tumorgröße alle 3 Tage in zwei senkrechten Dimensionen mit einer Schieblehre, und das Tumorvolumen (TV) wurde berechnet durch die Formel gemessen wurde . Relative Tumorvolumen (RTV) wurde nach der folgenden Formel berechnet: RTV = TV _{t /TV 0, wobei TV 0 ist das Tumorvolumen am Tag 0 und TV t der Tumor Volumen an einem bestimmten Tag t. Inzwischen wurden die Tiere zweimal pro Woche gewogen. Am Ende des Experiments wurden die Tumore herausgeschnitten und in Formalin fixiert für die weitere Analyse.}}

Immunhistochemische Analyse

Die in Paraffin eingebetteten Proben aus exzidiert BGC-823 Nacktmäuse wurden die folgenden Antikörpern gefärbt unter Verwendung von : Bcl-2 und Bax (Boster), Bcl-xl, Caspase-3 aktiviert und für die Immunhistochemie Caspase-9 (Santa Cruz) aktiviert. Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss) genommen.

Statistical analysis

Alle Experimente wurden mindestens dreimal, und alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD). Statistische Unterschiede wurden durch Einweg-ANOVA mit bestimmt SPSS 16.0 Software. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

• PLoS ONE: SULF2 Methylierungs mit In-vitro-Cisplatin Empfindlichkeit Assoziierte und klinische Wirksamkeit für Magenkrebs-Patienten behandelt mit einer modifizierten FOLFOX Regimen
• PLoS ONE: Down-Regulation der Claudin-18 ist im Zusammenhang mit der proliferativen und Invasionspotential von Magenkrebs in der invasiven Front