PLOS ONE: Diminué Niveaux d'Active SMAD2 Correlate avec un mauvais pronostic dans gastrique Cancer

Résumé

Contexte

TGF-β joue un double rôle dans la progression du cancer humain. Au cours des premiers stades de fonctions carcinogenèse, le TGF-ß en tant que suppresseur de tumeur. Au cours des derniers stades du développement tumoral, cependant, le TGF-β peut favoriser la croissance tumorale et les métastases. Un changement dans Smad2 /3 phosphorylation de l'extrémité carboxy au lieur des sites est un événement clé déterminant la fonction biologique du TGF-β dans le carcinome colorectal et hépatocellulaire. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle potentiel du différentiel Smad2 /3 phosphorylation adénocarcinome gastrique.

Méthodologie

La coloration immunohistochimique avec des anticorps anti-P-Smad2 /3C et anticorps /3L P-Smad2 a été réalisée sur 130 échantillons d'adénocarcinome gastrique paraffine. La relation entre P-Smad2 /3C et P-Smad2 /3L partition immunohistochimique et les caractéristiques clinico-pathologiques des patients a été analysée. PCR en temps réel a été utilisé pour mesurer l'expression de l'ARNm de Smad2 et Smad3 dans le cancer et les tissus environnants non-tumeur.

Non significatif P-Smad2L de

Principaux résultats et /coloration positive ou P-Smad3L était détectée dans la majorité des échantillons (coloration positive dans les échantillons 18/130). Positif P-Smad2 /3L coloration n'a pas été associée à une diminution de la coloration carboxyterminal de phosphorylation. La perte de la P-Smad2C remarquablement corrélée avec la profondeur d'infiltration de la tumeur et une mauvaise différenciation des cellules cancéreuses chez des patients atteints d'un cancer gastrique. Aucune corrélation n'a été détectable entre P-Smad3C et les caractéristiques clinico-pathologiques de l'adénocarcinome gastrique. Cependant, l'analyse de co-coloration a révélé que la P-Smad3C co-localisé avec des α-SMA et de collagène de type I dans les cellules de cancer de l'estomac, ce qui indique un lien possible entre P et Smad3C épithéliale-mésenchymateuse transition du cancer. PCR en temps réel a montré une réduction de l'expression d'ARNm Smad2 dans le cancer gastrique en comparaison avec les tissus environnants non-tumeur chez 15/16 patients.

Perte de Conclusions de P-Smad2C étroitement corrélée avec l'invasion du cancer et faible différenciation dans le cancer gastrique. Contrairement à ce que colorectal et le carcinome hépatocellulaire, la phosphorylation canonique carboxy-terminale, mais pas lieur phosphorylation de Smad2 est critique pour le cancer gastrique

. Référence: Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) Une diminution des niveaux d'Active SMAD2 Correlate avec un mauvais pronostic dans le cancer gastrique. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10.1371 /journal.pone.0035684

Editeur: Javier S. Castresana, Université de Navarre, en Espagne

reçues: 6 Octobre 2011; Accepté 20 Mars 2012; Publié le 23 Avril, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Wu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. L'étude a été soutenu par le Bureau de la santé de la province du Zhejiang de la Chine, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., E.T.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, «foie virtuel» et «thérapie cellulaire» 01GN0987 (D.S.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (D.S.) et LA997 /5-1 (D.S.); et Dietmar Hopp Stiftung GmbH (D.S.). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est une cause majeure de décès liés au cancer dans le monde, au deuxième rang chez les hommes et chez les femmes quatrième en fréquence [1]. La pathogenèse du cancer gastrique est associé à plusieurs facteurs. Parmi ceux-ci, la dysrégulation des voies liées à des processus de développement, y compris la transformation du facteur β de croissance (TGF-β) de signalisation, Wnt /β-caténine, Hedgehog et la signalisation Notch joue un rôle central dans le développement et la progression de ce cancer [2].

La famille de molécules, y compris des isoformes de TGF-ß, activines et des protéines morphogénétiques osseuses (PGB) TGF-β, a des fonctions importantes dans divers processus physiologiques et physiopathologiques, par exemple le développement embryonnaire, les maladies auto-immunes, la fibrose et le cancer [3], [4]. TGF-β transduction ses signaux en stimulant la formation de complexes hétéromères de type TGF-β I (TGF-βRI) et de type II (TGF-βRII) sérine /thréonine kinase des récepteurs. Activé TGF-βRI propage la signalisation par le recrutement et la phosphorylation du récepteur-régulé-Smad (R-Smad, y compris Smad2 et Smad3). La phosphorylation de résidus sérine C-terminaux dans R-Smad est une étape cruciale pour la signalisation du TGF-β canonique. Les deux plus des résidus de sérine C-terminaux à la sérine 465/467 à 423/425 Smad2 et la sérine sont phosphorylés dans Smad3, conjointement avec un troisième résidu de serine non phosphorylée, forment un motif SSXS évolutivement conservées dans tous les groupes R-Smad [5], [6]. En plus de la phosphorylation de l'extrémité C-terminale Smad2 /3 (P-P-Smad2C et Smad3C) par le TGF-βRI, d'autres kinases, par exemple la kinase c-Jun N-terminal (JNK) et des kinases Ras associée, provoquer la phosphorylation de la R-Smad dans les sites de liaison autour de la sérine 249/254 dans Smad2 et Smad3 dans sérine 208/213 (P-P-Smad2L et Smad3L) [7 ], [8]. Phosphorylés R-Smad forment un complexe avec commun Smad (Co-Smad; Smad4 chez les mammifères) et la navette dans le noyau pour la transcription du gène cible [3]. Outre R-Smad et co-Smad, le troisième type de protéine Smad est un inhibiteur de Smad (I-Smad; Smad6 et Smad7). I-Smad sont transcriptionnelle induite par le TGF-β, ce qui indique un mécanisme de rétroaction négative de cette voie de signalisation [4].

TGF-β joue un double rôle dans la progression du cancer humain [9], [10] . Dans les stades précoces du cancer, des actes de TGF-ß en tant que suppresseur de tumeur en inhibant la prolifération cellulaire ou en favorisant l'apoptose cellulaire. Cependant, à la fin des étapes, le TGF-β soutient la progression tumorale telle que l'invasion des cellules tumorales, la diffusion et l'évasion immunitaire [9]. En outre, le TGF-β est bien reconnu comme un médiateur de épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) dans le cancer [11]. Bien que les perturbations de la signalisation du TGF-β /Smad sont au cœur de la cancérogenèse dans la plupart des organes, sa tumeur promotion résultat est très dépendant du contexte. Par exemple, la signalisation du TGF-β est essentiel dans le maintien de la tige de cancer cellulaire auto-renouvellement et l'activité tumorigène dans gliome et de la leucémie, alors que les effets de la signalisation du TGF-β dans les cellules souches du cancer du sein sont controversées [12]. Une étude a montré que le blocage de la voie du TGF-β par un dominant négatif du TGF-βRII augmente la taille du compartiment des cellules souches du sein et favorise la tumorigenèse, ce qui indique une suppression de la carcinogenèse mammaire de cette cytokine [13]. En revanche, Mani et ses collègues ont constaté que la voie nous critique dans le maintien de souches du cancer du sein des propriétés analogues à des cellules et l'activité tumorigène TGF-β par induction EMT [14].

Dans le cancer gastrique, polymorphismes nucléotidiques simples ( SNP) du TGF-β sont associés à la sensibilité à l'étape I et la phase II du cancer gastrique [15], [16]. Les niveaux de TGF-β sériques ont été rapportées en corrélation significative avec envahissement veineux chez les patients atteints de cancer gastrique [17]. Cependant, les mécanismes détaillés de TGF-β de signalisation dans la progression du cancer de l'estomac sont encore inconnus. En outre, on ne sait pas quand et comment le TGF-β se transforme d'un gène suppresseur de tumeur dans un promoteur de tumeur pendant la cancérogenèse.

Récemment, un changement dans la phosphorylation de Smad2 /3 du C-terminal à des sites de liaison a été démontré que un événement clé qui détermine la fonction biologique du TGF-β dans le cancer [18], [19], [20]. Des études antérieures basées sur 12 années de suivi démontré que le VHB chronique /patients atteints du VHC avec P-Smad2 /3L dans les tissus du foie avaient un risque plus élevé de progresser vers un carcinome hépatocellulaire (CHC) que ceux avec P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Conformément aux conclusions de la HCC, des observations similaires ont été faites dans le cancer colorectal [7], [22].

Pour examiner la contribution de la phosphorylation Smad différentielle vers la cancérogenèse dans le cancer gastrique, nous avons étudié P-Smad2 /3C et niveaux 3L dans 130 patients atteints d'un adénocarcinome gastrique par immunohistochimie P-Smad2 /(IHC). Nous avons analysé les corrélations potentielles entre les différents sites de phosphorylation des R-Smad et invasion, métastase ganglionnaire, la différenciation et le stade du cancer gastrique.

Linker phosphorylation de

Résultats de Smad2 /3 est pas associé avec cancer gastrique

contrairement aux conclusions antérieures de cancer colorectal et le CHC [7], [8], [21], [22], nous ne détectait pas significative P-Smad2L et /ou P-Smad3L positif coloration dans les tissus gastriques chez des patients atteints de cancer gastrique. Seuls 18 patients sur 130 ont montré une coloration positive p-Smad3L principalement dans les cellules non cancéreuses. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de liaison dans les sites de sérine de Smad2 /3 ne soit pas critique dans le cancer gastrique.

Différentes caractéristiques des niveaux dans le cancer gastrique P et P-Smad2C Smad3C

118 sur 130 tissus gastriques ont montré P-Smad2C coloration positive, et les tissus gastriques 91 sur 130 étaient positifs pour P-Smad3C coloration respectivement. Distinct de coloration positive P-Smad2C, qui a été DISPLAYING dans le noyau des cellules normales et cancéreuses (Fig. 1A), une coloration positive P-Smad3C a été démontrée dans le noyau (59/130, fig. 1B), à la membrane et /ou dans le cytoplasme (73/130, fig. 1 C) de cellules de cancer gastrique. En outre, P-Smad3C a été observée par une coloration positive dans les fibroblastes entourant les cellules cancéreuses (81/130 et 91/130, Fig. 1D).

Réduction de P-Smad2C est en corrélation avec la profondeur remarquable de la tumeur (T) et de la différenciation du cancer (G) chez les patients atteints de cancer gastrique

On a mesuré P Smad2C coloration IHC non seulement dans la tumeur, mais aussi dans les tissus environnants non tumorales de 130 patients atteints d'un cancer gastrique. P-Smad2C coloration positive dans les cellules soit cancéreuses ou normales inversement corrélée avec la différenciation du cancer gastrique (à la fois p
< 0,0001, tableau 1). En outre, une diminution de pointage P-Smad2C IHC dans les cellules cancéreuses en corrélation avec la profondeur de la tumeur ( p
< 0,05, tableau 1). P-niveaux dans un tissu normal Smad2C ainsi montré une corrélation inverse avec le potentiel invasion du cancer chez ces patients ( p
= 0,07, tableau 1). Le score P-Smad2C IHC a été significativement réduite dans les tissus cancéreux par rapport aux tissus non-tumoraux chez des patients 77 sur 130 atteints de cancer gastrique. Par ailleurs, dans les tissus tumoraux, les cellules cancéreuses avec une atypie mal ont montré une diminution Smad2C P-coloration, par rapport à ceux bien différenciés (Fig. 2). l'analyse de corrélation de Kendall-tau a révélé une corrélation possible entre la réduction de la P-Smad2C coloration et la transition de la normale à des cellules cancéreuses dans le cancer gastrique ( p
= 0,05, tableau 2), ce qui suggère que l'activation de la signalisation Smad2 est un suppresseur critique de la formation et la progression tumorale.

P-Smad3C se trouve fréquemment dans les fibroblastes de cancer associé

P-Smad3C Le score IHC n'a pas montré une corrélation significative avec T /N /G /S de des échantillons de cancer gastrique (voir le tableau 1). Cependant, une coloration positive P-Smad3C souvent eu lieu dans les fibroblastes entourant les cellules cancéreuses chez les patients atteints de cancer gastrique (Fig. 1).

Les cellules cancéreuses sont d'origine épithéliale et ne reflètent pas les marqueurs mésenchymateuses, par exemple a-SMA et de collagène I. Si les cellules cancéreuses expriment des marqueurs mésenchymateuses, il est évocateur d'épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT) [11]. Dans la présente étude, nous avons trouvé une coloration positive α-SMA dans les cellules cancéreuses chez 54 des 130 patients atteints de cancer gastrique (par exemple les patients 1 à la Fig. 3). Afin de clarifier le lien potentiel entre p-Smad3C et EMT, nous avons étudié la corrélation entre les p-Smad3C coloration (cancer et des tissus non-cancer) et une coloration positive α-SMA dans les cellules cancéreuses. Kendall-tau coefficients de corrélation de rang entre les scores p-Smad3C IHC dans le cancer /entourant les scores de tissus non-cancéreuses et α-SMA IHC dans le cancer sont 0,14 ( p
= 0,08) et -0.09 ( p
= 0,99), respectivement (tableau 3). Pour confirmer EMT chez ces patients, nous avons effectué des co-coloration pour ESCARGOT, un autre marqueur spécifique de l'EMT, et le collagène I /α-SMA dans les tissus gastriques. La microscopie confocale a révélé co-localisation de ESCARGOT et de collagène I (Fig. 4A) /α-SMA (Fig. 4B) dans certaines cellules de cancer gastrique. Ces cellules de cancer gastrique positifs α-SMA ainsi affichés P-Smad3C coloration positive (Fig. 4C). En plus de co-localisation avec des cellules de cancer de l'estomac positifs α-SMA, la microscopie confocale a montré que P-Smad3C co-localisé avec le collagène I dans des cellules de cancer de l'estomac (Fig. 4D). En outre, P-Smad3C coloration positive colocalisé avec des α-SMA et de collagène de type I non seulement dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans les fibroblastes (Fig. 4C-4D). Ces résultats suggèrent que P-Smad3C peut contribuer à EMT du cancer gastrique chez certains patients.

Perte d'expression totale Smad2 et Smad3 chez les patients atteints de cancer gastrique

Outre la mesure de P-Smad2 dans le cancer gastrique nous avons utilisé la PCR en temps réel pour détecter l'expression d'ARNm de Smad2 et Smad3 dans le cancer gastrique et les tissus non tumoraux autour de 16 patients. 15 et 12 patients ont démontré une diminution, respectivement, l'expression d'ARNm de Smad2 et Smad3 dans les tissus cancéreux, par comparaison avec les tissus normaux (Fig. 5). Ces résultats indiquent que non seulement activé Smad2 mais aussi l'expression de l'ARNm du total Smad2 est réduite au cours de la cancérogenèse gastrique.

Discussion

Dans un adénocarcinome colorectal et le CHC, un changement dans la phosphorylation de carboxy-terminale à régions de liaison a été suggéré comme un événement critique associé au commutateur de TGF-β à partir d'un suppresseur de cancer à un facteur oncogène [8], [18], [19], [20], [21], [22]. Dans la présente étude, nous avons examiné cette association potentielle dans le cancer gastrique. Nous ne détectons niveaux P-Smad2L et P-Smad3L significatifs chez 130 patients atteints de cancer gastrique. 112 sur 130 patients n'a pas montré P-Smad2L ou P-Smad3L coloration dans les cellules de cancer gastrique, ce qui suggère que le changement proposé dans la phosphorylation de la R-Smad ne peut pas contribuer à TGF-β carcinogenèse médiée dans ce type de cancer. Contrairement à P-Smad2 /3L, à la fois P-Smad2C et P-Smad3C coloration positive a été détectée dans la plupart des patients atteints de cancer gastrique. Kendall-tau analyse de corrélation de rang a révélé que des notes P-Smad2C IHC inversement corrélée avec la profondeur de la tumeur (T) et la différenciation du cancer (G).

Le rôle de Smad2 pendant la formation et la progression du type de cancer différent reste controversée . En accord avec la conclusion actuelle, les études antérieures sur le carcinome de l'oesophage à cellules squameuses, le cancer du sein et le cancer colorectal ont démontré que la perte d'expression Smad2 est en corrélation avec le développement de tumeurs et de mauvais pronostic [23], [24], [25], [26]. Récemment, huée et ses collègues ont constaté que Smad2, mais pas Smad3, a souvent été perdu chez 83 patients atteints d'un carcinome peau des cellules squameuses. En outre, des souris avec des kératinocytes spécifiques à la suppression Smad2 affichage formation accélérée et la progression maligne de tumeurs de la peau de souris induite chimiquement par rapport aux souris de type sauvage [27]. Cependant, dans une étude de 52 patients atteints d'un gliome, un score positif P-Smad2 IHC a été signalé en corrélation avec la prolifération des gliomes et de mauvais pronostic [28]. Avant la présente étude, Shinto et ses collègues ont mesuré P-Smad2C coloration dans 135 patients atteints de cancer gastrique. Ils ont constaté que les niveaux P-Smad2C étaient plus élevés dans le cancer mal différencié par rapport à ceux bien différenciés [29]. On ne sait pas encore pourquoi il sont complètement opposés résultats dans le cancer gastrique.

Dans la signalisation du TGF-β canonique, activé TGF-βRI induit généralement la phosphorylation carboxy-terminale des deux Smad2 et Smad3. Smad2 et Smad3 activés jouent des rôles différents dans la croissance cellulaire, la différenciation et d'autres fonctions biologiques [30]. Dans le foie, Smad2 est critique dans la médiation de la croissance et la différenciation des hépatocytes, alors que Smad3 joue un effet de clé dans la maturation morphologique et fonctionnelle des cellules hépatiques étoilées [31], [32]. Dans le cancer, il est controversé que la disruption du gène Smad3 contribue à la tumorigenèse. Zhu a rapporté que des souris déficientes Smad3 développent carcinome du côlon [33]. Cependant, d'autres études utilisant des souris déficientes Smad3 ont suggéré que la perte de Smad3 est pas suffisante pour amorcer la tumorigenèse [34], [35], [36], [37]. Dans le cancer gastrique, Han a constaté un faible niveau de Smad3 dans 3 des 8 patients et dans neuf lignées cellulaires de cancer gastrique humain [38]. Introduction d'un vecteur de Smad3 dans des lignées de cellules gastriques restaurée TGF-β réactivité. En outre, l'injection de cellules exprimant Smad3 gastrique chez la souris nude présentaient un retard tumorigenèse par rapport aux témoins, ce qui indique une corrélation de perte de Smad3 avec la carcinogenèse [38]. Dans la présente étude, on n'a pas trouvé une corrélation significative entre P-Smad3C coloration dans les cellules de cancer gastrique et l'invasion du cancer, la différenciation et le stade. Distinct de P-Smad2C, qui est exprimé uniquement dans les noyaux de cellules, une coloration positive Smad3C P est détectable dans le noyau, à la membrane et dans le cytoplasme des cellules cancéreuses gastriques. La pertinence biologique de différents modèles de P-Smad3C coloration dans les cellules cancéreuses est actuellement encore inconnu.

EMT des cellules cancéreuses est une condition préalable à la progression des tumeurs métastatiques avancées [11]. Il a été reconnu que le TGF-β est un acteur majeur de l'EMT. Smad3, mais pas Smad2, est un médiateur clé dans TGF-β EMT dépendante [39]. Par exemple, le TGF-β ne parvient pas à induire EMT dans les cellules épithéliales tubulaires primaires dérivées de reins de souris Smad3 déficientes [40]. L'inhibition de la signalisation du TGF-β par Ki26894, un inhibiteur de TGF-βRI, une diminution de l'invasion et EMT du cancer gastrique squirrheux in vitro
[41]. Nos résultats montrent qu'une partie des cellules cancéreuses gastriques expriment des marqueurs de l'EMT, par exemple Snail, le collagène I et α-SMA. La co-localisation de P-Smad3C avec des α-SMA /collagène I se trouve dans une partie substantielle de patients. En outre, α-SMA coloration positive dans les cellules cancéreuses a une corrélation potentielle avec le score P-Smad3C IHC des cellules cancéreuses, mais pas les tissus environnants non-cancéreuses. Ces résultats indiquent que P-Smad3C pourrait jouer un rôle dans EMT du cancer gastrique.

En résumé, la présente étude suggère que Smad2 est un médiateur important pour défendre les cellules gastriques de progresser vers un cancer peu différencié. Selon nos résultats, Smad3 est pas directement lié aux caractéristiques du cancer de l'estomac, cependant, nos données indiquent qu'il peut jouer un rôle dans les fibroblastes associés au cancer et EMT de cellules de cancer de l'estomac.

Méthodes

patients

spécimens chirurgicaux ont été examinés chez des patients atteints de cancer gastrique primaire au Département de chirurgie générale, le premier hôpital affilié, école de médecine, Université de Zhejiang, en Chine de 2003 à 2009. échantillon de tissu gastrique ont été recueillies lors de chirurgies disséqués le cancer gastrique. Les tissus prélevés comprenaient la tumeur et les zones non-tumorales environnantes (tissus au moins plus de 5 cm loin de la tumeur). Une partie des tissus ont été fixés avec 4% de formaldéhyde et inclus en paraffine pour l'histologie et la mesure IHC. tissus frais restés ont été mis en azote liquide immédiatement pour la mesure de l'ARNm. Un total de 130 tissus gastriques appariés y compris le cancer et les tissus non tumoraux environnants étaient inscrits. le diagnostic et la classification pathologique ont été estimées selon la classification de la tumeur-node-métastases (TNM) préconisée par l'Union internationale contre le cancer (septième édition) [42]. Les caractéristiques de base des patients inscrits sont présentés dans le tableau 4. Le protocole de l'étude était conforme aux directives éthiques de la Déclaration d'Helsinki (1975). L'étude a été approuvée par le comité d'éthique du premier hôpital affilié, École de médecine, Université de Zhejiang. Écrit consentement éclairé ont été obtenus à partir de tous les participants à l'étude.

Anticorps

anticorps polyclonaux de lapin contre P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255), et P-Smad3L (ser 208/213) ont été décrits dans les études précédentes [43], [44]. De souris anti-humaine α-SMA (M0851), polyclonal anti-MOLLUSQUES (ab 17,732), et anti-collagène I monoclonal (C2456) anticorps ont été achetés auprès de Dako, Abcam et Sigma, respectivement.

immunohistochimie (IHC )

Après avoir examiné les H & diapositives E-tachés de 130 patients inscrits atteints de cancer gastrique, des blocs de paraffine représentatifs pour chaque patient ont été sélectionnés pour la section. Les lames ont été déparaffinées dans du xylene et réhydratées dans une série de dilutions d'éthanol à gradient d'eau distillée. La récupération d'antigène a été réalisée par un traitement par micro-ondes dans du tampon EDTA (1 mmol, pH 8,0). Les lames ont ensuite été traitées avec 3% H _{2O 2 pendant 30 min à température ambiante. Après un lavage avec du PBS trois fois, les lames ont été incubées avec un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (1:50), P-Smad3L (1:50 ) et α-SMA (1:200), respectivement à 4 ° C pendant une nuit. Le lendemain, les lames ont été lavées avec du PBS à trois reprises. Après lavage, elles ont été mises en incubation avec EnVision peroxydase (Dako) anti-lapin marqué au ou d'un anticorps anti-souris pendant 1 h à température ambiante. l'activité de la Peroxydase a été détectée avec de la diaminobenzidine (DAB). Les lames ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline. Immunoréactivité a été visualisé sous microscopie optique}

Pour une analyse semi-quantitative, les coupes de tissus colorés ont été évalués à une échelle de 4 points comme suit: le nombre de cellules positives, grades 0-3 (0, pas de cellules positives; 1, <.; 25% de cellules positives, 2, 25% -50% de cellules positives; 3, > 50% de cellules positives); intensité de coloration positive, les notes 1-3 (1, faible coloration positive, généralement de couleur jaune; 2, forte coloration positive, habituellement de couleur brune; 3, très forte coloration positive, généralement brun foncé à noir). Le score final de coloration immunitaire a été calculé comme nombre × intensité.

Immunofluorescence

Les lames ont été déparaffinées dans du xylène et réhydratées dans de l'éthanol gradué jusqu'à l'eau distillée. Puis la récupération d'antigène a été réalisée par un traitement par micro-ondes dans du tampon EDTA (1 mmol, pH 8,0). Les lames ont ensuite été traitées avec 3% H _{2O 2 pendant 30 min à température ambiante. Après un lavage avec du PBS, les deux anticorps primaires de lapin anti-P-Smad3C /escargot et souris anti-α-SMA /collagène de type I, a été appliqué à 4 ° C pendant une nuit. Ensuite, les anticorps secondaires, Alexa633-immunoglobuline de lapin anti-souris G et Alexa488-âne anti-lapin immunoglobuline G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne), ont été appliquées pendant 30 min à température ambiante. Les échantillons ont été montés à l'aide Dako-Cytomation Fluorescent Mounting Medium. Les lames ont été inspectés et des photos ont été prises sur un microscope confocal (Leica, Heidelberg). Les articles sans anticorps primaires ont été utilisés comme témoins négatifs.}

en temps réel
PCR

L'ARN total a été purifié à partir de tissus gastriques avec le pur kit haut d'isolement d'ARN (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Allemagne) selon le protocole du fabricant, et la concentration a été mesurée par spectrophotométrie. L'ADNc a été synthétisé à partir de 1 pg d'ARN avec le Transcriptor Trousse de synthèse brin d'ADNc (Roche Diagnostics). PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec un système Abiprism 7700 de détection de séquence (Applied Biosystems) en utilisant un mélange maître TaqMan universel PCR Non AmpErase UNG (partie. Pas 4.324.018). Les gènes des essais d'expression suivants ont été utilisés: Smad2 (avant: CAAACCAGGTCTCTTGATGG, à l'inverse: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (avant: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG, à l'inverse: GAAGGCGAACTCACACAGC) et peptidylprolyl isomérase A (gène de ménage, une partie ne Mm02342429_g1..). Tous les réactifs ont été achetés chez Applied Biosystems. Les échantillons ont été exécutés en triple exemplaire dans les conditions suivantes: dénaturation initiale pendant 2 minutes à 50 ° C et pendant 10 minutes à 95 ° C, puis 40 cycles de 15 s à 95 ° C et 1 minute à 60 ° C. Les niveaux d'expression des gènes dans chaque échantillon ont été déterminées avec la méthode comparative de seuil de cycle.

Analyse statistique

Pour évaluer l'association entre les marqueurs immunohistologiques sélectionnés et les paramètres de la tumeur, Kendall-tau analyse de corrélation de rang a été réalisée en utilisant la version 9.2 SAS (Cary, NC, USA). A p
. ≪ 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

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