PLOS ONE: diminuição dos níveis de Ativo Smad2 correlacionam-se com mau prognóstico em gástrica Cancer

Abstract

Fundo

TGF-β desempenha um duplo papel na progressão do câncer humano. Durante as fases iniciais de funções carcinogénese, de TGF-p como um supressor de tumor. Durante as últimas fases do desenvolvimento do tumor, no entanto, o TGF-β pode promover o crescimento tumoral e metástases. Uma mudança de Smad2 /3 fosforilação do terminal carboxi para locais ligante é um evento chave na determinação da função biológica de TGF-β em colorrectal e carcinoma hepatocelular. No presente estudo, investigamos o papel potencial do diferencial Smad2 /3 fosforilação no adenocarcinoma gástrico.

Metodologia

coloração imuno-histoquímica com anti-P-Smad2 /3C e anticorpos /3L P-Smad2 foi realizada em 130 amostras de adenocarcinoma gástrico e embebidas em parafina. foi analisada a relação entre P-Smad2 /3C e P-Smad2 /3L pontuação imuno-histoquímica e características clínico-patológicas de pacientes. PCR em tempo real foi utilizado para medir a expressão do mRNA de Smad2 e Smad3 no cancro e tecido circundante não-tumor.

principais conclusões

No significativa P-Smad2L e /ou coloração P-Smad3L positivo foi detectada na maioria dos espécimes (coloração positiva em 18/130 amostras). A coloração positiva P-Smad2 /3L não foi associada com uma diminuição na coloração de fosforilação carboxiterminal. Perda da P-Smad2C notavelmente correlacionada com profundidade de infiltração tumoral e pobres diferenciação de células cancerosas em pacientes com câncer gástrico. Nenhuma correlação foi detectável entre P-Smad3C e características clínico-patológicas de adenocarcinoma gástrico. No entanto, a análise de co-coloração revelou que P-Smad3C co-localizada com α-SMA e colágeno I em células cancerosas gástricas, indicando uma potencial ligação entre a P-Smad3C e epitelial-a-mesenquimal transição de câncer. PCR em tempo real demonstrou expressão de mRNA reduzido de Smad2 no câncer gástrico, quando comparado com o tecido circundante não-tumoral em 15/16 pacientes.

Conclusões

Perda de P-Smad2C firmemente correlacionado com a invasão de câncer e pobre diferenciação no câncer gástrico. Ao contrário do colorectal e carcinoma hepatocelular, a fosforilação carboxi-terminal canônica, mas não ligante de fosforilação, de Smad2 é fundamental para câncer gástrico

Citation:. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) diminuição dos níveis de Ativo Smad2 correlacionam-se com mau prognóstico no câncer gástrico. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10.1371 /journal.pone.0035684

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha |

Recebido: 06 de outubro de 2011; Aceito: 20 de março de 2012; Publicação: 23 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pela província de Serviços de Saúde de Zhejiang da China, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "fígado virtual" e "terapia celular" 01GN0987 (DP); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (DP) e LA997 /5-1 (DP); e o Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S.D.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo, segundo ranking no sexo masculino e em quarto lugar fêmeas na frequência [1]. A patogênese do câncer gástrico está associada a vários fatores. Entre estes, a desregulação de vias de sinalização relacionados com processos de desenvolvimento, incluindo factor de crescimento transformante-β (TGF-β), Wnt /β-catenina, hedgehog e sinalização de Notch, desempenha um papel central no desenvolvimento e progressão desta cancro [2].

A família TGF-β de moléculas, incluindo as isoformas de TGF-p, as activinas e proteínas morfogenéticas do osso (BMPs), tem funções importantes em diversos processos fisiológicos e patológicos, por exemplo, o desenvolvimento embrionário, doenças auto-imunes, fibrose e cancro [3], [4]. TGF-β transduz os seus sinais por estimulação da formação de complexos heteroméricos de tipo TGF-β I (TGF-βRI) e tipo II (TGF-βRII) de serina /treonina-quinase receptores. Activado TGF-βRI propaga a sinalização por recrutamento e fosforilação da regulados pelo receptor-Smads (R-Smads, incluindo Smad2 e Smad3). Fosforilação de resíduos de serina C-terminal em R Smads é um passo crucial para a sinalização de TGF-β canônico. Os dois mais resíduos de serina C-terminal em serina em 465/467 423/425 Smad2 e serina em Smad3 fosforilada são, em conjunto com um terceiro resíduo de serina não-fosforilado, formar um motivo SSXS evolutivamente conservada em todos os R-Smads [5], [6]. Além de fosforilação C-terminais de Smad2 /3 (P-Smad2C e P-Smad3C) por TGF-βRI, outras quinases, e.g. cinase c-Jun N-terminal (JNK) e quinases Ras-associados, causa fosforilação de R Smads em locais vinculador ao redor serina 249/254 em Smad2 e serina 208/213 em Smad3 (P-Smad2L e P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforilados R Smads formar um complexo com comum Smad (Co-Smad; Smad4 em mamíferos) e serviço de transporte para o núcleo para a transcrição do gene alvo [3]. Além R-Smad e co-Smad, o terceiro tipo de proteína é Smad inibidor-Smad (I-Smad; Smad6 e Smad7). I-Smads são transcricionalmente induzido por TGF-β, indicando um mecanismo de feedback negativo desta via de sinalização [4].

TGF-β desempenha um duplo papel na progressão do cancro humano [9], [10] . Nas fases iniciais do cancro, de TGF-p actua como um supressor de tumores por inibição da proliferação celular ou através da promoção de apoptose celular. No entanto, nas últimas fases, TGF-β suporta a progressão do tumor, como a invasão da célula tumoral, disseminação e evasão imune [9]. Além disso, o TGF-β é bem reconhecido como um mediador de epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) no cancro [11]. Embora perturbações de sinalização de TGF-β /Smad são centrais para a carcinogénese, na maioria dos órgãos, a sua promoção tumoral resultado é altamente dependente do contexto. Por exemplo, a sinalização de TGF-β é crucial na manutenção da haste cancro de células auto-renovação e de actividade tumorigénica em glioma e leucemia, enquanto que os efeitos de sinalização de TGF-β em células estaminais do cancro da mama são controversos [12]. Um estudo demonstrou que o bloqueio da via de TGF-β através de um dominante negativo TGF-βRII aumenta o tamanho do compartimento de células estaminais da mama e promove a tumorigénese, indicando uma supressão da carcinogénese da mama desta citocina [13]. Por outro lado, Mani e colegas descobriram que via de TGF-β-nos crítico na manutenção das propriedades semelhantes a células-tronco do câncer de mama e atividade tumorigênico via indução de EMT [14].

câncer gástrico, polimorfismos de um único nucleotídeo ( SNPs) de TGF-β estão associados com a susceptibilidade para a fase I e fase II de câncer gástrico [15], [16]. Os níveis séricos de TGF-β foram relatados para correlacionar significativamente com invasão venosa em doentes com cancro gástrico [17]. No entanto, os mecanismos detalhados de TGF-β sinalização na progressão do cancro gástrico são ainda desconhecidos. Além disso, não está claro quando e como TGF-β transforma de um supressor de tumor em um promotor de tumor durante a carcinogénese.

Recentemente, uma mudança na fosforilação de Smad2 /3 de C-terminal para sítios ligantes como foi demonstrado um evento chave na determinação da função biológica de TGF-β no cancro [18], [19], [20]. Estudos anteriores com base em 12 anos de acompanhamento demonstraram que HBV crónica /pacientes HCV com P-Smad2 /3L em tecidos do fígado tinham um risco maior de avançar para carcinoma hepatocelular (HCC) do que aqueles com P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Consistente com os achados em HCC, observações semelhantes foram feitas em câncer colorretal [7], [22].

Para examinar a contribuição de fosforilação Smad diferencial no sentido de carcinogênese no câncer gástrico, investigamos P-Smad2 /3C e níveis 3L em 130 pacientes com adenocarcinoma gástrico por imuno-histoquímica P-Smad2 /(IHC). Foram analisados ​​potenciais correlações entre diferentes locais de fosforilação de R Smads e invasão, metástase ganglionar, diferenciação e estágio do câncer gástrico.

Resultados

fosforilação Linker de Smad2 /3 não está associado com
câncer gástrico

Em contraste com achados anteriores de câncer colorretal e HCC [7], [8], [21], [22], nós não detectar significativa P-Smad2L e /ou P-Smad3L positiva coloração nos tecidos gástricos de pacientes com câncer gástrico. Apenas 18 dos 130 pacientes apresentaram coloração p-Smad3L positiva, principalmente em células não-cancerosas. Estes resultados sugerem que a fosforilação de ligação em locais de serina de Smad2 /3 não é crítico no câncer gástrico.

características diferentes de níveis em câncer gástrico P-Smad2C e P-Smad3C

118 de 130 tecidos gástricos mostrou P-Smad2C coloração positiva, e 91 de 130 tecidos gástricos foram positivos para a coloração P-Smad3C respectivamente. Distinto de coloração positiva P-Smad2C, que só foi visualizadas no núcleo de células normais e de cancro (Fig. 1A), coloração positiva P-Smad3C foi demonstrada no núcleo (59/130, Fig. 1B), e na membrana /ou no citoplasma (73/130, Fig. 1C) de células de cancro gástrico. Além disso, a P-Smad3C foi observada por coloração positiva em f ibroblastos que rodeiam as células cancerosas (81/130 e 91/130, a Fig. 1D).

Redução P-Smad2C notavelmente correlaciona-se com a profundidade do tumor (T) e de diferenciação de câncer (G) em pacientes com câncer gástrico

Nós medimos coloração P-Smad2C IHC não só no tumor, mas também em torno tecidos não tumorais de 130 pacientes com câncer gástrico. coloração positiva P-Smad2C quer em células cancerosas ou normais inversamente correlacionadas com a diferenciação do cancro gástrico (tanto in <> p
< 0,0001, Tabela 1). Além disso, a diminuição da pontuação P-Smad2C IHC em células cancerosas correlacionados com a profundidade do tumor ( P
< 0,05, Quadro 1). os níveis de P-Smad2C em tecido normal também mostrou uma correlação inversa com potencial de invasão do cancro nestes doentes ( P
= 0,07, Tabela 1). A pontuação P-Smad2C IHC foi significativamente diminuída em tecidos de câncer em comparação com os tecidos não-tumorais em 77 de 130 pacientes com câncer gástrico. Além disso, dentro dos tecidos do tumor, as células cancerosas com atipia mal mostrou diminuição da coloração P-Smad2C, quando comparados com os bem diferenciados (Fig. 2). análise de correlação de Kendall-tau revelou uma correlação potencial entre a redução da coloração P-Smad2C ea transição do normal para as células cancerosas no câncer gástrico ( p
= 0,05, Tabela 2), sugerindo que a ativação da sinalização Smad2 é um supressor crítico da formação e progressão tumoral.

P-Smad3C é freqüentemente encontrado em câncer associado fibroblastos

P-Smad3C pontuação IHC não mostram uma correlação significativa com a T /N /G /S de amostras de cancro gástrico (Tabela 1). No entanto, a coloração P-Smad3C positiva muitas vezes ocorreu em fibroblastos que cercam as células cancerosas em pacientes com câncer gástrico (Fig. 1).

As células cancerosas são de origem epitelial e não expressam marcadores mesenquimais, por exemplo, a-SMA e colagénio I. Se as células cancerígenas expressam marcadores mesenquimais, é sugestivo de epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) [11]. No presente estudo, encontramos coloração α-SMA positivos em células de câncer em 54 de 130 pacientes com câncer gástrico (por exemplo, paciente-1 na Fig. 3). Para esclarecer a relação potencial entre p-Smad3C e EMT, investigamos a correlação entre a coloração p-Smad3C (câncer e tecido circundante não-câncer) e coloração positiva α-SMA em células cancerosas. Kendall-tau coeficientes de classificação de correlação entre os escores p-Smad3C IHC em Câncer /circundantes pontuações de tecido não-câncer e α-SMA IHC no câncer são 0,14 ( p
= 0,08) e -0,09 ( p
= 0,99), respectivamente (Tabela 3). Para confirmar EMT nestes pacientes, foi realizada co-coloração para CARACOL, outro marcador específico para EMT, e colágeno I /α-SMA nos tecidos gástricos. A microscopia confocal revelou co-localização de caracol e colágeno I (Fig. 4A) /α-SMA (Fig. 4B) em algumas células cancerosas gástricas. Estas células gástricas cancerosas positivas α-SMA como bem apresentado P-Smad3C coloração positiva (Fig. 4C). Além de co-localização com células cancerosas gástricas positivos α-SMA, microscopia confocal revelou que P-Smad3C co-localizada com colágeno I em células de câncer gástrico (Fig. 4D). Além disso, a P-Smad3C coloração positiva de co-localizada com α-SMA e colagénio I, não só em células de cancro, mas também nos fibroblastos (Fig. 4C-4D). Estes resultados sugerem que P-Smad3C pode contribuir para a EMT de câncer gástrico em alguns pacientes.

Perda de expressão total de Smad2 e Smad3 em pacientes com câncer gástrico

Além de medir P-Smad2 no câncer gástrico , utilizou-se PCR em tempo real para detectar a expressão de ARNm de Smad2 e Smad3 no cancro gástrico e tecidos circundantes não tumorais a partir de 16 pacientes. 15 e 12 pacientes, respectivamente, demonstraram a diminuição da expressão de ARNm de Smad2 e Smad3 em tecidos de cancro, quando comparado com os tecidos circundantes normais (Fig. 5). Estes resultados indicam que não só activado Smad2 mas também a expressão de ARNm de um total de Smad2 é reduzida durante a carcinogénese gástrica.

Discussão

adenocarcinoma colorrectal e carcinoma hepatocelular, uma mudança na fosforilação do carboxi-terminal de regiões ligantes tem sido sugerido como um acontecimento crítico associado com o interruptor de TGF-β de um supressor de cancro a um factor de oncogénica [8], [18], [19], [20], [21], [22]. No presente estudo, nós examinamos esta associação potencial no câncer gástrico. Nós não detectaram significativos níveis P-Smad2L e P-Smad3L em 130 pacientes com câncer gástrico. 112 de 130 pacientes não apresentaram coloração de P-Smad2L ou P-Smad3L em células de cancro gástrico, o que sugere que a mudança proposto na fosforilação de R-Smad podem não contribuir para o TGF-β carcinogénese mediada neste tipo de cancro. Em contraste com a P-Smad2 /3L, ambos P-Smad2C e P-Smad3C foi detectada coloração positiva na maioria dos doentes com cancro gástrico. Kendall-tau análise de correlação revelaram que a pontuação P-Smad2C IHC inversamente correlacionada com a profundidade do tumor (T) e diferenciação de câncer (G).

O papel da Smad2 durante a formação e progressão do tipo de câncer diferentes permanece controversa . Consistente com a constatação de corrente, os estudos anteriores sobre a carcinoma do esófago de células escamosas, cancro da mama e cancro colorectal demonstrado que a perda de expressão de Smad2 está correlacionada com o desenvolvimento do tumor e o prognóstico pobre [23], [24], [25], [26]. Recentemente, buzina e colegas descobriram que Smad2, mas não Smad3, foi frequentemente perdidos em 83 pacientes com carcinoma de células escamosas da pele. Além disso, os ratinhos com específica de queratinócitos-Smad2 eliminação exibida a formação acelerada e progressão maligna dos tumores da pele do rato induzidos quimicamente em comparação com ratinhos de tipo selvagem [27]. No entanto, num estudo de 52 pacientes com glioma, uma pontuação positiva P-Smad2 IHC foi relatado correlacionar-se com a proliferação de gliomas e prognóstico pobre [28]. Antes do presente estudo, Xintoísmo e colegas mediram coloração P-Smad2C em 135 pacientes com câncer gástrico. Eles descobriram que os níveis de P-Smad2C foram mais elevados no cancro fracamente diferenciado, quando comparados com os bem diferenciadas [29]. Não está claro ainda por que razão não são completamente opostas resultados no cancro gástrico.

Na sinalização TGF-β canônica, ativado TGF-βRI geralmente induz a fosforilação carboxi-terminal de ambos Smad2 e Smad3. Activado Smad2 e Smad3 desempenhar diferentes papéis no crescimento celular, diferenciação e outras funções biológicas [30]. No fígado, Smad2 é crítico na mediação de crescimento de hepatócitos e a diferenciação, enquanto que Smad3 desempenha um efeito fundamental na maturação morfológica e funcional de células estreladas hepáticas [31], [32]. No câncer, é controverso se a interrupção do gene Smad3 contribui para tumorigênese. Zhu relatado que murganhos deficientes em Smad3 desenvolver carcinoma do cólon [33]. No entanto, outros estudos utilizando ratinhos deficientes em Smad3 sugerem que a perda de Smad3 por si só não é suficiente para iniciar a tumorigénese [34], [35], [36], [37]. No cancro gástrico, Han encontrados baixos níveis de Smad3 em 3 de 8 doentes e em nove linhas celulares de cancro gástrico humano [38]. A introdução de um vector de Smad3 em linhas de células gástricas restaurado TGF-β responsividade. Além disso, a injeção de Smad3-expressando células gástricas em ratos nus apresentavam defasagem tumorigênese quando comparados com os controles, indicando uma correlação de perda de Smad3 com a carcinogênese [38]. No presente estudo, não encontramos uma correlação significativa entre a coloração P-Smad3C em células cancerosas gástricas e invasão de câncer, diferenciação e palco. Distinta a partir de P-Smad2C, que é expresso apenas em núcleos de células, a coloração de P-Smad3C positivo é detectável no núcleo, na membrana e no citoplasma de células de cancro gástrico. A importância biológica dos diferentes padrões de coloração P-Smad3C em células cancerosas é, actualmente, ainda desconhecido.

EMT de células cancerosas é um pré-requisito para progredir para tumores metastáticos avançados [11]. Foi reconhecido que o TGF-β é um jogador importante na EMT. Smad3, mas não Smad2, é um mediador chave em TGF-β EMT dependente [39]. Por exemplo, TGF-β falha para induzir EMT em células epiteliais tubulares primárias derivadas de rins de ratos com deficiência de Smad3 [40]. A inibição da sinalização de TGF-β por Ki26894, um inibidor da TGF-βRI, diminuição da invasão e EMT de câncer gástrico scirrhous in vitro
[41]. Nossos resultados mostram que parte das células cancerosas gástricas expressam marcadores de EMT, por exemplo, Caracol, colágeno I e α-SMA. A co-localização de P-Smad3C com α-SMA /colagénio I encontra-se um subconjunto substancial de pacientes. Além disso, a coloração positiva α-SMA em células de câncer tem uma correlação potencial com pontuação P-Smad3C IHC de células cancerosas, mas não tecidos circundantes não-cancerosas. Estes resultados indicam que P-Smad3C pode desempenhar um papel na EMT de câncer gástrico.

Em resumo, o presente estudo sugere que Smad2 é um importante mediador para defender células gástricas de progredir no sentido de câncer pouco diferenciado. De acordo com nossos resultados, Smad3 não está directamente relacionada com as características do câncer gástrico, no entanto, os nossos dados indicam que ele pode desempenhar um papel no câncer associado fibroblastos e EMT de células cancerosas gástricas.

Métodos

os pacientes

espécimes cirúrgicos foram examinados a partir de pacientes com câncer gástrico primário no Departamento de Cirurgia Geral, o primeiro Hospital Filiado da Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang, na China, de 2003 a 2009. amostra de tecido gástrico foi recolhido quando cirurgias dissecados o câncer gástrico. Os tecidos coletados incluíram tumor e ao redor das áreas não tumorais (tecidos, pelo menos, mais de 5 cm longe do tumor). Uma parte de tecidos foram fixadas com formaldeído a 4% e embebidos em parafina para histologia e medição IHC. tecidos frescos permaneceram foram colocados em azoto líquido imediatamente para medição de mRNA. Um total de 130 tecidos gástricos emparelhados, incluindo câncer e tecidos circundantes não tumorais foram inscritos. diagnóstico e classificações patológicas foram estimados de acordo com a classificação tumor-nódulo-metástase (TNM) defendida pela União Internacional contra o Câncer (sétima edição) [42]. características básicas dos pacientes inscritos são apresentados na Tabela 4. O protocolo do estudo conformado com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinki (1975). O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Primeira Affiliated Hospital da Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os participantes envolvidos no estudo.

Os anticorpos

anticorpos policlonal de coelho contra P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255) e P-Smad3L (ser 208/213) foram descritos em estudos anteriores [43], [44]. De ratinho anti-humano α-SMA (M0851), policlonal anti-snail (AB-17732), e anti-colagénio I anticorpos monoclonais (C2456) foram adquiridos a partir de DAKO, Abcam e da Sigma, respectivamente.

A imuno-histoquímica (IHQ )

Depois de analisar os H & lâminas e-manchadas de 130 pacientes inscritos com câncer gástrico, foram selecionados os blocos de parafina representativos para cada paciente por seção. As lâminas foram deparaffinised em xileno e re-hidratadas numa série de diluições de etanol graduado de água destilada. A recuperação de antígenos foi realizada por tratamento com microondas em tampão de EDTA (1 mmol, pH 8,0). As lâminas foram então tratadas com 3% H _{2O 2 durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho contra a P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), a P-Smad3L (1:50 ), e SMA α-(1:200), respectivamente, a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS. Após lavagem, foram incubadas com peroxidase EnVision (Dako) marcado com anti-coelho ou anti-ratinho durante 1 h à temperatura ambiente. A atividade da peroxidase foi detectada com diaminobenzidina (DAB). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina. A imunorreactividade foi visualizada sob microscopia de luz}

Para a análise semi-quantitativa, as secções de tecido coradas foram avaliadas numa escala de 4 pontos, como segue: contagens de células positivas, os tipos 0-3 (0, ausência de células positivas; 1, <.; células 25% positivos, 2, 25% de células positivas -50%; 3, > 50% de células positivas); intensidade da coloração positiva, os graus 1-3 (1, fraca coloração positiva, geralmente amarelo, 2, forte coloração positiva, geralmente marrom; 3, muito forte coloração positiva, geralmente profunda marrom para preto). A pontuação final coloração imune foi calculado como o número × intensidade.

Imunofluorescência coloração

As lâminas foram deparaffinised em xilol e reidratados em etanol graduada até que a água destilada. Em seguida, a recuperação de antigénio foi realizada por tratamento com microondas em tampão de EDTA (1 mmol, pH 8,0). As lâminas foram então tratadas com 3% H _{2O 2 durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, ambos os anticorpos primários, anticorpo de coelho anti-P-Smad3C /caracol e de ratinho anti-α-SMA /colagénio I, foram aplicados a 4 ° C durante a noite. Em seguida, os anticorpos secundários, Alexa633-coelho anti-imunoglobulina de murganho Alexa488 e L-burro anti-imunoglobulina G de coelho (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), foram aplicadas durante 30 minutos a temperatura ambiente. As amostras foram montadas usando Dako-Cytomation Fluorescente Meio de montagem. As lâminas foram inspecionados e fotos foram tiradas em um microscópio confocal (Leica, Heidelberg). As secções sem anticorpos primários foram utilizados como controlos negativos.}

PCR em tempo real

O ARN total foi purificado a partir de tecidos gástricos com o kit de isolamento de ARN High Pure (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante, e a concentração foi medida por espectrofotometria. O ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN com o kit de síntese de transcriptor primeiro filamento de cDNA (Roche Diagnostics). Quantitativa PCR em tempo real foi realizada com um sistema de detecção de seqüência de modelo ABIPRISM 7700 (Applied Biosystems) usando um mestre mix TaqMan universal PCR Sem AmpErase UNG (parte no. 4324018). Foram utilizados os seguintes ensaios de expressão gênica: Smad2 (forward: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; reversa: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (forward: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; reversa: GAAGGCGAACTCACACAGC) e peptidilprolil isomerase A (gene housekeeping; parte não Mm02342429_g1..). Todos os reagentes foram adquiridos a Applied Biosystems. As amostras foram corridas em triplicado sob as seguintes condições: desnaturação inicial de 2 minutos a 50 ° C e durante 10 minutos a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 ° C e 1 minuto a 60 ° C. Os níveis de expressão do gene em cada amostra foram determinados com o método de limiar de ciclo comparativo.

Análise Estatística

Para avaliar a associação entre os marcadores imuno-selecionados e parâmetros de tumor, Kendall-tau análise de correlação foi realizada usando SAS versão 9.2 (Cary, NC, EUA). A p
. ≪ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

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