PLoS One: Csökkent szintű aktív Smad2 korrelál rossz prognózissal gyomorrákban

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

TGF-β játszik kettős szerepet progresszióját emberi rák. A korai szakaszaiban carcinogenesis, a TGF-β funkcionál tumorszuppresszor. A késő szakaszában daganat fejlődést, azonban, a TGF-β elősegíti a tumor növekedését és a metasztázist. Egy eltolódása Smad2 /3 foszforiláció a karboxi-terminális linker oldalak egy kulcsfontosságú esemény meghatározó biológiai funkciója a TGF-β colorectalis és hepatocelluláris karcinóma. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy lehetséges szerepét eltérés Smad2 /3 foszforiláció gyomor adenokarcinóma. Katalógusa

Módszertan katalógusa

Az immunhisztokémiai anti-P-Smad2 /3C és P-Smad2 /3L antitestek végeztük 130 paraffinba ágyazott gyomor adenokarcinóma példányok. A kapcsolat a P-Smad2 /3C és P-Smad2 /3L immunhisztokémiai pontszám klinikopatológiai betegeinek elemeztük. Valós idejű PCR módszerrel határoztuk meg mRNS expressziója Smad2 és Smad3 a rák és a környező nem tumoros szövetet. Katalógusa

fő eredményei katalógusa

Nem szignifikáns P-Smad2L és /vagy P-Smad3L pozitív festés volt kimutatható a legtöbb példányok (pozitív festődés 18/130 minta). Pozitív P-Smad2 /3L festés nem járt együtt csökkent a karboxil foszforiláció festés. Veszteség a P-Smad2C méltóan korrelált mélysége tumor beszivárgás és a rossz differenciálódása a rákos sejtek a gyomorrákos betegeknél. Nem volt kimutatható összefüggés a P-Smad3C klinikopatológiai jellemzői gyomor adenokarcinóma. Azonban, társ-festéssel analízis kimutatta, hogy a P-Smad3C co-lokalizált a α-SMA és a kollagén I gyomor rákos sejtek, jelezve a potenciális összefüggés P-Smad3C és epithelialis-to-mesenchymalis átmenet a rák. Real Time PCR bizonyította csökkent mRNS expressziója Smad2 gyomorkarcinómában képest a környező, nem tumoros szövetet 15/16 betegnél.

Következtetések

elvesztése P-Smad2C szorosan korrelált a rák terjedését és szegény differenciálás a gyomorrák. Ellentétben a kolorektális és a hepatocelluláris karcinóma, kanonikus karboxi-terminális foszforiláció, de nem linker foszforiláció, a Smad2 kritikus gyomorrák. Katalógusa

Citation: Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) csökkent szintje Aktív Smad2 korrelál rossz prognózissal gyomorrákban. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684 katalógusa

Szerkesztő: Javier S. Castresana, Navarrai Egyetem, Spanyolország katalógusa

Beérkezett: október 6, 2011; Elfogadva: március 20, 2012; Megjelent: április 23, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Wu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Finanszírozás: A tanulmány támogatta az egészségügyi Hivatal Zhejiang tartomány, Kína, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S. D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "Virtual máj" és a "sejt terápia" 01GN0987 (D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (D.) és LA997 /5-1 (D.); és a Dietmar Hopp Stiftung GmbH (D.). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák egyik vezető oka a rák okozta halál a világon, rangsor második férfiaknál és nőknél negyedik frekvencia [1]. Patogenezisében gyomorrák társított több tényező. Ezek közül szabályozási zavarának jelátviteli utak kapcsolódó fejlődési folyamatokat, beleértve a transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), Wnt /β-catenin, sün és Notch jeladás, központi szerepet játszik a fejlesztésben és progressziójában ez a rák [2].

A TGF-β család molekulák, beleértve a TGF-β izoformák, aktivinek és csont morfogén fehérjék (BMP-k), fontos funkciókat különböző fiziológiai és patofiziológiai folyamatokban, például embrionális fejlődés, autoimmun betegségek, fibrózis és rák [3], [4]. A TGF-β átalakítja annak jelek stimuláló képződése heteromer komplexek a TGF-β I. típusú (TGF-βRI), és a II típusú (TGF-βRII) szerin /treonin-kináz-receptorok. Az aktivált TGF-βRI terjedve jelző toborzásával és foszforilációja receptor által szabályozott-Smad (R-Smad, beleértve Smad2 és Smad3). Foszforilációja C-terminális szerin maradványok R-Smad döntő lépés a kanonikus TGF-β jelátviteli. A két leginkább C-terminális szerin maradékok szerin 465/467 a Smad2 és szerin 423/425 a Smad3 foszforilezzük, együtt egy harmadik nem foszforilezett szerin maradékot képez evolúciósan konzervált SSXS motívum összes R-Smad [5], [6]. Emellett a C-terminális foszforilációja Smad2 /3 (P-Smad2C és a P-Smad3C) a TGF-βRI, más kinázok, például c-Jun N-terminális kináz (JNK) és Ras-asszociált kinázok, ok foszforilációját R-Smad at linker helyek körül szerin 249/254 a Smad2 és szerin 208/213 a Smad3 (P-Smad2L és a P-Smad3L) [7 ], [8]. Foszforilált R-Smad komplexet alkotnak közös Smad (Co-Smad; Smad4 emlősökben) és transzfer a sejtmagba irányuló cél gén transzkripciós [3]. Emellett R-Smad és a társ-Smad, a harmadik típusú Smad fehérje inhibitor-Smad (I-Smad; Smad6 és Smad7). I-Smad transzkripcionálisan által kiváltott TGF-β, jelezve a negatív visszacsatolási mechanizmus jelátviteli útvonal [4].

TGF-β játszik kettős szerepet progressziójában az emberi rák [9], [10] . A korai szakaszaiban a rák, a TGF-β viselkedik, mint egy tumorszuppresszor gátlásával sejtproliferáció vagy előmozdításával celluláris apoptózis. Azonban a késői szakaszában, a TGF-β támogatja a tumor progresszióját mint például a tumor sejtek invázióját, a terjesztés és az immunrendszer adócsalás [9]. Ezen túlmenően, a TGF-β jól ismerik, mint a közvetítő az epithelialis-To-mesenchymalis átmenet (EMT) a rák [11]. Bár perturbációja TGF-β /Smad jelátvitel szempontjából központi karcinogenezis legtöbb szerveire, tumort elősegítő eredmény nagymértékben kontextus-függő. Például, a TGF-β jelátvitel sarkalatos a karbantartási rákos őssejt önmegújító és daganatkeltő tevékenység glioma és a leukémia, míg a hatása a TGF-β jelátviteli emlőrák őssejt ellentmondásosak [12]. Egy tanulmány azt mutatta, hogy blokkolja a TGF-β útvonal keresztül egy domináns negatív TGF-βRII növeli a méretét mell őssejt-kompartment, és elősegíti a tumorigenezis, jelezve egy elnyomása mell karcinogenezis ezen citokin [13]. Ezzel szemben, Mani és munkatársai megállapították, hogy a TGF-β útvonal minket kritikus a karbantartási mellrák őssejt-szerű tulajdonságokkal és daganatkeltő tevékenység révén indukáló EMT [14]. Katalógusa

A gyomorrák, egyetlen nukleotid polimorfizmusok ( SNP-k) a TGF-β társított érzékenységet I. stádiumú szakasz és a II a gyomorrák [15], [16]. A szérum TGF-β számoltak, hogy jelentősen korrelál vénás invázió betegeknél gyomorrák [17]. Azonban részletes mechanizmusok a TGF-β jelátviteli gyomorkarcinómában progresszió még ismeretlen. Ezen túlmenően, nem világos, hogy mikor és hogyan TGF-β átalakítja egy tumor szupresszor egy tumor promoter alatt carcinogenesis.

Nemrégiben egy eltolódás foszforilációját Smad2 /3 C-terminális linker oldalak mutattuk mint kulcsfontosságú esemény meghatározó biológiai funkciója a TGF-β a rák [18], [19], [20]. Korábbi tanulmányok alapján 12 éves követési kimutatták, hogy a krónikus HBV /HCV betegek P-Smad2 /3L máj szöveteiben volt nagyobb a kockázata a közeledő hepatocellularis carcinoma (HCC), mint a P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Összhangban a megállapítások a HCC, hasonló megfigyeléseket tettek vastagbélrákban [7], [22]. Katalógusa

Annak vizsgálata hozzájárulását eltérés Smad foszforiláció felé karcinogene- gyomorrák, megvizsgáltuk a P-Smad2 /3C és P-Smad2 /3L szint 130 beteg gyomor adenokarcinóma által immunhisztokémiai (IHC). Elemeztük a potenciális közötti összefüggéseket különböző helyei foszforilációja R-Smad és invázió, nyirokcsomó-metasztázis, a differenciálódást és szakaszában gyomorrák.

Eredmények

Linker foszforilációja Smad2 /3 nem jár a gyomorrák katalógusa

a korábbi megállapítások colorectalis rák és HCC [7], [8], [21], [22], nem találtunk szignifikáns P-Smad2L és /vagy P-Smad3L pozitív festéssel gyomor szöveteiben gyomorrákos betegeknél. Csak közül 18 130 beteg közül p-Smad3L pozitív festéssel, főként a nem rákos sejteket. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy linker foszforiláció szerin helyeire Smad2 /3 nem kritikus a gyomorrák.

különböző jellemzői a P-Smad2C és a P-Smad3C szintek gyomorrák

118 ki 130 gyomor szövetek azt mutatta, P-Smad2C pozitív festődés, és a 91 ki 130 gyomor szövetek pozitív volt P-Smad3C festés volt. Eltérő a P-Smad2C pozitív festődés, amelyet csak megjelenítésére a sejtmagban a normális és a rákos sejtek (1A.), P-Smad3C pozitív festődés kimutatható volt a sejtmagban (59/130, Fig. 1B), a membrán és a /vagy a citoplazmában (73/130, Fig. 1C) a gyomor rákos sejteket. Ezen túlmenően, a P-Smad3C látta pozitív festődés fibroblasztokban környező rákos sejtek (81/130 és 91/130, Fig. 1D).

Csökkentett P-Smad2C feltűnően korrelál a tumor mélység (T) és a differenciálódás a rák (G) betegeknél gyomorrákos

mértük a P-Smad2C IHC festést nem csak a tumor, hanem a környező nem tumoros szövetekben a 130 gyomorrákos betegeknél. P-Smad2C pozitív festődést sem a rákos vagy normális sejtek fordítottan arányos differenciálódását gyomorrák (mind A p
< 0,0001, 1. táblázat). Ezen túlmenően, csökkent a P-Smad2C IHC pontszám a rákos sejtekben korrelált tumor mélység ( p
< 0,05, 1. táblázat). P-Smad2C a normális szövetben is mutatott potenciális inverz összefüggést a rák terjedését ezekben a betegekben ( p
= 0,07, 1. táblázat). A P-Smad2C IHC pontszám szignifikánsan csökkent a rák szövetekben, mint a nem-tumoros szövetekben 77 ki 130 gyomorrákos betegeknél. Sőt, a tumoron belül szövetek rákos sejtek gyengén atípia mutatta, csökkent a P-Smad2C festéssel, ha összehasonlítjuk a jól differenciált is (ábra. 2). Kendall-tau korrelációs elemzés kimutatta, egy potenciális korreláció csökkenését a P-Smad2C festéssel és az átmenet a normális, hogy a rákos sejtek a gyomorrák ( p
= 0,05, 2. táblázat), ami arra utal, hogy az aktiválás a Smad2 jelátvitel egy kritikus szupresszor tumor kialakulását és progresszióját. katalógusa

P-Smad3C gyakran megtalálható rákkal összefüggő fibroblasztok katalógusa

P-Smad3C IHC pontszámot nem mutatott szignifikáns összefüggést a T /N /G /S gyomorrák mintát (1. táblázat). Azonban a P-Smad3C pozitív festődés gyakran előfordult fibroblasztok környező rákos sejtek betegeknél gyomorrák (ábra. 1).

rákos sejtek epiteliális eredetű és nem expresszálnak mesenchymalis markerek, például alfa-SMA és kollagén I. Ha a rákos sejtek expresszálják mesenchymalis markerek, ez utaló epithelialis-To-mesenchymalis átmenet (EMT) [11]. A jelen vizsgálatban azt találtuk, α-SMA pozitív festődést a rákos sejtekben 54 130 gyomorrákos betegeknél (például beteg-1 ábrán. 3). Annak tisztázása közötti lehetséges összefüggést p-Smad3C és EMT vizsgáltuk az összefüggést a p-Smad3C festéssel (rák és a környező, nem rákos szövet) és α-SMA pozitív festéssel a rákos sejtekben. Kendall-tau rank korrelációs együtthatók közötti p-Smad3C IHC pontszámot rákos /környező, nem daganatos szövetek és α-SMA IHC pontszámot rák 0,14 ( p katalógusa = 0,08) és -0,09 ( p
= 0,99), illetve (3. táblázat). Annak igazolására, EMT ezeknél a betegeknél végeztünk festéseket a csiga, másik specifikus markere EMT és a kollagén I /α-SMA a gyomor szövetekben. Konfokális mikroszkópia feltárta ko-lokalizációja Csiga és kollagén I (4A.) /Α-SMA (ábra. 4B) bizonyos gyomor rákos sejtekben. Ezek a α-SMA pozitív gyomor rákos sejteket is megjelenik a P-Smad3C pozitív festődés (ábra. 4C). Emellett co-lokalizáció α-SMA pozitív gyomorrák sejtek konfokális mikroszkópia feltárta, hogy a P-Smad3C co-lokalizált a kollagén I gyomorrák sejtek (ábra. 4D). Továbbá, a P-Smad3C pozitív festődés co-lokalizált a α-SMA és kollagén én nem csak a rákos sejtekben, hanem a fibroblasztok (ábra. 4C-4D). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a P-Smad3C hozzájárulhat EMT gyomorrák egyes betegeknél.

elvesztése teljes Smad2 és Smad3 expresszió gyomorrákos betegeknél

mérése mellett a P-Smad2 gyomorkarcinómában használtunk valós idejű PCR-kimutatására mRNS expressziója Smad2 és Smad3 gyomorrákban és a környező, nem daganatos szöveteket a 16 beteg. 15 és 12 beteg esetében kimutatták csökkent mRNS expressziója Smad2 és Smad3 a rákos szövetekben, összehasonlítva a környező normális szövetek (ábra. 5). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy nem csak aktivált Smad2 hanem a mRNS expresszióját teljes Smad2 során csökken a gyomor carcinogenesis.

Discussion

a kolorektális adenokarcinóma és HCC, eltolódást foszforiláció származó karboxi-terminálison linker régiók javasolták, mint egy kritikus esemény társított kapcsoló a TGF-β rákos szuppresszor, hogy egy onkogén tényező [8], [18], [19], [20], [21], [22]. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy ez lehetséges kapcsolat gyomorrákban. Nem észleltünk szignifikáns P-Smad2L és P-Smad3L szint 130 gyomorrákos betegeknél. 112 közül 130 beteg nem mutatott P-Smad2L vagy a P-Smad3L festődést gyomor rákos sejtekben, ami arra utal, hogy a javasolt váltás foszforilációját R-Smad nem járulnak hozzá a TGF-β által közvetített karcinogenezis az ilyen típusú rák. Ezzel szemben a P-Smad2 /3L, mind a P-Smad2C és a P-Smad3C pozitív festődést detektáltunk legtöbb betegnél gyomorrák. Kendall-tau rank korreláció analízis kimutatta, hogy a P-Smad2C IHC pontszám fordítottan korrelál a mélysége tumor (T) és a differenciálódás a rák (G).

A szerepe Smad2 alatt kialakulása és progressziója különböző rák típusa ellentmondásos marad . Összhangban a jelenlegi megállapítás, korábbi tanulmányok nyelőcső laphámrák, a mellrák és a vastagbélrák kimutatták, hogy a veszteség Smad2 kifejezés korrelál a tumor fejlődését és rossz prognózist jelent [23], [24], [25], [26]. Nemrégiben Hoot és munkatársai megállapították, hogy Smad2, de nem Smad3, ezt gyakran elvész a 83 beteg bőre laphámrák. Továbbá, egerek keratinocita-specifikus Smad2 törlés jelenik gyorsított képződése és rosszindulatú progressziója kémiailag indukált egér bőr tumorok, mint a vad típusú egerek [27]. Azonban egy vizsgálatban 52 beteg a glioma, a pozitív P-Smad2 IHC pontszámot jelentették korrelál elterjedése gliomák és rossz prognózist jelent [28]. Megelőzően a jelen tanulmány, Shinto és kollégái mért P-Smad2C festés 135 gyomorrákos betegeknél. Azt találták, hogy a P-Smad2C magasabb volt gyengén differenciált rák összehasonlítva jól differenciált is [29]. Nem világos, hogy még miért van teljesen ellentétes eredményeket gyomorrákban.

kanonikus TGF-β jelátvitel, aktivált TGF-βRI általában indukál karboxi-terminális foszforilációja egyaránt Smad2 és Smad3. Aktivált Smad2 és Smad3 eltérő szerepet játszanak a sejtek növekedését, differenciálódását és más biológiai funkcióit [30]. A májban Smad2 kritikus közvetítésében hepatocita növekedési és differenciálódási, míg a Smad3 játszik hatást a morfológiai és funkcionális éréséhez májcsillagsejtek [31], [32]. A daganatos betegségben, ez ellentmondásos, hogy zavar a Smad3 gén hozzájárul tumorogenezisben. Zhu számolt be, hogy a Smad3-hiányos egerek fejleszteni kolonkarcinóma [33]. Azonban más vizsgálatok segítségével Smad3-hiányos egerek azt javasolta, hogy a veszteség a Smad3 önmagában nem elegendő, hogy kezdeményezzen tumorgenezis [34], [35], [36], [37]. A gyomorrák, Han talált alacsony Smad3 3 az 8 betegek és kilenc humán gyomorrák sejtvonalakon [38]. Bemutatjuk a Smad3 vektor gyomor sejtvonalak felújított TGF-β érzékenységet. Továbbá, injekció Smad3-t expresszáló gyomor sejtek csupasz egerekbe mutatott késleltetett tumorigenezis, amikor a kontrollokhoz képest, jelezve egy korrelációs elvesztésének Smad3 a carcinogenesis [38]. A jelen tanulmányban nem találtunk szignifikáns összefüggést a P-Smad3C festés gyomorrák sejtek és a rák terjedését, a differenciálás és a színpadon. Eltérő a P-Smad2C, amelyet csak kifejezett magok a sejtek, P-Smad3C pozitív festődés kimutatható a sejtmagban, a membrán és a citoplazmában a gyomor rákos sejteket. Biológiai jelentőségének különböző mintákat a P-Smad3C festéssel rákos sejtekben jelenleg még ismeretlen.

EMT ráksejtek előfeltétele halad előrehaladott metasztatikus tumorok [11]. Felismerték, hogy a TGF-β jelentős szereplője EMT. Smad3, de nem Smad2 egyik legfontosabb mediátor TGF-β függő EMT [39]. Például, a TGF-β nem indukálnak EMT primer tubuláris epiteliális sejtekben származó vesék Smad3-deficiens egerekben [40]. Gátlása TGF-β jelátvitel által Ki26894, egy TGF-βRI inhibitor, csökkent invázió és EMT a scirrhous gyomorrák in vitro katalógusa [41]. Eredményeink azt mutatják, hogy része a gyomor rákos sejtek kifejezik EMT markereket, például Csiga, a kollagén I és α-SMA. Co-lokalizáció a P-Smad3C az α-SMA /kollagén I található egy jelentős alcsoportját betegeknél. Ezen túlmenően, α-SMA pozitív festődést a rákos sejtekben van egy potenciális korreláció P-Smad3C IHC pontszám a rákos sejteket, de nem a környező, nem daganatos szövetekben. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a P-Smad3C játszhat szerepet EMT gyomorrák.

Összefoglalva, a jelen tanulmány arra utal, hogy Smad2 egy fontos közvetítő, hogy megvédje a gyomor sejtek felé halad rosszul differenciált rák. Eredményeink szerint, a Smad3 nem kapcsolódik közvetlenül a jellemzői a gyomorrák, azonban, az adataink azt mutatták, hogy ez szerepet játszhat a rák összefüggő fibroblasztok és EMT a gyomor rákos sejteket.

Módszerek

a betegek katalógusa

Sebészeti mintákat vizsgáltunk primaer gyomorrák az Általános Sebészeti Osztály, az első Affiliated Kórház, Orvosi Egyetem, Zhejiang University, Kína 2003-tól 2009-gyomor szövetmintát szedték be, amikor műtétek boncolt a gyomorrák. Az összegyűjtött szöveteket tartalmazza tumor és a környező nem tumoros területek (szövetek legalább 5 cm-nél, távol a tumor). Egy része a szövetek fixáltuk 4% -os formaldehidben, és paraffinba ágyaztuk, hisztológiai és IHC mérés. Frissek maradtak szöveteket helyezték folyékony nitrogén azonnal mRNS mérése. Összesen 130 páros gyomor szövetek, köztük a rák és a környező, nem daganatos szövetek vontunk be. Patológiai diagnosztika és besorolások alapján becsüljük a tumor-node-metasztázis (TNM) besorolás által támogatott Nemzetközi Rákellenes Unió (hetedik kiadás) [42]. Alapvető jellemzői a beválogatott betegek táblázat 4. A vizsgálati protokollt igazodtak etikai irányelvek a Helsinki Nyilatkozat (1975). A tanulmány által jóváhagyott etikai bizottság az első Kapcsolt Kórház, Általános Orvostudományi Kar, Zhejiang University. Írásos hozzájárulást szereztünk minden résztvevő vett részt a tanulmányban. Katalógusa

antitestek katalógusa

Nyúl poliklonális antitestek ellen P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (Ser 250/255), és a P-Smad3L (Ser 208/213) írták le a korábbi tanulmányok [43], [44]. Egér anti-humán α-SMA (M0851), poliklonális anti-SNAIL (AB-17732), és a monoklonális anti-kollagén I (C2456) antitestek vásároltunk a DAKO, ABCAM és a Sigma volt.

Immunhisztokémia (IHC ) hotelben

Miután megvizsgálta a H &E-festett metszeteken a 130 beiratkozott gyomorrákos betegeknél, reprezentatív parafintömböket minden beteg számára választottak ki részben. A tárgylemezeket deparaffinised xilolban és rehidratált egy hígítási sort osztályozott etanol desztillált vízzel. Antigén-visszanyerés végeztük mikrohullámú kezelés EDTA pufferben (1 mmól, pH = 8,0). A tárgylemezeket ezután 3% H _{2 O 2-on 30 percig, szobahőmérsékleten. Mosás után PBS-sel háromszor, a metszeteket nyúl poliklonális antitesttel szemben P-Smad2C (1:100), p-Smad3C (1:100), p-Smad2L (1:50), p-Smad3L (1:50 ) és α-SMA (1:200) rendre 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át. A következő napon a lemezeket PBS-sel mostuk háromszor. Mosás után, azokat inkubáltuk EnVision peroxidáz (Dako) jelzett anti-nyúl vagy anti-egér antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Peroxidáz-aktivitást volt kimutatható diaminobenzidinnel (DAB). A tárgylemezeket hematoxilinnel ellenfestettük. Immunreaktivitás láthatóvá fénymikroszkóp alatt.}

A félkvantitatív elemzés, a megfestett metszeteket értékelni egy 4 pontos skálán az alábbiak szerint: pozitív sejtszámok, fokozat 0-3 (0, nincs pozitív sejtek; 1, <25% pozitív sejtet, 2, 25% -50% pozitív sejtek, 3, > 50% pozitív sejtek); intenzitása pozitív festés fokozat 1-3 (1, gyenge pozitív festés, általában sárga, 2, erős pozitív festés, rendszerint barna, 3, nagyon erős pozitív festést, általában mély barna-fekete). A végső immunfestéssel pontszám kiszámítása a szám × intenzitását. Katalógusa

Immunfluoreszcenciás festés katalógusa

A metszeteket deparaffinised xilolban és rehydráltuk felszálló etanol-ig desztillált vízzel. Ezután antigén-visszanyerés végeztük mikrohullámú kezelés EDTA pufferben (1 mmól, pH = 8,0). A tárgylemezeket ezután 3% H _{2 O 2-on 30 percig, szobahőmérsékleten. Mosás után PBS-sel, mind a primer antitesteket, nyúl anti-P-Smad3C /Csiga és egér anti-α-SMA /kollagén I, vittük át 4 ° C-on egy éjszakán át. Ezután, szekunder antitestek, Alexa633-nyúl anti-egér immunglobulin G és Alexa488-szamár anti-nyúl immunglobulin G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Németország), alkalmaztunk 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A mintákat rögzíthető a Dako-Cytomation Fluoreszkáló fedőoldattal. A lemezeket ellenőrzött és képek többsége a konfokális mikroszkóppal (Leica, Heidelberg). Szakaszok nélkül primer antitesteket alkalmaztunk negatív kontrollokként.}

Real Time PCR

A teljes RNS-t tisztítottunk a gyomor szövetek a High Pure RNS izolációs kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Németország) szerint a gyártó protokoll, és a koncentrációt spektrofotometriásán mértük. cDNS-t szintetizáltunk a 1 ug RNS-t a Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics). Kvantitatív valós idejű PCR-t végeztünk egy ABIPRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) alkalmazásával TaqMan univerzális PCR Master Mix Nem AmpErase UNG (Rend. 4.324.018). A következő génexpressziós teszteket használtuk: Smad2 (forward: CAAACCAGGTCTCTTGATGG hátoldal: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (forward: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG hátoldal: GAAGGCGAACTCACACAGC) és peptidylprolyl izomeráz A (háztartási gén; részt. Sz. Mm02342429_g1). Összes reagenst az Applied Biosystems. A mintákat három példányban a következő körülmények között: kezdeti denaturáció 2 percig 50 ° C hőmérsékleten, és 10 percen át 95 ° C-on, majd 40 ciklus: 15 s 95 ° C-on és 1 perc 60 ° C-on. A szintek génexpresszió minden mintában meghatároztuk az összehasonlító ciklus küszöbérték módszerrel.

Statisztikai elemzés

kiértékelésére közötti összefüggést kiválasztott immunhisztológiai markerek és a tumor paraméterek, Kendall-tau rank korreláció analízist végeztünk a SAS 9.2 verzió (Cary, NC, USA). A p katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

• PLoS One: lehetséges klinikai DNS metiláció gyomorrákban: A Meta-Analysis
• PLoS One: a térbeli eloszlást LGR5 + sejtek korrelál gyomorkarcinóma Progression