Plos ONE: znižane ravni aktivnega SMAD2 korelaciji s slabo prognozo želodčnega raka

Povzetek

Ozadje

TGF-β igra dvojno vlogo pri napredovanju raka pri ljudeh. V zgodnjih fazah karcinogeneze, TGF-beta funkcije kot zaviralnih. V poznih stopnjah razvoja tumorja, pa lahko TGF-β spodbujanje rasti tumorja in metastaz. Premik v Smad2 /3 fosforilacijo iz karboksi terminalu povezovalnik mesta je ključni dogodek določanje biološke funkcije TGF-ß v debelem in karcinomom jetrnih celic. V tej študiji smo raziskovali morebitno vlogo diferencialne Smad2 /3 fosforilacije v adenokarcinomom želodca.

Metodologija

Imunohistokemijsko z anti-P-Smad2 /3C in P-Smad2 /3L protiteles je bila izvedena na 130-parafin vgrajeni adenokarcinomom želodca osebkov. Analizirana je bila razmerje med P-Smad2 /3C in P-Smad2 /3L imunohistokemičnim točk in clinicopathologic značilnosti bolnikov. PCR v realnem času smo uporabili za merjenje mRNA izraz Smad2 in Smad3 pri raku in okolici, ki niso tumorsko tkivo.

Glavne ugotovitve

Ne pomemben P-Smad2L in /ali P-Smad3L pozitivno barvanje je odkrita v večini vzorcev (pozitiven barvanja v 18/130 vzorcev). Pozitivni P-Smad2 /3L obarvanje ni bilo povezano z zmanjšanjem karboksiterminalni fosfatnem barvanjem. Izguba P-Smad2C izredno povezana z globino infiltracije tumorja in slabe diferenciacije rakavih celic pri bolnikih z rakom želodca. Nobene povezave bilo zaznati med P-Smad3C in clinicopathologic značilnosti adenokarcinomom želodca. Vendar pa analiza co-obarvanje pokazala, da P-Smad3C co-lokalizirano z a-SMA in kolagena I v želodčnih rakavih celic, kar kaže na morebitno povezavo med P-Smad3C in epitelnih-to-mezenhimskega prehod raka. PCR v realnem času dokazali zmanjšano mRNA izraz Smad2 v rakom želodca v primerjavi z okoliškimi zunaj tumorja tkiva pri 15/16 bolnikih.

Sklepi

Izguba P-Smad2C tesno povezana z rakom invazijo in slaba diferenciacija pri raku želodca. V nasprotju s debelega črevesa in karcinomom jetrnih celic, kanonični karboksi-terminal fosforilacije, vendar ne povezovalnik fosforilacijo, ki znaša Smad2 ključnega pomena za raka želodca

Navedba. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Münker S et al. (2012) zmanjšana koncentracije aktivnih SMAD2 korelaciji s slabo prognozo želodčnega raka. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684

Urednik: Javier S. Castresana, University of Navarra, Španija

Prejeto: 6. oktober, 2011; Sprejeto: 20. marec 2012; Objavljeno: 23. april 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Študija je podprla zdravje Bureau Zhejiang province Kitajske, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., SD); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "Virtual jetra" in "celična terapija" 01GN0987 (SD); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (SD) in LA997 /5-1 (SD); in Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S.D.). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu, razvrstitev sekundo pri moških in četrti pri ženskah po pogostnosti [1]. Patogeneza raka želodca je povezana s številnimi faktorji. Med njimi disregulacijo signalnih poti, povezane z razvojnimi procesi, vključno s preoblikovanjem rastni faktor-P (TGF-beta), NT /β-catenin, ježa in Notch signalizacija, ima osrednjo vlogo pri razvoju in napredovanju tega raka [2].

TGF-β družina molekul, vključno TGF-beta izooblik, activins in proteini za morfogenezo kosti (BMP), ima pomembne funkcije v različnih fizioloških in patofizioloških procesih, na primer embrionalni razvoj, avtoimunskih bolezni, fibroza in rak [3], [4]. TGF-β transduces njene signale tako, da spodbuja tvorbo heteromernih kompleksov tipa TGF-beta I (TGF-βRI) in tipa II (TGF-βRII) serinskih /treonin kinaze receptorjev. Aktivirani TGF-βRI širi signalizacijo, ki jih zaposlovanju in fosforilacijo receptorjev urejeno-Smads (R Smads, vključno Smad2 in Smad3). Fosforilacijo C-terminalnih ostankov serinskih v R Smads je ključni korak za kanonični TGF-beta signalizacijo. Dve najbolj C-terminalni ostanki serin na serinom 465/467 v Smad2 in serina 423/425 v Smad3 fosforilirajo, skupaj s tretjo brez fosforiliranim ostanek serin, tvorita evolucijsko ohranjene SSXS motiv na vseh R Smads [5] [6]. Poleg C-terminala fosforilacijo Smad2 /3 (P-Smad2C in P-Smad3C) z TGF-βRI, drugih kinaz, npr c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) in Ras-povezane kinaz, povzroči fosforilacijo R Smads na povezovalnih mestih po serin 249/254 v Smad2 in serin 208/213 v Smad3 (P-Smad2L in P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforilirata R-Smads tvorijo kompleks s skupnim SMAD (Co-SMAD; Smad4 pri sesalcih) in prevoz v jedru za ciljno genov prepisovanje [3]. Poleg R-SMAD in sodelovanja SMAD, tretja vrsta SMAD beljakovin je zaviralec-SMAD (I-SMAD; Smad6 in Smad7). I-Smads so transkripcijsko inducirane s TGF-P, kar kaže na negativni povratni mehanizem te signalne poti [4].

TGF-β ima dvojno vlogo pri napredovanje raka človeškega [9], [10] . V zgodnjih fazah raka, TGF-beta deluje kot zaviralnih da inhibira celično proliferacijo ali s spodbujanjem celično apoptozo. Vendar pa je v poznih fazah, TGF-β podpira napredovanje tumorja, kot so mobilni invazije tumorja, razširjanje in imunskega utaj [9]. Poleg tega je TGF-β tudi priznano kot posrednik epitelnih-do-mezenhimskega prehoda (EMT) v raka [11]. Čeprav so nepravilnosti v TGF-β /SMAD signalizacijo osrednji rakotvornosti v večini organov, njen tumor spodbujanje izid je zelo konteksta odvisne. Na primer, TGF-β signalizacijo je ključnega pomena pri vzdrževanju raka izvornih celic samo-obnove in tumorogenega aktivnosti v glioma in levkemijo, ker so učinki TGF-beta signalizacijo v raka dojk izvornih celic sporna [12]. Ena študija je pokazala, da je blokiranje TGF-beta pot preko prevladujoče negativna TGF-βRII poveča velikost celic predelu prsi stebla in spodbuja tumorigeneze, kar kaže na zatiranje karcinogenezo dojke tega citokina [13]. Nasprotno, Mani in kolegi ugotovili, da TGF-beta poti nas kritično pri vzdrževanju raka dojk izvornih lastnosti celic podobnih in tumorogenega dejavnosti preko indukcijo EMT [14].

raka želodca, single-nukleotidnih polimorfizmov ( SNP) TGF-ß so povezane z dovzetnostjo za stopnjo I in fazo II raka želodca [15], [16]. so poročali o serumske koncentracije TGF-ß bistveno povezati z vensko invazijo pri bolnikih z rakom želodca [17]. Vendar pa se podrobna mehanizmi TGF-ß signalizacija želodčnega napredovanje raka še niso znani. Poleg tega še vedno ni jasno, kdaj in kako TGF-β preoblikujejo od supresorski tumorja v promotor tumorjev med rakotvornost.

Pred kratkim je premik v fosforilacije Smad2 /3 od C-terminal na povezovalnih mestih je bila dokazana kot ključni dogodek določanje biološke funkcije TGF-ß v raka [18] [19] [20]. Prejšnje študije, ki temeljijo na 12-letnem sledenju je pokazala, da kronično HBV /imelo HCV bolniki s P-Smad2 /3L jetrnih tkivih večje tveganje za napredovanje do karcinomom jetrnih celic (HCC), razen tistih s P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. V skladu z ugotovitvami v HCC, so bili podobni opazovanje v kolorektalnega raka [7], [22].

Da bi preučili prispevek diferencialne SMAD fosforilacije do karcinogenosti raka želodca, smo raziskovali P-Smad2 /3C in P-Smad2 /ravni 3L pri 130 bolnikih z adenokarcinomom želodca z imunohistokemijo (IHK). Analizirali smo možne korelacije med različnimi lokacijami za fosforilacijo R-Smads in invazije, bezgavkah metastaze, diferenciacijo in stopnjo raka želodca.
je

Rezultati

Linker fosforilacijo Smad2 /3, ki niso povezane z želodčno
raka

v nasprotju s prejšnjimi ugotovitvami iz kolorektalnega raka in HCC [7], [8], [21] [22], nismo odkriti pomembne P-Smad2L in /ali P-Smad3L pozitiven obarvanje v želodčnih tkiv pri bolnikih z rakom želodca. Le 18 od 130 bolnikov, je pokazala, p-Smad3L pozitivno barvanje predvsem v ne-rakavih celic. Ti rezultati kažejo, da povezovalno fosforilacijo v serinskih straneh Smad2 /3 ni ključnega pomena pri raku želodca.

Različne značilnosti P-Smad2C in P-Smad3C ravni pri raku želodca

118 od 130 želodčne tkiva je pokazala, P-Smad2C pozitivno barvanje, in 91 od 130 želodca tkiva so bili pozitivni za P-Smad3C barvanjem oz. Razlikuje od P-Smad2C pozitivni obarvanjem, ki je bil prikazuje le v jedru normalnih in rakavih celic (sl. 1A), je P-Smad3C pozitivno obarvanje dokazali v jedru (59/130, sl. 1B), na membrano in /ali v citoplazmi (73/130, sl. 1C) želodčnih rakavih celic. Poleg tega je bila P-Smad3C gledati s pozitivnim obarvanjem v fibroblastih okoliških rakave celice (81/130 in 91/130, sl. 1D).

znižani P-Smad2C izredno sovpada z globino tumorja (T) in diferenciacije raka (G) pri bolnikih z rakom želodca

smo izmerili P-Smad2C IHC obarvanja ne samo v tumorju, ampak tudi v okolici ne tumorskih tkiv od 130 bolnikov z rakom želodca. P-Smad2C pozitivno obarvanje bodisi raka ali normalnih celic obratno povezana z diferenciacijo raka želodca (oboje p
< 0.0001, tabela 1). Poleg tega je znižala oceno P-Smad2C IHC v rakavih celicah soodvisnih z globino tumorja ( p
< 0,05, tabela 1). Ravni P-Smad2C v normalnem tkivu kot tudi pokazala morebitno obratno korelacijo z invazijo raka pri teh bolnikih ( p
= 0,07, tabela 1). ocena P-Smad2C IHC je bistveno zmanjšalo v tumorskih tkivih v primerjavi z ne-tumorskih tkivih, v 77 od 130 bolnikov z rakom želodca. Poleg tega so v tumorskih tkiv, rakave celice s slabo atipičnosti pokazala zmanjšala P-Smad2C obarvanje v primerjavi z dobro diferenciranih-tisti (Sl. 2). Kendall-tau analiza korelacije je pokazala morebitno povezavo med zmanjšanjem P-Smad2C barvanjem in prehod iz normalnega do rakavih celic pri bolnikih z rakom želodca ( p
= 0,05, tabela 2), kar kaže, da aktiviranje Smad2 signalizacijo je kritična poka nastanka tumorjev in napredovanje.

P-Smad3C je pogosto najdemo v raka povezana fibroblastov

P-Smad3C ocena IHC niso pokazali pomembno povezavo s T /N /G /J želodčne vzorci raka (tabela 1). Vendar P-Smad3C pozitivno obarvanje pogosto pojavili v fibroblastih okoliških rakavih celic pri bolnikih z rakom želodca (sl. 1).

Rakave celice so epitelnega izvora in ne izražajo mezenhimskih označevalcev, npr a-SMA in kolagena I. Če rakave celice izražajo mezenhimskih označevalcev je, ki kažejo na epitelnih-to-mezenhimskega prehoda (EMT) [11]. V tej študiji smo ugotovili, α-SMA pozitivno barvanje na rakave celice v 54 od 130 bolnikov z rakom želodca (npr bolnik-1, sl. 3). Za pojasnitev možnih povezav med p-Smad3C in EMT, smo raziskovali povezavo med p-Smad3C barvanjem (rak in okoliške brez raka tkiva) in α-SMA pozitivno obarvane v rakavih celicah. Kendall-tau čin korelacijske koeficiente med p-Smad3C IHC točk pri raku /okoliških ne-rakavo tkivo in α-SMA IHC rezultate pri raku so 0,14 ( p
= 0,08) in -0,09 ( p
= 0,99) oziroma (tabela 3). Za potrditev EMT pri teh bolnikih, smo izvedli sodelovanje barvanje za polž, drugi posebni označevalec EMT in kolagen I /α-SMA v želodčnih tkivih. Konfokalna mikroskopija je pokazala, co-lokalizacija polžem in kolagen I (sl. 4A) /α-SMA (sl. 4B) v nekaterih želodčnih rakavih celic. Te α-SMA pozitivnih želodca rakave celice ter prikaže P-Smad3C pozitivno barvanje (sl. 4C). Poleg co-lokalizacija s α-SMA pozitivnih želodčnih rakavih celic, konfokalna mikroskopija je pokazala, da P-Smad3C sočasno lokalizirani s kolagenom I v želodcu rakavih celic (sl. 4D). Nadalje P-Smad3C pozitivno obarvanje sočasno lokalizirano z a-SMA in kolagen I ne samo v rakavih celicah, temveč tudi v fibroblaste (sl. 4C-4D). Ti rezultati kažejo, da lahko P-Smad3C prispevajo k EMT raka želodca pri nekaterih bolnikih.

Izguba celotne Smad2 in Smad3 izražanja pri bolnikih z želodčnega raka

Poleg merjenja P-Smad2 raka želodca smo uporabili PCR v realnem času za odkrivanje mRNA izraz Smad2 in Smad3 z rakom želodca in okoliških non-tumorskih tkivih od 16 bolnikov. 15 in 12 bolnikov oziroma dokazali znižala mRNA izraz Smad2 in Smad3 v tumorskih tkivih, v primerjavi z okoliškimi normalnih tkiv (sl. 5). Ti rezultati kažejo, da se ne aktivira le Smad2 ampak je mRNA izraz skupne Smad2 v želodcu rakotvornost zmanjša.

Pogovor

V kolorektalnega adenokarcinoma in HCC, premik v fosforilacijo od karboksi-terminalnem povezovalca regije je bilo predlagano kot kritičnega dogodka, povezanega s stikalom TGF-ß iz supresorski raka na onkogenih faktor [8], [18] [19] [20] [21] [22]. V tej študiji smo preučili to potencialno združenje za rak želodca. Nismo odkrili visoke vrednosti P-Smad2L in P-Smad3L pri 130 bolnikih z rakom želodca. 112 od 130 bolnikov, ni pokazala P-Smad2L ali P-Smad3L obarvanje v želodčnih rakavih celicah, kar kaže, da je predlagana sprememba fosforilacijo R-SMAD ne smejo prispevati k TGF-ß posredovanega rakotvornost pri tej vrsti raka. V nasprotju s P-Smad2 /3L, tako P-Smad2C in P-Smad3C bil pozitiven obarvanje odkrili pri večini bolnikov z rakom želodca. Kendall-tau analiza rang korelacija je pokazala, da je ocena P-Smad2C IHC obratno korelira z globino tumorja (T) in diferenciacijo raka (G).

Vloga Smad2 času nastanka in napredovanja drugačne vrste raka še vedno sporna . V skladu s trenutno ugotovitve prejšnje študije o požiralnika ploščatocelični karcinom, rak dojke in debelega črevesja je pokazala, da je izguba Smad2 izražanja povezana z razvojem tumorja in slabo prognozo [23] [24] [25] [26]. V zadnjem času, Hoot s sodelavci ugotovil, da Smad2, vendar ne Smad3 je pogosto izgubil v 83 bolnikov z rakom kože skvamoznoceličnim. Poleg tega miši z keratinocitov specifične Smad2 izbris prikaže pospešeno nastajanje in maligne napredovanje kemično povzročenih miško kožnih tumorjev v primerjavi z mišmi divjega tipa [27]. Vendar pa je v študiji 52 bolnikov z gliomom, so poročali pozitivna ocena P-Smad2 IHC povezati s širjenjem gliomov in slabo prognozo [28]. Pred tej študiji, Šinto in sodelavci izmeri P-Smad2C obarvanja pri 135 bolnikih z rakom želodca. Ugotovili so, da so bile koncentracije P-Smad2C višja pri raku slabo razlikujejo v primerjavi z dobro diferenciranim tiste [29]. Ni še jasno, zakaj so popolnoma nasprotujoči si rezultati pri raku želodca.

V kanonični TGF-beta signalizacijo, aktivira TGF-βRI ponavadi povzroči boksi-terminal fosforilacijo tako Smad2 in Smad3. Aktivirani Smad2 in Smad3 igrajo različne vloge v celično rast, diferenciacijo in drugih bioloških funkcij [30]. V jetrih, Smad2 je ključnega pomena pri posredovanju hepatocitne rasti in diferenciacije, medtem Smad3 igra ključno vpliva na morfološke in funkcionalne zorenje jetrnih zvezdastih celic [31], [32]. Pri raku, je sporno, ali je okvara gena Smad3 prispeva k tumorigeneze. Zhu je poročala, da miši Smad3 s pomanjkanjem razvije karcinom kolona [33]. Vendar druge študije, ki uporabljajo Smad3-pomanjkljivo miši kažejo, da je izguba Smad3 ne zadošča za začetek tumorigeneze [34] [35] [36] [37]. Pri raku želodca, Han našel nizke ravni Smad3 v 3 od 8 bolnikov in v devetih človeških želodca raka celičnih linij [38]. Uvedba Smad3 vektorja v celičnih linijah želodcu obnovljena TGF-beta odzivnost. Poleg tega injekcijo Smad3-izražanje želodčnih celic v golih miših so pokazale zapoznelo tumorigeneze v primerjavi s kontrolno skupino, kar kaže na korelacijo izgube Smad3 z rakotvornosti [38]. V tej študiji nismo našli pomembno povezanost med P-Smad3C obarvanje v želodcu rakavih celic in raka invazije, diferenciacije in fazi. Razlikuje od P-Smad2C, ki se izraža le v jedrih celic, P-Smad3C pozitivno obarvanje je zaznati v jedru, na membrano in v citoplazmi želodčnih rakavih celic. Biološki pomen različnih vzorcev P-Smad3C obarvane v rakavih celicah je trenutno še ni znan.

EMT rakavih celic, je pogoj za napredovanje v naprednih metastatskih tumorjev [11]. Ugotovljeno je bilo, da je TGF-β glavni akter v EMT. Smad3, vendar ne Smad2, je ključni posrednik pri TGF-beta odvisne EMT [39]. Na primer, TGF-β ne inducira EMT v primarnih tubularnih epitelijskih celic, pridobljenih iz ledvic miši Smad3 s pomanjkanjem [40]. Zaviranje TGF-beta signalizacijo, ki ga Ki26894, inhibitor TGF-βRI, zmanjšal invazijo in EMT za scirrhous raka želodca in vitro
[41]. Naši rezultati kažejo, da je bil del želodca rakave celice izražajo EMT označevalcev, npr Polž, kolagen I in α-SMA. Co-lokalizacija P-Smad3C z a-SMA /kolagena I se nahaja v znatnem podskupini bolnikov. Poleg tega, α-SMA pozitivno obarvanje v rakavih celicah ima potencialno povezan z oceno P-Smad3C IHC rakavih celic, vendar ne obkroža nerakave tkiva. Ti rezultati kažejo, da bi P-Smad3C igrajo vlogo pri EMT raka želodca.

Če povzamemo, ta študija kaže, da je Smad2 pomemben mediator za zaščito želodčne celice napredujejo proti raku slabo diferencirano. Po naših rezultatih, Smad3 ni neposredno povezan z značilnostmi raka želodca, pa so naši podatki kažejo, da lahko igrajo vlogo pri raku povezana fibroblastov in EMT želodčnih rakavih celic.

Metode

Bolniki

Kirurški vzorci so bili pregledani, pri bolnikih s primarnim rakom želodca na Oddelku za splošne kirurgije, prvi pridružiti Hospital, Medical School, Zhejiang University, Kitajska od leta 2003 do 2009. želodcu tkiva vzorec je bilo odvzeto, ko seciramo operacije želodčni rak. Zbrani tkiva vključeni tumor in okoliških ne-tumorske območja (tkiva vsaj več kot 5 cm daleč stran od tumorja). Del tkiv bila določena z v 4% formaldehidu in vdelali v parafin za histologijo in merjenje IHC. Ostali sveži tkiva smo takoj začeli v tekočem dušiku za merjenje mRNA. Skupno je bilo v 130 seznanjenih želodca tkiva, vključno z rakom in okoliških non-tumorskih tkivih. Patološko diagnozo in klasifikacije so bili ocenjeni v skladu z razvrstitvijo tumor-node-metastaze (TNM), ki ga je Mednarodna zveza se zavzema proti raku (sedmi izdaji) [42]. Osnovne značilnosti vpisanih pacientov so prikazani v tabeli 4. Protokol študije skladna z etičnimi smernicami Helsinški deklaraciji (1975). Študija je odobril odbor za etiko prve odvisnimi Hospital, Medical School, Zhejiang University. Pisnih obvestil soglasja so bili pridobljeni od vseh udeležencev, vključenih v raziskavo.

Protitelesa

Rabbit poliklonska protitelesa proti P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255) in P-Smad3L (ser 208/213) so bili opisani v prejšnjih študijah [43], [44]. Mouse anti-humana α-SMA (M0851), poliklonski anti-POLŽ (ab-17732), in monoklonsko anti-kolagen I (C2456) protitelesa so bile kupljene od DAKO, Abcam in Sigma oz.

imunohistokemija (IHK )

Po pregledu H & E-barvna stekelca od 130 vpisanih bolnikov z rakom želodca, je bilo izbranih reprezentativnih parafinske bloke za vsakega bolnika na oddelku. Diapozitivi so deparaffinised v ksilen in rehidrirane v seriji redčenja stopenjski etanola z destilirano vodo. Antigen Preiskovalna smo izvedli z mikrovalovno zdravljenje v EDTA pufrom (1 mmol, pH 8,0). Drsniki smo nato obdelali s 3% H _{2O 2, 30 minut pri sobni temperaturi. Po spiranju s PBS trikrat, so diapozitivi inkubirali z kunčje poliklonalno protiteles proti P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (1:50 ) in α-SMA (1:200) oziroma pri 4 ° C preko noči. Naslednji dan so bile drsi speremo s PBS trikrat. Po izpiranju smo jih inkubirali z predvidevamo peroksidazo (Dako) označenega anti-zajca ali protitelesa anti-miško za 1 uro pri sobni temperaturi. Peroksidaze dejavnost je bila odkrita s diaminobenzidine (DAB). Diapozitivi so jih nasprotno z hematoksilinom. Radioinkorporacijo smo vizualizirali pod svetlobnim mikroskopom}

Za semikvantitivnimi analizo, so bile obarvane odseki tkiva ocenjena na 4-stopenjski lestvici, kot sledi: pozitivnih celic, stopnje 0-3 (0, pozitivnih celic; 1, <.; 25% pozitivnih celic, 2, 25% -50% pozitivnih celic, 3, > 50% pozitivnih celic); Intenzivnost pozitivnega obarvanja, stopnje 3/1 (1, šibko pozitiven barvanje, ponavadi rumene barve, 2, močna pozitivna barvanje, ponavadi rjava, 3, zelo močna pozitivna barvanje, ponavadi globoko rjave do črne barve). Končni rezultat imunski obarvanje je bila izračunana kot število × intenzivnosti.

imunofluorescenco

Diapozitivi so deparaffinised v ksilen in rehidrirane v razvrstijo etanola do destilirano vodo. Nato smo antigena Preiskovalna izvede z mikrovalovno zdravljenje v EDTA pufrom (1 mmol, pH 8,0). Drsniki smo nato obdelali s 3% H _{2O 2, 30 minut pri sobni temperaturi. Po spiranju s PBS, tako primarnih protiteles, kunčjega anti-P-Smad3C /Polž in miške anti-a-SMA /kolagena I, so bili uporabljeni pri 4 ° C preko noči. Potem, sekundarnih protiteles, Alexa633-kunčjega anti-miš imunoglobulin G in Alexa488-osel anti-kunčje imunoglobulin G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Nemčija), so bili uporabljeni za 30 minut pri sobni temperaturi. Vzorci so bili nameščeni s pomočjo Dako-Cytomation Fluorescent zaščitnim sredstvom. Diapozitivi so bili pregledani in slike so bile posnete na konfokalnim mikroskopom (Leica, Heidelberg). Oddelki brez primarnih protiteles smo uporabili kot negativni kontroli.}

PCR v realnem času

Skupno RNA smo očistili iz želodčnih tkiv z visoko Pure RNA izolacije komplet (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Nemčija) v skladu protokolu proizvajalca, in koncentracijo smo izmerili spektrofotometrično. cDNA smo sintetizirali od 1 ug RNA z Transcriptor prve Strand cDNA sinteze komplet (Roche Diagnostics). Kvantitativni PCR v realnem času je bila izvedena s sistemom za ABIPrism 7700 odkrivanje zaporedje (Applied Biosystems) z uporabo TaqMan univerzalno PCR master mix št AmpErase UNG (del št. 4324018). Uporabljajo se naslednje genske ekspresije smo analize: Smad2 (naprej: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; obratno: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (naprej: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; obratno: GAAGGCGAACTCACACAGC) in peptidylprolyl izomeraza A (vzdrževalni gen, del ni Mm02342429_g1..). Vsi reagenti so bili kupljeni od Applied Biosystems. Vzorce smo izvedli v treh izvodih pod naslednjimi pogoji: začetni denaturaciji 2 minuti pri 50 ° C in 10 minut pri 95 ° C, čemur sledi 40 ciklov po 15 sekund pri 95 ° C in 1 minuto pri 60 ° C. Ravni genske ekspresije v vsakem vzorcu smo določili z metodo primerjalnega praga cikel.

Statistična analiza

Da bi ocenili povezavo med izbranimi imunohistološkega označevalcev in parametrov tumor, je bila izvedena Kendall-tau analiza rang korelacija uporabo SAS različice 9.2 (Cary, NC, ZDA). A p
. ≪ 0.05 smo imeli statistično značilno

• Plos ONE: Klinični potencial DNA metilacije želodčnega raka: A Meta-Analysis
• Plos ONE: Prostorska porazdelitev LGR5 + celic sovpada s Rak želodca Progression