PLoS ONE: verminderde niveaus van Active SMAD2 correleren met een slechte prognose bij maagkanker

De abstracte

Achtergrond

TGF-β speelt een dubbele rol in de progressie van kanker bij de mens. Tijdens de vroege stadia van carcinogenese, TGF-β functioneert als een tumor suppressor. Tijdens de late stadia van tumorontwikkeling echter TGF-β kan tumorgroei en metastase bevorderen. Een verschuiving in Smad2 /3 fosforylering van de carboxyterminus naar sites linker een sleutelgebeurtenis bepalen van biologische functie van TGF-β colorectaal en hepatocellulair carcinoom. In het onderhavige onderzoek onderzochten we de mogelijke rol van differentiële Smad2 /3 fosforylering in gastrisch adenocarcinoom.

Methodologie

Immunohistochemische kleuring met anti-P-Smad2 /3C en P-Smad2 /3L antilichamen werd uitgevoerd op 130-paraffine ingebedde monsters maagdarmkanker. De relatie tussen P-Smad2 /3C en P-Smad2 /3L immunohistochemische score en clinicopathologic kenmerken van de patiënten werd geanalyseerd. Real time PCR werd gebruikt om mRNA expressie van Smad2 en Smad3 meten kanker en omringende niet-tumorweefsel.

Principal Beoordeling

Significante P-Smad2L en /of P-positieve kleuring was Smad3L gedetecteerd in de meeste monsters (positieve kleuring in 18/130 monsters). Positieve P-Smad2 /3L kleuring werd niet geassocieerd met een afname carboxy fosforylering kleuring. Verlies van P-Smad2C opvallend gecorreleerd met de diepte van de tumor infiltratie en slechte differentiatie van kankercellen bij patiënten met maagkanker. Geen correlatie was aantoonbaar tussen de P-Smad3C en clinicopathologic kenmerken van adenocarcinoom van de maag. Echter, co-kleuring analyse toonde aan dat P-Smad3C co-gelokaliseerd met α-SMA en collageen I bij maagkanker cellen, wat wijst op een mogelijke verband tussen P-Smad3C en epitheliale-to-mesenchymale overgang van kanker. Real time PCR aangetoond verminderde mRNA expressie van Smad2 bij maagkanker in vergelijking met de omliggende niet-tumorweefsel in 15/16 patiënten.

Conclusies

Verlies van P-Smad2C nauw gecorreleerd met kanker invasie en slechte differentiatie bij maagkanker. In tegenstelling tot colorectale en leverkanker, canonieke carboxyterminale fosforylering, maar niet linker-fosforylering van Smad2 is van cruciaal belang voor maagkanker

Visum:. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Münker S, et al. (2012) verlaagde Active SMAD2 correleren met een slechte prognose bij maagkanker. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10.1371 /journal.pone.0035684

Editor: Javier S. Castresana, Universiteit van Navarra, Spanje

Ontvangen: 6 oktober 2011; Aanvaard: 20 maart 2012; Gepubliceerd: 23 april 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Het onderzoek werd gesteund door de Health Bureau van Zhejiang provincie van China, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "Virtual lever" en "celtherapie" 01GN0987 (S.D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S.D.) en LA997 /5-1 (S.D.); en de Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S.D.). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de wereld, met een tweede plaats bij mannen en vierde bij vrouwen in de frequentie [1]. De pathogenese van maagkanker is gekoppeld aan meerdere factoren. Hiervan ontregeling van signaaltransductiewegen betrekking tot ontwikkelingsprocessen, waaronder transformerende groeifactor-β (TGF-β), Wnt /β-catenine, hedgehog en Notch signalering speelt een centrale rol in de ontwikkeling en progressie van de kanker [2].

De TGF-β familie van moleculen, waaronder TGF-β isovormen, activines en bot morfogenetische eiwitten (BMPs), heeft belangrijke functies bij diverse fysiologische en pathofysiologische processen, bv embryonale ontwikkeling, auto-immuunziekten, fibrose en kanker [3], [4]. TGF-β overbrengt de signalen door het stimuleren van vorming van heteromere complexen van TGF-β type I (TGF-βRI) en type II (TGF-βRII) serine /threonine kinase receptoren. Geactiveerde TGF-βRI propageert signalering door werving en fosforylering van-receptor gereguleerde-Smads (R-Smads, waaronder Smad2 en Smad3). Fosforylering van C-terminale serine residuen in R-Smads is een cruciale stap voor canonieke TGF-β signalering. De twee C-terminale serine residuen op serine 465/467 in Smad2 en serine 423/425 in Smad3 gefosforyleerd, tezamen met een derde niet-gefosforyleerd serine residu, vormen een evolutionair geconserveerd SSXS motief in alle R-Smads [5], [6]. Naast C-terminale fosforylering van Smad2 /3 (P-Smad2C en P-Smad3C) van TGF-βRI, andere kinasen, b.v. c-Jun-N-terminale kinase (JNK) en Ras-geassocieerde kinases, veroorzaakt fosforylering van R-Smads in linker plaatsen rond serine 249/254 in Smad2 en serine 208/213 in Smad3 (P-Smad2L en P-Smad3L) [7 ], [8]. Gefosforyleerde R-Smads vormen een complex met gemeenschappelijke Smad (Co-Smad, Smad4 bij zoogdieren) en shuttle in de kern van doelgen-transcriptie [3]. Naast R-Smad en co-Smad, het derde type Smad-proteïne inhibitor-Smad (I-Smad, Smad6 en Smad7). I-Smads wordt transcriptioneel geïnduceerd door TGF-β, hetgeen een negatief terugkoppelingsmechanisme van deze signaalweg [4].

TGF-β speelt een dubbele rol in de progressie van kanker bij de mens [9], [10] . In de vroege stadia van kanker, TGF-β fungeert als een tumor suppressor door remming van cellulaire proliferatie of cellulaire apoptose bevorderen. In de late stadia, TGF-β ondersteunt tumorprogressie zoals tumorcel invasie, disseminatie en immuun-ontwijking [9]. Bovendien wordt TGF-β ook erkend als een mediator van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in kanker [11]. Hoewel verstoringen van TGF-β /Smad signalering centraal carcinogenese in de meeste organen, de tumorbevorderende uitkomst sterk contextafhankelijk. Bijvoorbeeld TGF-β signalering is cruciaal bij de handhaving van kanker stamcellen zelfvernieuwing en tumorontwikkeling in glioom en leukemie, terwijl de effecten van TGF-β signalering bij borstkanker stamcellen controversieel [12]. Een studie toonde aan dat het blokkeren van TGF-β pathway via een dominant negatieve TGF-βRII neemt de grootte van de borst stamcel compartiment en bevordert het ontstaan ​​van tumoren, hetgeen een onderdrukking van borst carcinogenese van dit cytokine [13]. Daarentegen Mani en collega's vonden dat TGF-β pathway ons kritisch zijn bij de handhaving van borstkanker stamcelachtige eigenschappen en tumorontwikkeling via induceren EMT [14].

In maagkanker, enkele-nucleotide polymorfismen ( SNPs) van TGF-β zijn geassocieerd met gevoeligheid voor fase I en fase II van maagkanker [15], [16]. De serumniveaus van TGF-β gemeld significant gecorreleerd met veneuze invasie bij patiënten met maagkanker [17]. Echter, precieze werking van TGF-β signalering bij maagkanker progressie zijn nog onbekend. Bovendien is onduidelijk hoe en wanneer TGF-β transformeert van een tumor suppressor in tumorpromotor tijdens carcinogenese.

Onlangs, een verschuiving in fosforylering van Smad2 /3 van C-terminaal linker site werd aangetoond dat een belangrijke gebeurtenis bepalen van biologische functie van TGF-β bij kanker [18], [19], [20]. Eerdere studies gebaseerd op 12 jaar follow-up aangetoond dat chronische HBV /HCV patiënten met P-Smad2 /3L in leverweefsel een hoger risico op overgang naar hepatocellulair carcinoom (HCC) dan die met P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. In overeenstemming met de bevindingen in HCC werden soortgelijke waarnemingen gedaan bij colorectale kanker [7], [22].

Om de bijdrage van differentiële Smad fosforylering in de richting van carcinogenese bij maagkanker te onderzoeken, onderzochten we P-Smad2 /3C en P-Smad2 /3L niveaus in 130 patiënten met adenocarcinoom van de maag door immunohistochemie (IHC). We analyseerden mogelijke correlaties tussen verschillende plaatsen van fosforylatie van R-Smads en invasie, lymfekliermetastase, differentiatie, en het stadium van maagkanker.

Resultaten

Linker fosforylering van Smad2 /3 is niet geassocieerd met maagkanker

In tegenstelling tot de eerdere bevindingen van colorectale kanker en HCC [7], [8], [21], [22], hebben we niet detecteren significante P-Smad2L en /of P-Smad3L positief kleuren met gastrische weefsels van patiënten met maagkanker. Slechts 18 van de 130 patiënten vertoonden p-Smad3L positieve kleuring vooral in niet-kankercellen. Deze resultaten suggereren dat linker fosforylering van serine plaatsen Smad2 /3 is niet kritisch bij maagkanker.

Verschillende kenmerken van P-Smad2C en P-Smad3C niveaus bij maagkanker

118 uit 130 maag weefsels toonde P-Smad2C positieve kleuring, en 91 van de 130 de maag weefsels waren positief voor P-Smad3C kleuring respectievelijk. Onderscheiden van P-Smad2C positieve kleuring, die alleen is weergeven in de kern van normale en kankercellen (Fig. 1A), P-Smad3C positieve kleuring werd aangetoond in de kern (59/130, fig. 1B), het membraan en /of in het cytoplasma (73/130, fig. 1C) van maagkanker cellen. Daarnaast werd P-Smad3C gezien door positieve kleuring in fibroblasten rond kankercellen (81/130 en 91/130, fig. 1D).

Minder P-Smad2C opmerkelijk correleert met tumor diepte (T) en differentiatie kanker (G) bij patiënten met maagkanker

Wij maten P-Smad2C IHC kleuring niet alleen in de tumor maar ook in omringende niet-tumorweefsels van 130 patiënten met maagkanker. P-Smad2C positieve kleuring in zowel kanker of normale cellen omgekeerd gecorreleerd met differentiatie van maagkanker (beide p
< 0,0001, Tabel 1). Daarnaast, verminderde P-Smad2C IHC score in kankercellen gecorreleerd met tumor diepte ( p Restaurant < 0,05, tabel 1). P-Smad2C niveaus in normaal weefsel en wezen op de mogelijkheid inverse correlatie met kankerinvasie bij deze patiënten ( p
= 0,07, tabel 1). De P-Smad2C IHC score was significant verminderd bij kanker weefsels in vergelijking met niet-tumor weefsel in 77 van de 130 patiënten met maagkanker. Bovendien, in de tumor weefsels, kankercellen met slecht atypie vertoonden verlaagde P-Smad2C kleuring, vergeleken met goed gedifferentieerd plaatsen (Fig. 2). Kendall-tau correlatie analyse onthulde een mogelijke correlatie tussen reductie van P-Smad2C kleuring en de overgang van normale kankercellen bij maagkanker ( p
= 0,05, tabel 2), hetgeen suggereert dat activatie van Smad2 signalering is een kritieke onderdrukker van tumorvorming en de progressie.

P-Smad3C wordt vaak gevonden bij kanker geassocieerd fibroblasten

P-Smad3C IHC score had geen significante correlatie met T /N /G /S van tonen maagkanker monsters (Tabel 1). Echter, P-Smad3C positieve kleuring kwamen vaak in fibroblasten rond kankercellen bij patiënten met maagkanker (fig. 1).

Kankercellen zijn van epitheliale oorsprong hebben mesenchymale markers niet tot expressie, b.v. a-SMA en collageen I. Als kankercellen tot expressie mesenchymale markers, is suggestief van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) [11]. In deze studie hebben we α-SMA positieve kleuring in kankercellen in 54 van 130 patiënten met maagcarcinoom (bijvoorbeeld patiënt-1 in fig. 3). Om het mogelijke verband tussen de p-Smad3C en EMT verduidelijken, onderzochten we de correlatie tussen de p-Smad3C kleuring (kanker en de omliggende niet-kanker weefsel) en α-SMA positieve kleuring in kankercellen. Kendall-tau rank correlatiecoëfficiënten tussen de p-Smad3C IHC scores bij kanker /omringende niet-kankerweefsel en α-SMA IHC scores bij kanker zijn 0,14 ( p
= 0,08) en -0,09 ( p
= 0,99), respectievelijk (Tabel 3). EMT te bevestigen deze patiënten, voerden wij co-kleuring voor slak, een specifieke marker voor EMT en collageen I /α-SMA gastrische weefsels. Confocale microscopie toonde co-lokalisatie van slak en collageen I (Figuur 4A.) /Α-SMA (Fig. 4B) in sommige maagkanker cellen. Deze α-SMA positieve cellen maagkanker en weergegeven P-Smad3C positieve kleuring (Fig. 4C). Naast co-lokalisatie met α-SMA positieve cellen maagkanker, confocale microscopie aangetoond dat P-Smad3C co-gelokaliseerd met collageen I bij maagkanker cellen (Fig. 4D). Verder P-Smad3C positieve kleuring co-gelokaliseerd met α-SMA en collageen I niet alleen in kankercellen, maar ook fibroblasten (Fig. 4C-4D). Deze resultaten suggereren dat P-Smad3C kan bijdragen tot EMT maagkanker bij sommige patiënten.

Verlies totale Smad2 en Smad3 expressie bij patiënten met maagkanker

Naast het meten P-Smad2 bij maagkanker gebruikten we real-time PCR om mRNA expressie van Smad2 en Smad3 detecteren bij maagkanker en omringende niet-tumorweefsels uit 16 patiënten. 15 en 12 patiënten toonden respectievelijk verminderde mRNA expressie van Smad2 en Smad3 bij kanker weefsel, vergeleken met omringende normale weefsels (fig. 5). Deze resultaten geven aan dat niet alleen geactiveerd Smad2 maar ook de mRNA expressie van totale Smad2 wordt verminderd tijdens maagkanker.

Discussie

In colorectaal adenocarcinoom en HCC, een verschuiving in fosforylering van carboxy-terminus linkergebieden is voorgesteld als een kritieke gebeurtenis geassocieerd met de schakelaar van TGF-β aan een kanker suppressor een oncogene factor [8], [18], [19], [20], [21], [22]. In het onderhavige onderzoek onderzochten we de mogelijke associatie bij maagkanker. We hadden geen significante P-Smad2L en P-Smad3L levels te sporen in 130 patiënten met maagkanker. 112 van de 130 patiënten bleek niet P-Smad2L of P-Smad3L kleuring bij maagkanker cellen, wat suggereert dat de voorgestelde verschuiving fosforylering van R-Smad niet kunnen helpen TGF-β gemedieerde carcinogenese bij deze vorm van kanker. In tegenstelling tot P-Smad2 /3L, zowel P-Smad2C en P-Smad3C positieve kleuring werd waargenomen bij de meeste patiënten met maagkanker. Kendall-tau rangcorrelatie analyse toonde aan dat P-Smad2C IHC score omgekeerd correleert met de diepte van de tumor (T) en differentiatie van kanker (G).

De rol van Smad2 tijdens de vorming en de progressie van verschillende soorten kanker blijft controversieel . In overeenstemming met de huidige bevindingen, eerdere studies op oesofageale plaveiselcelcarcinoom, borstkanker en darmkanker blijkt dat het verlies van Smad2 expressie is gecorreleerd met de ontwikkeling van tumoren en een slechte prognose [23], [24], [25], [26]. Onlangs, Hoot en collega's vinden dat Smad2, maar niet Smad3, werd vaak verloren in 83 patiënten met de huid plaveiselcelcarcinoom. Verder muizen met keratinocyt-specifieke Smad2 deletie weergegeven versnelde vorming en maligne progressie van chemisch geïnduceerde huidtumoren muis tegen wildtype muizen [27]. In een studie van 52 patiënten met een glioom, werd een positieve P-Smad2 IHC score gemeld correleren met proliferatie van gliomen en slechte prognose [28]. Voor de onderhavige studie, Shinto en collega gemeten P-Smad2C kleuring in 135 patiënten met maagkanker. Zij vonden dat de P-Smad2C niveaus waren hoger in slecht gedifferentieerde kanker vergelijking met goed gedifferentieerde degenen [29]. Het is niet duidelijk waarom er volstrekt tegenstrijdige resultaten bij maagkanker.

In canonieke TGF-β signalering, geactiveerde TGF-βRI induceert gewoonlijk carboxy-terminale fosforylering van zowel Smad2 en Smad3. Geactiveerde Smad2 en Smad3 verschillende rollen spelen in celgroei, differentiatie en andere biologische functies [30]. In de lever, Smad2 is van cruciaal belang bij de bemiddeling groei hepatocyte en differentiatie, terwijl Smad3 een belangrijk effect in de morfologische en functionele rijping van leverstellaatcellen [31], [32] speelt. Bij kanker is controversieel of verstoring van de Smad3 gen bijdraagt ​​aan het ontstaan ​​van tumoren. Zhu gemeld dat Smad3-deficiënte muizen ontwikkelen coloncarcinoom [33]. Echter, andere studies met Smad3-deficiënte muizen suggereerde dat het verlies van Smad3 alleen niet voldoende om het ontstaan ​​van tumoren [34] inleiding [35], [36], [37]. In maagkanker, Han gevonden lage niveaus van Smad3 in 3 van de 8 patiënten en in negen menselijke maagkanker cellijnen [38]. Invoering van een Smad3 vector in de maag cellijnen hersteld TGF-β responsiviteit. Verder injectie van Smad3 expressie maag-cellen in naakt muizen vertoonden vertraagde het ontstaan ​​van tumoren in vergelijking met de controlegroep, wat wijst op een correlatie van verlies van Smad3 met carcinogenese [38]. In de huidige studie, hebben we geen significante correlatie tussen P-Smad3C kleuring in maagkanker cellen en kanker invasie, differentiatie en het podium te vinden. Onderscheiden van P-Smad2C, die pas in kernen van cellen tot expressie wordt gebracht, P-Smad3C positieve kleuring detecteerbaar in de kern, het membraan en in het cytoplasma van maagkanker cellen. De biologische relevantie van verschillende patronen van P-Smad3C kleuring in kankercellen is momenteel nog onbekend.

EMT van kankercellen is een voorwaarde voor ontwikkelen tot gemetastaseerde tumoren [11]. Het is bekend dat TGF-β is een belangrijke speler in de EMT. Smad3, maar niet Smad2, is een belangrijke mediator in TGF-β afhankelijk EMT [39]. Bijvoorbeeld, TGF-β nalaat EMT in primaire tubulaire epitheelcellen afkomstig van nieren van Smad3-deficiënte muizen [40] induceren. Remming van TGF-β signalering door Ki26894, een TGF-βRI remmer invasie en verminderde EMT van scirrhous maagkanker in vitro
[41]. Onze resultaten tonen aan dat deel van maagkanker cellen tot expressie EMT markers, b.v. Slak, collageen I en α-SMA. Co-lokalisatie van P-Smad3C met α-SMA /collageen I blijkt een wezenlijk deel van de patiënten. Bovendien, α-SMA positieve kleuring in kankercellen heeft een potentieel correlatie met P-Smad3C IHC score van kankercellen, maar niet rond non-kanker weefsel. Deze resultaten geven aan dat P-Smad3C een rol in EMT van maagkanker kunnen spelen.

In het kort, de huidige studie suggereert dat Smad2 is een belangrijke bemiddelaar om de maag cellen te verdedigen tegen vorderingen bij slecht gedifferentieerde kanker. Volgens onze resultaten, is Smad3 niet direct gekoppeld aan kenmerken van maagkanker, maar onze gegevens blijkt dat het een rol bij kanker geassocieerd fibroblasten en EMT van maagkanker cellen kunnen spelen.

Methods

patiënten

Chirurgische monsters werden onderzocht van patiënten met primaire maagkanker bij de afdeling Algemene Heelkunde, de First Affiliated Hospital, Medical School, Zhejiang University, China van 2003 tot 2009. maag weefselmonster werd opgevangen bij de operaties ontleed de Maagkanker. De verzamelde weefsels die de tumor omringen en niet-tumorzones (weefsels in ieder geval meer dan 5 cm ver van de tumor). Een deel van de weefsels werden gefixeerd met 4% in formaldehyde en ingebed in paraffine voor histologie en IHC meting. Bleef verse weefsels werden in vloeibare stikstof onmiddellijk naar mRNA de meting te zetten. Een totaal van 130 gepaarde maag weefsels, met inbegrip van kanker en de omliggende niet-tumorweefsels werden ingeschreven. Pathologische diagnostiek en classificaties werden geschat op basis van de tumor-node-metastase (TNM) indeling bepleit door de Internationale Unie tegen Kanker (zevende editie) [42]. Basiskenmerken van de ingeschreven patiënten zijn weergegeven in Tabel 4. Het studieprotocol overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki (1975). De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Eerste Affiliated Hospital, Medical School, Zhejiang University. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle bij de deelnemers aan de studie.

Antilichamen

Rabbit polyklonale antilichamen tegen P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255) en P-Smad3L (ser 208/213) werden in eerdere studies [43], [44]. Mouse anti-humaan α-SMA (M0851), polyklonale anti-SLAK (ab-17732), en monoklonale anti-collageen I (C2456) antilichamen werden gekocht bij respectievelijk DAKO, Abcam en Sigma.

Immunohistochemie (IHC )

Na het bekijken van de H & E-gekleurde dia's uit 130 ingeschreven patiënten met maagkanker, vertegenwoordiger paraffineblokken voor elke patiënt werden geselecteerd voor sectie. De plaatjes werden deparaffinised in xyleen en gerehydrateerd in een verdunningsreeks van gesorteerde ethanol gedistilleerd water. Antigeenterugtrekking werd uitgevoerd door behandeling met microgolven in EDTA-buffer (1 mmol, pH 8,0). De objectglaasjes werden vervolgens behandeld met 3% H _{2O 2 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na wassen met PBS driemaal, werden de objectglaasjes geïncubeerd met konijn polyklonaal antilichaam tegen P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (1:50 ) en α-SMA (1:200) respectievelijk bij 4 ° C overnacht. De volgende dag, de objectglaasjes werden gewassen met PBS driemaal. Na wassen, werden ze geïncubeerd met EnVision peroxidase (Dako) gemerkt anti-konijn of anti-muis antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Peroxidase-activiteit werd gedetecteerd met diaminobenzidine (DAB). De objectglaasjes werden tegengekleurd met hematoxyline. Immunoreactiviteit werd gevisualiseerd onder een lichtmicroscoop}

Voor semi-kwantitatieve analyse werden de gekleurde coupes als volgt beoordeeld op een 4-puntsschaal: positieve cellen, rangen 0-3 (0, geen positieve cellen; 1 <.; 25% positieve cellen; 2, 25% -50% positieve cellen; 3, > 50% positieve cellen); intensiteit van de positieve kleuring, rangen 1-3 (1, zwak positieve kleuring, meestal geel; 2, een sterke positieve kleuring, meestal bruin, 3, zeer sterke positieve kleuring, meestal diep bruin tot zwart). De uiteindelijke immune kleuring score werd berekend als nummer × intensiteit.

Immunofluorescentiekleuring

De glaasjes werden deparaffinised in xyleen en gerehydrateerd in gegradeerde ethanol tot gedestilleerd water. Vervolgens werd antigeenterugtrekking uitgevoerd door behandeling met microgolven in EDTA-buffer (1 mmol, pH 8,0). De objectglaasjes werden vervolgens behandeld met 3% H _{2O 2 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na wassen met PBS, zowel primaire antilichamen, konijn anti-P-Smad3C /Slak en muis anti-α-SMA /collageen I, werden 's nachts aangebracht bij 4 ° C. Dan, secundaire antilichamen, Alexa633-konijn anti-muis immunoglobuline G en Alexa488-ezel anti-konijn immunoglobuline G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland), werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De monsters werden gemonteerd met behulp van Dako-Cytomation Fluorescent Mounting Medium. De objectglaasjes werden geïnspecteerd en foto's werden genomen op een confocale microscoop (Leica, Heidelberg). Secties zonder primaire antilichamen werden gebruikt als negatieve controles.}

Real time PCR

De totale RNA werd gezuiverd uit gastrische weefsels met de High Pure RNA isolatie kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant, en de concentratie werd spectrofotometrisch gemeten. cDNA werd gesynthetiseerd door 1 ug RNA met Transcriptor First Strand cDNA synthese kit (Roche Diagnostics). Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met een ABIPrism 7700 sequentie detectiesysteem (Applied Biosystems) met behulp van een TaqMan universele PCR Master Mix Geen AmpErase UNG (onderdeel nr. 4324018). De volgende genexpressie testen werden gebruikt: Smad2 (vooruit: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; omgekeerde: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (vooruit: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; omgekeerde: GAAGGCGAACTCACACAGC) en peptidylprolyl isomerase A (huishoud-gen; part no Mm02342429_g1..). Alle reagentia werden gekocht bij Applied Biosystems. Monsters werden in drievoud onder de volgende omstandigheden: initiële denaturatie gedurende 2 minuten bij 50 ° C en 10 minuten bij 95 ° C gevolgd door 40 cycli van 15 s bij 95 ° C en 1 minuut bij 60 ° C. De niveaus van genexpressie in elk monster werden bepaald met de vergelijkende cyclus drempel methode.

Statistische analyse

Om associatie tussen geselecteerde immunohistologische markers en tumor parameters te evalueren, Kendall-tau rank correlatie analyse werd uitgevoerd Met behulp van SAS versie 9,2 (Cary, NC, USA). Een p
. ≪ 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

• PLoS ONE: Klinische potentieel van DNA-methylatie bij maagkanker: A Meta-Analysis
• PLoS ONE: de ruimtelijke spreiding van Lgr5 + cellen correleert met maagkanker Progression