PLoS ONE: alentuneesta Aktiivinen Smad2 korreloi huonon ennusteen Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

Background

TGF-β on kaksijakoinen rooli etenemistä ihmisen syövän. Alkuvaiheessa syövän, TGF-β toimii tuumorisuppressorina. Myöhempien vaiheiden aikana kasvaimen kehitys on kuitenkin, TGF-β voi edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Siirtymä Smad2 /3 fosforylaation karboksiterminuksesta ja linkkeri sivustoja on keskeinen tapahtuma määritetään biologinen toiminta TGF-β peräsuolen ja maksasyövän. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme mahdollinen rooli ero Smad2 /3 fosforylaation mahalaukun adenokarsinooman.

Menetelmät

immunohistokemiallinen värjäys anti-P-Smad2 /3C ja P-Smad2 /3L vasta suoritettiin 130 parafinoidut mahalaukun adenokarsinoomaa yksilöitä. Suhde P-Smad2 /3C ja P-Smad2 /3L immunohistokemiallisella pisteet ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaista analysoitiin. Reaaliaikainen PCR käytettiin mittaamaan mRNA ilmaus Smad2 ja Smad3 syövän ja ympäröivän ei-kasvainkudoksessa.

Keskeiset havainnot

Ei merkittävää P-Smad2L ja /tai P-Smad3L positiivista värjäytymistä oli havaittu useimmissa yksilöt (positiivinen värjäytyminen 18/130 näytteistä). Positiivinen P-Smad2 /3L värjäystä ei liittynyt vähenemiseen karboksiterminaalinen fosforylaatioon värjäystä. Menetys P-Smad2C erittäin korreloivat syvyys kasvaimen infiltraatiota ja huono erilaistumista syöpäsolujen potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Mitään korrelaatiota oli havaittavissa välillä P-Smad3C ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia mahalaukun adenokarsinoomaa. Kuitenkin co-värjäys paljasti, että P-Smad3C yhteistyössä paikallistaa α-SMA ja kollageeni I mahasyövän soluissa, mikä viittaa mahdolliseen yhteyden P-Smad3C ja epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon syövän. Reaaliaikainen PCR osoitti alentunut mRNA ilmentymistä Smad2 mahasyövän verrattuna ympäröivien ei-kasvainkudoksessa 15/16 potilailla.

Johtopäätökset

Menetys P-Smad2C tiiviisti korreloi syövän invaasio ja huono erilaistumista mahasyövässä. Toisin kuin peräsuolen ja maksasyövän, kanoninen karboksiterminaalinen fosforylaation, mutta ei linkkeri fosforylaatiota, on Smad2 on kriittinen mahasyövän.

Citation: Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et ai. (2012) alentuneesta Aktiivinen Smad2 korreloi huonon ennusteen mahasyövän. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 06 lokakuu 2011; Hyväksytty: 20 maaliskuu 2012; Julkaistu 23. huhtikuuta 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Health Bureau Zhejiangin maakunnassa Kiinassa, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "Virtual maksan" ja "soluterapian" 01GN0987 (S.D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S.D.) ja LA997 /5-1 (S.D.); ja Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S.D.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on johtava syy syövän liittyvän kuoleman maailmassa, sijoitus toinen miehillä ja neljänneksi naisilla taajuus [1]. Patogeneesi mahalaukun syövän liittyy useita tekijöitä. Näistä häiriöstä signalointipolkujen liittyvien kehitysprosesseja, kuten transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β), Wnt /β-kateniinin, siili ja Notch signalointi, on keskeinen rooli kehittymistä ja etenemistä tämä syöpä [2].

TGF-β perheen molekyylejä, mukaan lukien TGF-β-isoformit, aktiviinit ja luun morfogeneettisen proteiinien (BMP: t), on tärkeitä tehtäviä erilaisia ​​fysiologisia ja patofysiologisia prosesseja, esimerkiksi alkionkehityksen, autoimmuunisairauksien, fibroosi ja syövän [3], [4]. TGF-β transdusoi signaalit stimuloimalla muodostuu komplekseja TGF-β tyypin I (TGF-βRI) ja tyypin II (TGF-pRII) seriini /treoniini-kinaasi-reseptoreihin. Aktivoitu TGF- βRI etenee, signalointia rekrytointi ja fosforylaatio reseptori-säänneltyjen-Smad: ien (R-Smad: ien, mukaan lukien Smad2 ja Smad3). Fosforylaatio C-terminaalista seriinitähteiksi R-Smad: ien on ratkaiseva askel kanoninen TGF-β signalointi. Kaksi eniten C-terminaalista seriinitähteiksi seriinin 465/467 vuonna Smad2 ja seriinin 423/425 in Smad3 fosforyloidaan yhdessä kolmannen ei-fosforyloitua seriinitähde muodostavat evolutionistisesti konservoitunutta SSXS motiivin kaikissa R-Smad: ien [5], [6]. Lisäksi C-terminaalinen fosforylaation Smad2 /3 (P-Smad2C ja P-Smad3C) TGF-βRI, muiden kinaasien, esim. c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) ja Ras-liittyviä kinaaseja, aiheuttaa fosforylaatio R-Smad: ien on linkkeri paikoissa ympäri seriini 249/254 in Smad2 ja seriinin 208/213 in Smad3 (P-Smad2L ja P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforyloitua R-Smad: ien muodostaa kompleksin yhteistä Smad (Co-Smad; Smad4 nisäkkäillä) ja kuljetus tumaan kohde-geenin transkriptio [3]. Lisäksi R-Smad ja co-Smad, kolmas tyyppi Smad proteiini on estäjä-Smad (I-Smad, Smad6 ja Smad7). I-Smad: ien ovat transkriptionaalisesti aiheuttama TGF-β, osoittaa negatiivista palautetta mekanismia signalointireitin [4].

TGF-β on kaksijakoinen rooli etenemistä ihmisen syövän [9], [10] . Alkuvaiheessa syöpä, TGF-β toimii tuumorisuppressorina estämällä solun proliferaation tai edistämällä solun apoptoosia. Kuitenkin loppuvaiheissa, TGF-β tukee syövän etenemiseen kuten kasvainsolun invaasiota, levittämistä ja immuunijärjestelmän veronkierron [9]. Lisäksi TGF-β on hyvin tunnustettu välittäjänä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) syövän [11]. Vaikka häiriöt TGF-β /Smad signalointi on keskeinen syövän syntymistä useimmissa elimissä, sen kasvain edistämällä tulos on erittäin kontekstisidonnaisia. Esimerkiksi TGF-β signalointi on keskeinen ylläpito syövän kantasoluja itseuudistumiseen ja tuumorigeenisia aktiivisuus gliooman ja leukemia, kun taas vaikutukset TGF-β signalointi rintasyövän kantasolujen ovat kiistanalaisia ​​[12]. Eräs tutkimus osoitti, että esto TGF-β-reitin kautta vallitsevaa negatiivista TGF- pRII koko kasvaa rinnan kantasolujen ja edistää kasvaimen kehittymisen, mikä osoittaa tukahduttaminen rinta- syövän synnyn tämän sytokiinin [13]. Sen sijaan Mani ja työtovereiden totesi, että TGF-β-reitin meille kriittinen ylläpidossa rintasyövän kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia ja tuumorigeenisia toiminnan kautta indusoiva EMT [14].

mahasyövän, yhden nukleotidin polymorfismit ( SNP) TGF-β liittyvät alttiuteen vaihe I ja II vaiheen mahasyövän [15], [16]. Seerumin TGF-β ilmoitettiin merkittävästi korreloivan laskimoiden invaasio potilailla mahalaukun syövän [17]. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit TGF-β signalointi mahalaukun syövän etenemisessä ei vielä tunneta. Lisäksi on epäselvää, milloin ja miten TGF-β muuttuu päässä tuumorisuppressori kasvaimeen promoottorin aikana karsinogeneesissä.

Äskettäin muutos fosforylaation Smad2 /3 C-terminaalista linkkeri sijoituspaikoista osoitettava keskeinen tapahtuma määritetään biologinen funktio TGF-β syövän [18], [19], [20]. Aiemmat tutkimukset perustuvat 12 vuoden seurannassa osoitti, että krooninen HBV /HCV potilailla, joilla on P-Smad2 /3L maksan kudoksissa oli suurempi riski etenee maksasolusyövän (HCC) kuin ne, joilla on P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Yhdenmukainen havaintojen HCC samanlaisia ​​havaintoja tehtiin peräsuolen syöpä [7], [22].

tarkastella panos ero Smad fosforylaation kohti syövän syntymistä mahasyövän, tutkimme P-Smad2 /3C ja P-Smad2 /3L tasot 130 mahalaukun adenokarsinoomaa sairastavien potilaiden immunohistokemiallisesti (IHC). Analysoimme mahdollisia korrelaatioita eri sivustoja fosforylaation R-Smad: ien ja invaasio, imusolmuke etäpesäke, erilaistumista ja vaihe mahasyövän.

Tulokset

Linker fosforylaatiota Smad2 /3 ei liity mahalaukun syöpä

Aikaisemmista havaintoja peräsuolen syöpä ja HCC [7], [8], [21], [22], emme havaitse merkittävää P-Smad2L ja /tai P-Smad3L positiivinen värjäämällä mahalaukun kudoksissa potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. 18 yhteensä 130 potilaalla osoittivat p-Smad3L positiivista värjäytymistä pääosin ei-syöpäsoluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että linkkeri fosforylaatio seriinillä kohtiin Smad2 /3 ei ole kriittinen mahasyövässä.

Eri ominaisuudet P-Smad2C ja P-Smad3C tasot mahasyövässä

118 ulos 130 mahalaukun kudosten osoitti P-Smad2C positiivista värjäytymistä, ja 91 ulos 130 mahalaukun kudosten olivat positiivisia P-Smad3C värjäys vastaavasti. Eroaa P-Smad2C positiivista värjäytymistä, joka näyttää vain tumassa normaalien ja syöpäsolujen (Fig. 1A), P-Smad3C positiivista värjäytymistä osoitettiin tumassa (59/130, Fig. 1B), on kalvon ja /tai sytoplasmassa (73/130, Fig. 1 C) mahalaukun syöpäsoluja. Lisäksi P-Smad3C nähtiin positiivista värjäytymistä fibroblasteissa ympäröivän syöpäsolujen (81/130 ja 91/130, Fig. 1 D).

alennetulla P-Smad2C huomattavasti korreloi kasvaimen syvyys (T) ja erilaistumista syöpä (G) potilailla, joilla on mahalaukun syövän

mitataan P-Smad2C IHC värjäystä paitsi kasvain, mutta myös ympäröivä kuin tuumorikudoksista 130 potilaalla on mahasyöpä. P-Smad2C positiivista värjäytymistä joko syövän tai normaaleihin soluihin korreloi käänteisesti erilaistumista mahasyövän (molemmat p
< 0,0001, taulukko 1). Lisäksi vähentynyt P-Smad2C IHC pisteet syöpäsoluissa korreloivat kasvaimen syvyys ( p
< 0,05, taulukko 1). P-Smad2C tasoilla normaalissa kudosten sekä osoitti mahdollisena käänteinen korrelaatio syövän invaasio näillä potilailla ( p
= 0,07, taulukko 1). P-Smad2C IHC pisteet väheni huomattavasti syövän kudoksissa verrattuna ei-kasvain kudosten 77 ulos 130 potilaalla mahalaukun syöpä. Lisäksi sisällä kasvain kudosten, syöpäsolut huonosti atypia osoitti vähentynyt P-Smad2C värjäys, verrattuna hyvin erilaistuneet (Fig. 2). Kendall-tau korrelaatio analyysi paljasti mahdollisen korrelaation vähentämiseksi P-Smad2C värjäys ja siirtyminen normaalista syöpäsoluja mahasyövän ( p
= 0,05, taulukko 2), mikä viittaa siihen, että aktivaatio Smad2 signalointi on kriittinen vaimennin kasvaimen muodostumisen ja etenemisen.

P-Smad3C löydetään usein syöpään liittyvän fibroblasteissa

P-Smad3C IHC pisteet eivät osoittaneet merkittävää korrelaatiota T /N /G /S mahasyöpä näytteitä (taulukko 1). Kuitenkin P-Smad3C positiivista värjäytymistä esiintyi usein fibroblasteissa ympäröivän syöpäsolujen potilailla, joilla on mahalaukun syöpä (Fig. 1).

Syöpäsolut ovat epiteelin alkuperää ja eivät ilmaise mesenkymaaliset markkereita, esim. a-SMA ja kollageenin I. Jos syöpäsolut ilmentävät mesenkymaaliset merkkiaineita, on viittaavia epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [11]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme huomanneet, α-SMA positiivista värjäytymistä syöpäsoluissa on 54 130 potilaalla, joilla mahalaukun syövän (esim. Potilas-1 Fig. 3). Selventää välinen mahdollinen yhteys p-Smad3C ja EMT, tutkimme korrelaatio p-Smad3C värjäytymistä (syöpä ja ympäröivän ei-syöpä kudosta) ja α-SMA positiivista värjäytymistä syöpäsoluissa. Kendall-tau rank korrelaatiokertoimet välillä p-Smad3C IHC tulokset syövän ja /tai ympäristön ei-syöpä kudosta ja α-SMA IHC tulokset syövän ovat 0,14 ( p
= 0,08) ja -0,09 ( p
= 0,99) (taulukko 3). Vahvista EMT näillä potilailla, suoritimme co-värjäystä varten SNAIL, toinen erityinen merkkiaine EMT, ja kollageeni I /α-SMA mahalaukun kudoksissa. Konfokaalimikroskopia paljasti kolokalisaation SNAIL ja kollageeni I (Fig. 4A) /α-SMA (Fig. 4B) joissakin mahalaukun syöpäsoluja. Nämä α-SMA positiivinen mahalaukun syöpäsoluja samoin näkyy P-Smad3C positiivista värjäytymistä (Fig. 4C). Lisäksi kolokalisaation kanssa α-SMA positiivinen mahalaukun syöpäsoluja, konfokaalimikroskopia paljasti, että P-Smad3C yhteistyössä paikallistaa kollageeni I mahasyövän soluissa (Kuva. 4D). Edelleen, P-Smad3C positiivista värjäytymistä yhdessä paikallistaa α-SMA ja kollageeni I ei vain syöpäsoluissa, mutta myös fibroblasteissa (Fig. 4C-4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että P-Smad3C voi myötävaikuttaa EMT mahasyövän joillakin potilailla.

Menetys yhteensä Smad2 ja Smad3 ilmentymistä potilailla mahalaukun syövän

lisäksi mittaamalla P-Smad2 mahasyövän käytimme real-time PCR havaita mRNA: n ilmentymisen Smad2 ja Smad3 mahasyövän ja ympäröivän ei-tuumorikudoksissa 16 potilasta. 15 ja 12: lla potilaista osoitti, väheni mRNA: n ilmentymisen ja Smad2 ja Smad3 syöpäkudoksiin verrattuna ympäröivien normaaleissa kudoksissa (Fig. 5). Nämä tulokset osoittavat, että ei ainoastaan ​​aktivoida Smad2 myös mRNA: n ekspressiota yhteensä Smad2 vähenee aikana mahasyövän.

Keskustelu

peräsuolen adenokarsinooma ja HCC, muutos fosforylaatio karboksi-terminuksesta kytkytfragmenttialueet on ehdotettu kriittinen tapahtuma liittyy kytkimen TGF-β syöpään vaimennin on onkogeeninen tekijä [8], [18], [19], [20], [21], [22]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme tätä potentiaalia yhdistys mahasyövän. Emme havainneet merkittävää P-Smad2L ja P-Smad3L tasolle 130 potilaalla, joilla mahalaukun syövän. 112 ulos 130 potilaista ei näytä P-Smad2L tai P-Smad3L värjäytyminen mahasyövässä soluissa, mikä viittaa siihen, että ehdotettu muutos fosforylaation R-Smad eivät lisäisi TGF-β välittämää syövän syntymistä tämä syöpä. Toisin kuin P-Smad2 /3L, sekä P-Smad2C ja P-Smad3C positiivista värjäytymistä havaittiin useimmilla potilailla mahalaukun syöpä. Kendall-tau listalla korrelaatio analyysi paljasti, että P-Smad2C IHC pisteet kääntäen korreloi syvyys kasvain (T) ja erilaistumista syövän (G).

rooli Smad2 aikana muodostumisen ja etenemisen eri syöpätyypin edelleen kiistanalainen . Yhdenmukainen nykyisen havainnon, aiemmat tutkimukset ruokatorven okasolusyöpä, rintasyöpä ja peräsuolen syövän osoitti, että menetys Smad2 ilmentyminen korreloi kasvaimen kehitystä ja huonon ennusteen [23], [24], [25], [26]. Äskettäin Hoot ja työtovereiden totesi, että Smad2, mutta ei Smad3, oli usein menetettiin 83 potilaalla iholle okasolusyöpä. Edelleen, hiiriä keratinosyyttispesifisestä Smad2 poisto näyttöön nopeutetun muodostumista ja pahanlaatuisten etenemistä kemiallisesti indusoidun hiiren ihon kasvaimissa verrattuna villin tyypin hiirillä [27]. Kuitenkin tutkimuksessa 52 potilasta, joilla gliooma, positiivinen P-Smad2 IHC pisteet ilmoitettiin korreloivan leviämisen gliooma ja huonon ennusteen [28]. Ennen tässä tutkimuksessa, Šintolaisuus ja kollegat mitataan P-Smad2C värjäytymisen 135 potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. He havaitsivat, että P-Smad2C tasot olivat korkeampia huonosti erilaistunut syöpä verrattuna hyvin erilaistunut niitä [29]. Ei ole vielä selvää, miksi on olemassa täysin vastakkaisia ​​tuloksia mahasyövässä.

kanoninen TGF-β signalointi, aktivoitu TGF-βRI tavallisesti indusoi karboksiterminaalinen fosforylaatioon Sekä Smad2 ja Smad3. Aktivoitu Smad2 ja Smad3 pelata erilaisia ​​rooleja solujen kasvua, erilaistumista ja muita biologisia toimintoja [30]. Maksassa, Smad2 on kriittinen välittämisessä maksasolujen kasvua ja erilaistumista, kun taas Smad3 on keskeinen vaikutus morfologiset ja toiminnalliset kypsymisen maksan tähtisolut [31], [32]. Syövän on kiistelty siitä häiriöitä Smad3 geenin edesauttaa kasvaimien syntyyn. Zhu kertoi, että Smad3-hiirillä kehittää paksusuolen syöpä [33]. Kuitenkin, muut tutkimukset, joissa käytettiin Smad3-hiirillä ehdotti, että menetys Smad3 ei yksin riitä aloittamaan kasvaimien syntyyn [34], [35], [36], [37]. Mahasyövän, Han löydetty alhainen Smad3 3 ulos 8 potilasta ja yhdeksän ihmisen mahasyövän solulinjoissa [38]. Otetaan käyttöön Smad3 vektorin mahan solulinjoihin kunnostettu TGF-β reagointikykyä. Edelleen, injektio Smad3 ilmentävien mahalaukun soluja nude hiiret osoittivat viivästynyt kasvaimen kehittymisen verrattuna kontrolleihin, osoittaen korrelaatio menetyksen Smad3 kanssa syövän synnyn [38]. Tässä tutkimuksessa, emme löytäneet merkittävää korrelaatiota P-Smad3C värjäytyminen mahasyövän soluissa ja syövän invaasio, erilaistumista ja vaihe. Eroaa P-Smad2C, joka ilmentyy vain ytimet solujen, P-Smad3C positiivista värjäytymistä on havaittavissa ydin, on kalvo ja sytoplasmassa mahalaukun syöpäsoluja. Tulosten biologista merkitystä eri mallien P-Smad3C värjäystä syöpäsoluissa on tällä hetkellä vielä tiedetä.

EMT syöpäsolujen on edellytys etenee pitkälle etäpesäkkeitä [11]. On tunnustettu, että TGF-β on merkittävä toimija EMT. Smad3, mutta ei Smad2, on keskeinen välittäjäaine TGF-β riippuvainen EMT [39]. Esimerkiksi TGF-β ei indusoida EMT primaarisissa putkimaisen epiteelisoluissa, jotka ovat peräisin munuaisista Smad3-hiirissä [40]. Inhibitio TGF-β opastinjärjestelmillä Ki26894, TGF-βRI estäjä, laski invaasion ja EMT scirrhous mahasyövän in vitro
[41]. Tuloksemme osoittavat, että osa mahasyöpä ekspressoivat EMT markkereita, esim. Etana, kollageeni I ja α-SMA. Kolokalisaation P-Smad3C kanssa α-SMA /kollageeni I: llä saadaan merkittävällä potilasryhmässä. Lisäksi, α-SMA positiivista värjäytymistä syöpäsoluissa on mahdollinen korrelaatio P-Smad3C IHC pisteet syöpäsoluja, mutta ei ympäröivään ei-syöpä kudoksiin. Nämä tulokset osoittavat, että P-Smad3C saattaa olla merkitystä EMT mahasyövän.

Yhteenvetona, esillä oleva tutkimus osoittaa, että Smad2 on tärkeä välittäjä puolustaa mahan soluja etenee kohti huonosti eriytetty syöpää. Saamiemme tulosten, Smad3 ei ole suoraan suhteessa ominaisuuksiin mahasyöpä kuitenkin tuloksemme osoittivat, että se voi olla rooli syövän liittyvät fibroblasteissa ja EMT mahalaukun syöpäsoluja.

Methods

potilaat

Kirurginen näytteet tutkittiin potilailta, joilla ensisijainen mahasyövän laitoksella General Surgery, ensimmäinen Affiliated sairaala, Medical School, Zhejiangin yliopisto, Kiina vuodesta 2003 vuoteen 2009. mahalaukun kudosnäyte kannettiin leikkauksia leikellään mahalaukun syöpä. Kerätyt kudokset sisältyvät kasvain- ja ympäröivän ei-kasvain-alueilla (kudosten ainakin yli 5 cm kaukana kasvain). Osa fiksoitiin 4% formaldehydiä ja upotettiin parafiiniin histologiaa ja IHC mittaus. Pysyi tuoreet kudokset pantiin nestetyppeen välittömästi mRNA mittaukseen. Yhteensä 130 pariksi mahalaukun kudoksissa, mukaan lukien syöpä ja ympäröivän ei-tuumorikudoksissa otettiin. Patologinen diagnoosi ja luokitukset arvioitiin mukaisen kasvaimeen solmu-etäpesäke (TNM) luokitus ajama International Union syöpää vastaan ​​(seitsemäs painos) [42]. Perusominaisuudet otetuista potilaista on esitetty taulukossa 4. tutkimusprotokolla sopeutui eettiset ohjeet julistuksen Helsingin (1975). Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea ensimmäisen Affiliated sairaala, Medical School, Zhejiangin yliopistossa. Kirjallinen suostumukset on saatu kaikkien osallistujien mukana tutkimuksessa.

Vasta

Kanin polyklonaaliset vasta-aineita P-Smad2C (ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (ser 250/255), ja P-Smad3L (ser 208/213) kuvattiin aiemmissa tutkimuksissa [43], [44]. Hiiren anti-ihmisen α-SMA (M0851), polyklonaalinen anti-SNAIL (ab-17732), ja monoklonaalinen anti-kollageeni I (C2456) vasta-aineet hankittiin DAKO, Abcam ja Sigma vastaavasti.

Immunohistokemia (IHC ) B

Tutkittuaan H &E-värjättyjen diat 130 otettiin potilaita, joilla mahalaukun syövän, edustava parafiiniblokit kullekin potilaalle valittiin osassa. Levyjä deparaffinised ksyleeniin ja niihin lisätään laimennussarjaan porrastettu etanolia tislattua vettä. Antigeeni haku suoritettiin mikroaalloilla käsittely EDTA-puskuriin (1 mmol, pH 8,0). Levyjä käsiteltiin sitten 3% H _{2O 2 30 min ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty PBS: llä kolme kertaa, levyt inkuboitiin kanin polyklonaalinen vasta-aine P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (01:50 ), ja α-SMA (1:200), vastaavasti 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä, levyt pestiin PBS: llä kolme kertaa. Pesun jälkeen ne inkuboitiin EnVision peroksidaasin (Dako) -leimattua anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aineella 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Peroksidaasiaktiivisuuden havaittiin diaminobentsidiinillä (DAB). Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Immunoreaktiivisuus visualisoitiin valomikroskoopilla.}

semikvantitatiivinen analyysi, värjättyä kudosleikkeiden arvioitiin 4 pisteen asteikolla seuraavasti: positiivinen solumäärät, laadut 0-3 (0, ei positiivisten solujen, 1, < 25% positiivisia soluja, 2, 25% -50% positiivisia soluja, 3, > 50% positiivisia soluja); intensiteetti positiivista värjäytymistä, arvosanat 1-3 (1, heikko positiivinen värjäytyminen, yleensä keltainen, 2, vahva positiivinen värjäytyminen, yleensä ruskea, 3, erittäin vahva positiivinen värjäytyminen, yleensä syvän ruskea tai musta). Lopullinen immuuni värjäytyminen pisteet laskettiin määrä × intensiteettiä.

immunofluoresenssi

Levyt deparaffinised ksyleeniin ja niihin lisätään arvostellaan etanoli kunnes tislattua vettä. Sitten antigeeni haku suoritettiin mikroaalloilla käsittely EDTA-puskuriin (1 mmol, pH 8,0). Levyjä käsiteltiin sitten 3% H _{2O 2 30 min ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, sekä ensimmäisen vasta-aineita, kaniinin anti-P-Smad3C /Snail ja hiiren anti-α-SMA /kollageeni I, pantiin 4 ° C: ssa yön yli. Sitten, sekundäärisiä vasta-aineita, Alexa633-kanin anti-hiiri-immunoglobuliini G ja Alexa488-aasin anti-kani-immunoglobuliini G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Saksa), levitettiin 30 min huoneen lämpötilassa. Näytteet asennetaan käyttäen Dako-Cytomation Fluorescent Mounting Medium. Levyt tarkastettiin ja kuvat on otettu sijoitukset -konfokaalimikroskoopilla (Leica, Heidelberg). Osiot ilman ensisijainen vasta-aineita käytettiin negatiivisina kontrolleina.}

Reaaliaikainen PCR

Koko RNA puhdistettiin mahalaukun kudoksiin korkean Pure RNA eristyspakkausta (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa, ja pitoisuus mitattiin spektrofotometrisesti. cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA: ta kanssa Transcriptor First Strand cDNA-synteesi kit (Roche Diagnostics). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin kanssa ABIPrism 7700 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen TaqMan Universal PCR Master Mix Ei AmpErase UNG (osa no. 4324018). Seuraavat geenien ilmentymisen määrityksiä käytettiin: Smad2 (eteenpäin: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; käänteinen: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (eteenpäin: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; käänteinen: GAAGGCGAACTCACACAGC) ja peptidylprolyl isomeraasi A (taloudenhoito geeni; osa. No. Mm02342429_g1). Kaikki reagenssit hankittiin Applied Biosystems. Näytteet ajettiin kolmena kappaleena seuraavissa olosuhteissa: alkudenaturaatio 2 minuutin ajan 50 ° C: ssa ja 10 minuuttia 95 ° C: ssa, jota seuraa 40 sykliä 15 s 95 ° C: ssa ja 1 minuutti 60 ° C: ssa. Tasot geeniekspression kussakin näytteessä määritettiin vertailevan syklin kynnys menetelmä.

Tilastollinen analyysi

arvioimiseksi yhdistyksen välillä valittujen immunohistologisilla merkkejä ja kasvaimen parametrit, Kendall-tau listalla korrelaatio analyysi tehtiin käyttäen SAS versio 9.2 (Cary, NC, USA). p
< 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

• PLoS ONE: Clinical Mahdolliset DNA Metylointi mahasyövän: Meta-analyysi
• PLoS ONE: alueellisen jakautumisen LGR5 + solujen korreloi mahalaukun syövän etenemisessä