Ploche ONE: Znížená úroveň aktívnej Smad2 korelujú so zlou prognózou v žalúdočnej Cancer

abstraktné

Pozadie

TGF-β hrá dvojakú úlohu v progresii rakoviny u ľudí. V priebehu počiatočných štádiách karcinogenézy, TGF-beta funguje ako nádorový supresor. Počas neskorých štádiách vývoja nádoru, však, TGF-β môže podporovať rast nádorov a metastáz. Posun v Smad2 3 fosforylácie /z karboxylového konca, aby linker miest je kľúčovou udalosťou určujúci biologickú funkciu TGF-beta u kolorektálneho a hepatocelulárneho karcinómu. V tejto štúdii sme skúmali potenciálnu úlohu diferenciálnej Smad2 /3 fosforylácie v adenokarcinómom žalúdka.

Metodika

Imunohistochemické farbenie s anti-P-3C Smad2 /a /3L protilátok proti P-Smad2 bola vykonaná na 130 vzoriek adenokarcinóme žalúdka parafínových. bol analyzovaný vzťah medzi P-Smad2 /3C a P-Smad2 /3L imunohistochemické skóre a patologickým charakteristiky pacientov. Real time PCR bol použitý na meranie mRNA expresie Smad2 a Smad3 rakoviny a okolitých non-nádorové tkanivo.

hlavných zistení

Žiadny významný P-Smad2L a /alebo P-Smad3L pozitívne farbenie bolo zistená u väčšiny vzoriek (pozitívne farbenie v 18/130 vzoriek). Pozitívne P-Smad2 /3L farbenie nebolo spojené s poklesom karboxyterminální fosforylačných farbenie. Strata P-Smad2C pozoruhodne koreluje s hĺbkou nádorové infiltrácie a zlé diferenciáciu nádorových buniek u pacientov s rakovinou žalúdka. Žiadna korelácia bola detegovateľná medzi P-Smad3C a patologickým charakteristikám adenokarcinómom žalúdka. Avšak analýza čo-farbenie ukázalo, že P-Smad3C ko-lokalizovaný s a-SMA a kolagénu Aj v nádorových bunkách žalúdka, čo ukazuje na potenciálnu spojenie medzi P-Smad3C a epiteliálne-to-mezenchýme prechod rakoviny. Real time PCR preukázali zníženú expresiou mRNA Smad2 u karcinómu žalúdka v porovnaní s okolitými non-nádorové tkanivo v 15/16 pacientov.

Závery

Strata P-Smad2C úzke koreláciu s rakovinou inváziu chudobná diferenciácie karcinómu žalúdka. Na rozdiel od hrubého čreva a hepatocelulárneho karcinómu, kanonické karboxyterminální fosforylácie, ale nie linker fosforylácii, z Smad2 je rozhodujúci pre rakovinu žalúdka

Citácia :. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) Znížená úroveň aktívnej Smad2 korelujú so zlou prognózou rakoviny žalúdka. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684

Editor: Javier S. Castresana, University of Navarra, Španielsko |

prijatá: 06.10.2011; Prijaté: 20.marca 2012; Uverejnené: 23.apríla 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Štúdia bol podporený Health Bureau Zhejiang provincii Číny, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S. D.); BMBF "Hepatosys" 0313082L, "Virtuálna pečeň" a "Bunková terapia" 01GN0987 (S. D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S. D.) a LA997 /5-1 (S. D.); a Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S. D.). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Žalúdočné rakovina je najčastejšou príčinou úmrtia na nádorové ochorenie na svete, poradí druhý u mužov a žien na štvrtom mieste čo do početnosti [1]. Patogenéza karcinómu žalúdka je spojený s mnohými faktormi. Medzi nimi, porucha regulácie signálnych dráh v súvislosti s vývojových procesov, vrátane transformujúcej rastový faktor beta (TGF-p), Wnt /β-katenin, ježka a Notch signalizácie, hrá kľúčovú úlohu v rozvoji a progresii tejto rakoviny [2].

rodiny TGF-β molekúl, vrátane TGF-beta izoforiem, activins a kostnej morfogenetické proteíny (BMP), má dôležité funkcie v rôznych fyziologických a patofyziologických procesov, napr embryonálny vývoj, autoimunitné ochorenie, fibróza a rakovina [3], [4]. TGF-β transdukuje jeho signály tým, že stimuluje tvorbu heteromerních komplexov typu TGF-p I (TGF-βRI) a typ II (TGF-βRII) serín /treonín kinázy receptorov. Aktivovaný TGF-βRI šíri signalizácia prijímanie a fosforyláciou receptorom regulovaných-Smads (R Smads vrátane Smad2 a Smad3). Fosforylácie C-koncových serínových zvyškov v R-Smads je kľúčovým krokom pre kanonické TGF-beta signalizácie. Dva najviac C-terminálne serínové zvyšky v serínu 465/467 v Smad2 a serínu 423/425 v Smad3 sú fosforylované, spolu s treťou nefosforylovaným serínovej zvyšku, tvorí evolučne konzervatívny motív SSXS vo všetkých R-Smads [5], [6]. Okrem C-terminálny fosforylácie Smad2 /3 (P-Smad2C a P-Smad3C), TGF-βRI, iné kinázy, napr c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) a Ras-kinázy spojené, pretože fosforylácia R- Smads na spojovacích miestach okolo serínu 249/254 v Smad2 a serín 208/213 v Smad3 (P-Smad2L a P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforylovanej R-Smads tvorí komplex s spoločným Smäd (Co-Smäd; Smad4 u cicavcov) a kyvadlová doprava do jadra pre cieľové génovej transkripcie [3]. Vedľa R-Smäd a čo-Smäd, tretí typ Smäd proteínu je inhibítor-Smäd (I-Smäd; Smad6 a Smad7). I-Smads sú transkripčný indukovanej TGF-p, čo ukazuje na negatívnej spätnej mechanizmus tejto signálnej dráhy. [4]

TGF-β hrá dvojakú úlohu v progresii rakoviny u ľudí [9], [10] , V skorých štádiách rakoviny, TGF-beta pôsobí ako nádorový supresor inhibíciou bunkovej proliferácie, alebo propagáciu bunkovú apoptózu. Avšak, v neskorých štádiách, TGF-β podporuje progresiu nádoru, ako je invázia nádorových buniek, šírenie a imunitný únikom [9]. Okrem toho TGF-β je dobre známe ako mediátor epitelových-to-mesenchymálního prechodu (EMT) rakoviny [11]. Hoci perturbace TGF-β /Smäd signalizácia hrajú ústrednú úlohu v karcinogenéze vo väčšine orgánov, jej nádor propagáciu výsledok je vysoko závislé od kontextu. Napríklad TGF-β signalizácia je rozhodujúca v udržiavaní nádorových kmeňových buniek samoobnovy a onkogénne aktivity v glióm a leukémie, zatiaľ čo účinky TGF-beta signalizácie pri karcinóme prsníka kmeňové bunky sú sporné [12]. Jedna štúdia ukázala, že blokovanie TGF-p dráhu cez dominantné negatívne TGF-βRII zväčšuje veľkosť prsníka kmeňových buniek a podporuje tumorigenezi, čo ukazuje na potlačenie prsníka karcinogenéze tohto cytokínu [13]. Naproti tomu Mani a jeho kolegovia zistili, že TGF-p dráhu nás kritické pri udržiavaní rakoviny prsníka kmeňových buniek podobné vlastnosti a tumorigénny aktivita cez indukcii EMT. [14]

V prípade rakoviny žalúdka, single-nukleotidových polymorfizmov ( SNP) TGF-beta sú spojené s náchylnosťou ku fázou aj a fázou II rakoviny žalúdka [15], [16]. boli hlásené sérové ​​hladiny TGF-p významne koreluje s žilovej invázie u pacientov s karcinómom žalúdka [17]. Avšak, detailný mechanizmus TGF-beta signalizácie v progresii karcinómu žalúdka sú stále neznáme. Okrem toho zostáva nejasné, kedy a ako TGF-β transformuje z nádorový supresor do nádoru promótorom v priebehu rakoviny.

V poslednej dobe sa k posunu v fosforylácie Smad2 /3 od C-konca k väzobných miest bola demonštrovaná kľúčová udalosť určujúca biologickú funkciu TGF-beta karcinómu [18], [19], [20]. Predchádzajúce štúdie založenej na 12 rokoch sledovania preukázala, že chronické HBV /HCV pacientov s P-Smad2 /3L pečeňových tkanivách mali vyššie riziko postupujúci do hepatocelulárny karcinóm (HCC) ako pacienti s P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. V súlade so zisteniami v HCC, podobná pozorovaní bola vykonaná v kolorektálnym karcinómom [7], [22].

Ak chcete skúmať prínos diferenciálneho Smäd fosforylácie k karcinogenézy rakoviny žalúdka, sme skúmali P-Smad2 /3C a P-Smad2 /úrovne 3L v 130 pacientov s adenokarcinómom žalúdka imunohistochemicky (IHC). Analyzovali sme potenciálny korelácia medzi rôznymi miest fosforylácie R-Smads a invázie, lymfatických uzlín, diferenciácie a štádia rakoviny žalúdka.

Výsledky

Linker fosforylácie Smad2 /3 nie je spojené s rakovinou žalúdka

na rozdiel od predchádzajúcich nálezov z rakoviny hrubého čreva a HCC [7], [8], [21], [22], sme nezistili významný P-Smad2L a /alebo P-Smad3L pozitívne farbením v žalúdočnej tkanive od pacientov s karcinómom žalúdka. Iba 18 z 130 pacientov ukázali, p-Smad3L pozitívne farbenie najmä v non-rakovinových buniek. Tieto výsledky naznačujú, že linker fosforylácii serínových miestach Smad2 /3 nie je kritická pri karcinóme žalúdka.

Rôzne funkcie P-Smad2C a P-Smad3C úrovniach v rakoviny žalúdka

118 z 130 žalúdočné tkaniva ukázali, P-Smad2C pozitívne farbenie, a 91 z 130 žalúdočné tkaniva boli pozitívne na P-Smad3C farbenie, resp. Na rozdiel od P-Smad2C pozitívne farbenie, ktorý bol len zobrazovanie v jadre normálnych a nádorových buniek (Obr. 1A), P-Smad3C pozitívne farbenie bola preukázaná v jadre (59/130, obr. 1B), na membráne /alebo v cytoplazme (73/130, obr. 1C) z buniek karcinómu žalúdka. Okrem toho P-Smad3C bol videný pozitívny farbenie vo fibroblastoch okolitých rakovinové bunky (81/130 a 91/130, obr. 1D).

Znížené P-Smad2C pozoruhodne koreluje s hĺbkou nádoru (T) a diferenciácie rakoviny (G) u pacientov s rakovinou žalúdka

sme merali P-Smad2C IHC farbenie a to nielen v nádoru, ale aj v okolí nenádorových tkanív od 130 pacientov s karcinómom žalúdka. P-Smad2C pozitívne farbenie buď v rakovinových buniek alebo normálnych inverzne koreluje s diferenciáciou karcinómu žalúdka (obaja p Hotel &0,0001, tabuľka 1). Okrem toho, zníženie P-Smad2C IHC skóre v rakovinových bunkách koreluje s hĺbkou nádoru ( p
menšie ako 0,05, tabuľka 1). hladiny P-Smad2C v normálnej tkanive a tiež ukázalo potenciálne inverzný koreláciu s rakovinou invázie u týchto pacientov ( p
= 0,07, tabuľka 1). P-Smad2C IHC skóre sa významne znížila v rakovinových tkanivách v porovnaní s non-nádorového tkaniva v 77 zo 130 pacientov s rakovinou žalúdka. Okrem toho, v nádorovom tkanive, rakovinové bunky sa zle atypiu ukázali znížila P-Smad2C farbenie, v porovnaní s dobre diferencovaných ty (obr. 2). Kendall-tau korelačný analýza ukázala potenciálny korelácia medzi znížením P-Smad2C farbenie a pri prechode z normálnej do nádorových buniek karcinómu žalúdka ( p
= 0,05, tabuľka 2), čo naznačuje, že aktivácia Smad2 signalizácia je kritická supresor tvorby nádoru a progresie.

P-Smad3C sa často nachádza v rakovinových spojené fibroblastov

P-Smad3C IHC skóre nepreukázali významnú koreláciu s T /N /G /s, vzorky rakovina žalúdka (tabuľka 1). Avšak, P-Smad3C pozitívne farbenie často došlo vo fibroblastoch okolí rakovinových buniek u pacientov s rakovinou žalúdka (obr. 1).

Rakovinové bunky sú epiteliálneho pôvodu a neexprimujúcich mezenchymálnych markerov, napr. alfa-SMA a kolagénu I. Ak rakovinové bunky exprimujú mezenchymálnych markerov, to je pripomínajúce epitelové-to-mezenchymálnych prechodu (EMT) [11]. V tejto štúdii sme zistili, že α-SMA pozitívne farbenie v rakovinových bunkách v 54 zo 130 pacientok s karcinómom žalúdka (napr. Pacient-1 na obr. 3). Objasniť potenciálny spojenie medzi p-Smad3C a EMT, sme skúmali súvislosť medzi p-Smad3C farbenie (rakovina a okolité tkanivá bez rakoviny) a α-SMA pozitívnym farbením v rakovinových bunkách. Kendall-tau rank korelačné koeficienty medzi p-Smad3C IHC skóre pri karcinóme /okolité non-rakovina tkaniva a α-SMA IHC skóre u rakoviny sú 0,14 ( p
= 0,08) a -0,09 ( p
= 0,99), v danom poradí (tabuľka 3). K potvrdeniu EMT u týchto pacientov sme vykonali čo-farbenie pre slimák, iný špecifický marker pre EMT a kolagén I /α-SMA v žalúdočných tkanivách. Konfokálna mikroskopia ukázala, ko-lokalizácia šnek a kolagénu I (obr. 4A) /α-SMA (Obr. 4B) v niektorých žalúdočných nádorových buniek. Tieto α-SMA pozitívnym buniek karcinómu žalúdka taktiež zobrazená p-Smad3C pozitívne farbenie (obr. 4C). Okrem spoločnú lokalizáciu s α-SMA pozitívnym buniek karcinómu žalúdka, konfokálna mikroskopia bolo zistené, že P-Smad3C ko-lokalizovaný s kolagénom Aj z buniek karcinómu žalúdka (obr. 4D). Ďalej, P-Smad3C pozitívne farbenie ko-lokalizovaný s a-SMA a kolagén I, a to nielen v rakovinových bunkách, ale aj vo fibroblastoch (obr. 4C-4D). Tieto výsledky naznačujú, že P-Smad3C môže prispieť k EMT rakoviny žalúdka u niektorých pacientov.

Strata celkovej Smad2 a Smad3 expresie u pacientov s rakovinou žalúdka

Okrem merania P-Smad2 u karcinómu žalúdka sme použili real-time PCR pre detekciu mRNA expresie Smad2 a Smad3 v karcinómu žalúdka a okolité nenádorových tkanív od 16 pacientov. 15 a 12 pacientov, respektíve preukázané znížil mRNA expresie Smad2 a Smad3 v rakovinových tkanivách v porovnaní s okolitou normálneho tkaniva (obr. 5). Tieto výsledky ukazujú, že nielen aktivovaný Smad2, ale tiež sa znižuje expresia mRNA z celkovej Smad2 pri žalúdočnej rakoviny.

Diskusia

V kolorektálneho adenokarcinómu a HCC, posun v fosforylácii z karboxy-konca k linkerové oblasti bola navrhnutá ako kritická udalosť spojenú s prepínačom TGF-beta z tlmičom rakoviny na onkogénne faktor [8], [18], [19], [20], [21], [22]. V tejto štúdii sme skúmali túto potenciálny pridružení rakoviny žalúdka. Nezistili sme významný P-Smad2L a P-Smad3L úrovne u 130 pacientov s rakovinou žalúdka. 112 z 130 pacientov nevykazovali P-Smad2L alebo P-Smad3L farbenie vo buniek karcinómu žalúdka, čo naznačuje, že navrhovaný posun v fosforylácie R-Smäd nemusia prispievať k TGF-beta sprostredkovanú karcinogenéze v tomto type rakoviny. Na rozdiel od P-Smad2 /3L, ako P-Smad2C a P-Smad3C bola zistená pozitívna farbenie u väčšiny pacientov s rakovinou žalúdka. Kendall-tau pozičné korelačný analýza ukázala, že P-Smad2C IHC skóre inverzne koreluje s hĺbkou nádoru (T) a diferenciáciu rakoviny (G).

Úloha Smad2 pri vzniku a progresii iný typ rakoviny zostáva kontroverzné , V súlade so súčasnou zistenie, predchádzajúce štúdie na pažeráka skvamocelulárneho karcinómu, rakoviny prsníka a rakoviny hrubého čreva preukázané, že strata Smad2 expresie koreluje s vývojom nádoru a zlou prognózou [23], [24], [25], [26]. V poslednej dobe sa Wise a jeho kolegovia zistili, že Smad2, ale nie Smad3, bol často stratený v 83 pacientok s karcinómom kože z dlaždicových buniek. Ďalej, myši s keratinocytov špecifické delécie Smad2 zobrazená zrýchlené vytváranie a malígne progresiu chemicky indukovaných myších kožných nádorov v porovnaní s myšou divokého typu [27]. Avšak, v štúdii 52 pacientov s gliómom, pozitívne P-Smad2 IHC skóre bolo hlásených koreluje s proliferáciou gliómov a zlou prognózou [28]. Pred tejto štúdie, Shinto a jeho kolegovia meria P-Smad2C farbenie u 135 pacientov s rakovinou žalúdka. Zistili, že hladiny P-Smad2C boli vyššie u zle diferencovaných rakovinu, keď v porovnaní s tými dobre diferencovaných [29]. Nie je jasné, prečo ešte nie sú úplne protichodné výsledky v rakoviny žalúdka.

V kanonickej TGF-beta signalizácie, aktivovaný TGF-βRI zvyčajne indukuje karboxyterminální fosforylácii oboch Smad2 a Smad3. Aktivované Smad2 a Smad3 hrajú rôzne role v bunkovom raste, diferenciácie a iných biologických funkcií [30]. V pečeni, Smad2 je rozhodujúci pre sprostredkovanie rast a diferenciáciu hepatocytov, zatiaľ čo Smad3 hrá kľúčovú účinok v morfologické a funkčné dozrievanie pečeňových hviezdicových buniek [31], [32]. V prípade rakoviny, je otázne, či prerušenie génu Smad3 prispieva k vzniku nádorov. Zhu uviedol, že Smad3 u myší s deficitom vývoji karcinómu hrubého čreva [33]. Avšak, iné štúdie využívajúce Smad3-deficitom myšou naznačujú, že strata Smad3 sama o sebe nestačí k začatiu tumorigenezi [34], [35], [36], [37]. V prípade rakoviny žalúdka, Han našiel nízkej hladiny Smad3 u 3 z 8 pacientov a v deviatich ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných [38]. Zavedenie vektora Smad3 do bunkových línií žalúdočnej obnovená TGF-p reakcie. Ďalej, injekcie Smad3 exprimujúcich žalúdočných buniek do holých myší preukázali oneskorenou tumorigenezi v porovnaní s kontrolami, čo ukazuje na koreláciu straty Smad3 s karcinogenézy [38]. V tejto štúdii sme nezistili významnú koreláciu medzi P-Smad3C farbením v nádorových bunkách žalúdku a rakoviny invázie, diferenciácie a stupňa. Na rozdiel od P-Smad2C, ktorý je exprimovaný iba v jadrách buniek, P-Smad3C pozitívne farbenie je detekovateľný v jadre, na membránu a v cytoplazme buniek karcinómu žalúdka. Biologická relevantnosť rôznych modelov P-Smad3C farbenie v nádorových bunkách, je v súčasnej dobe stále ešte známy.

EMT rakovinových buniek je nevyhnutným predpokladom pre vyvíjajúci sa do pokročilých metastazujúcich nádorov [11]. Bolo zistené, že TGF-β je významným hráčom v EMT. Smad3, ale nie Smad2, je kľúčový mediátor TGF-p závislé EMT [39]. Napríklad, TGF-β nedokáže vyvolať EMT v primárnych tubulárnych epitelových buniek odvodených z obličiek Smad3-deficitom myšou [40]. Inhibícia TGF-beta signalizácie Ki26894, inhibítor TGF-βRI, znížila invázii a EMT z scirrhous rakoviny žalúdka in vitro
[41]. Naše výsledky ukazujú, že časť buniek karcinómu žalúdka expresiu EMT markery, napr Slimák, kolagén I a α-SMA. Ko-lokalizácia P-Smad3C s a-SMA /kolagénu I sa nachádza v značnej časti pacientov. Okrem toho, α-SMA pozitívnym farbenie v rakovinových bunkách má potenciálny koreláciu s P-Smad3C IHC skóre nádorových buniek, ale nie okolité nerakovinové tkanivá. Tieto výsledky ukazujú, že P-Smad3C môže hrať úlohu v EMT rakoviny žalúdka.

Stručne povedané, táto štúdia ukazuje, že Smad2 je dôležitým mediátorom brániť žalúdočných buniek z postupuje smerom k zle diferencované rakoviny. Podľa našich výsledkov, Smad3 nie je priamo spojené s vlastnosťami karcinómu žalúdka, ale naše údaje naznačujú, že môžu hrať úlohu v rakovinových spojené fibroblastov a EMT z buniek karcinómu žalúdka.

Methods

Pacienti

Chirurgické vzorky boli skúmané u pacientov s primárnou rakovinou žalúdka u odboru všeobecnej chirurgie, prvá pričlenil nemocnice, Medical School, Zhejiang University, Čína od roku 2003 do roku 2009. žalúdočné tkaniva vzorka bola odobratá pri členitý ordinácie rakovina žalúdka. Odobraté tkaniva zahrnuté nádoru a okolité nenádorových plochy (tkaniva prinajmenšom o viac ako 5 cm ďaleko od nádoru). Časť tkaniva boli fixované v 4% formaldehydu a vložené do parafínu pre histológiu a meranie IHC. Zostali čerstvé tkanivá boli umiestnené do tekutého dusíka ihneď k meranie mRNA. Do štúdie bolo zaradených celkom 130 párových žalúdočných tkanív, vrátane rakoviny a okolité nenádorových tkanív. Patologická diagnóza a klasifikácie boli odhadnuté podľa tumor-node-metastázy (TNM) klasifikáciu presadzuje Medzinárodná únia proti rakovine (siedma vydanie) [42]. Základné charakteristiky zúčastnených pacientov sú uvedené v tabuľke 4. Protokol štúdie zodpovedalo etických smerníc Helsinskej deklarácie (1975). Štúdia bola schválená etickou komisiou na pričlenené nemocnice, Medical School, Zhejiang University. Písomné informovaný súhlas boli získané zo všetkých účastníkov zapojených do štúdie.

Protilátky

králičej polyklonálnej protilátky proti P-Smad2C (Ser 465/467), P-Smad3C (ser 423/425), P-Smad2L (Ser 250/255), a P-Smad3L (Ser 208/213) boli popísané v predchádzajúcich štúdiách [43], [44]. Myšou anti-humánnej α-SMA (M0851), polyklonálna anti-SNAIL (ab-17732), a monoklonálne anti-kolagén I (C2456) protilátky boli zakúpené od firmy DAKO, abca a Sigma, resp.

imunohistochémia (IHC )

Po preskúmaní H & E-nafarbená z 130 zapojených pacientov s rakovinou žalúdka, reprezentatívne parafínové bloky pre každého pacienta boli vybrané pre sekciu. Sklíčka bola deparaffinised v xyléne a rehydratované v sérií riedení etanolové do destilovanej vody. Antigén vyhľadávania bola vykonaná mikrovlnnom ohreve v EDTA (1 mmol, pH 8,0). Sklíčka sa potom nechá reagovať s 3% H _{2O 2 po dobu 30 minút pri teplote miestnosti. Po premytí PBS sa trikrát, bola sklíčka inkubovaná s králičie polyklonálne protilátkou proti P-Smad2C (1: 100), P-Smad3C (1: 100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (1:50 ), a α-SMA (1: 200), respektíve pri teplote 4 ° C cez noc. Ďalší deň bola sklíčka premytá trikrát PBS. Po premytí boli inkubované s envision peroxidázou (Dako) značeného anti-králičie alebo anti-myšou protilátka po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Aktivita peroxidázy bola detekovaná s Diaminobenzidine (DAB). Sklíčka bola kontrastne hematoxylínom. Imunoreaktivita bola vizualizované pod svetelným mikroskopom}

Pre semikvantitatívnu analýzu, zafarbené tkanivové rezy boli hodnotené na 4-bodovej stupnici nasledujúcim spôsobom: pozitívne, počet buniek, stupňa 0-3 (0, žiadne pozitívne bunky, 1, <. 25% pozitívnych buniek, 2, 25% až 50% pozitívnych buniek, 3, > 50% pozitívnych buniek); Intenzita pozitívneho farbenia, stupňa 1-3 (1, slabo pozitívne farbenie, väčšinou žltá, 2, silná pozitívna farbenie, zvyčajne hnedé, 3, veľmi silný pozitívny farbenie, zvyčajne tmavo hnedé až čierne). Konečný imunitný farbenie skóre bolo vypočítané ako počet x intenzitou.

Imunofluorescenčný farbenie

Sklíčka sa deparaffinised v xyléne a rehydrated v etanolové až do destilovanej vody. Potom získanie antigénu bola vykonaná mikrovlnnom ohreve v EDTA (1 mmol, pH 8,0). Sklíčka sa potom nechá reagovať s 3% H _{2O 2 po dobu 30 minút pri teplote miestnosti. Po premytí s PBS, a to ako primárnych protilátok, králičie anti-P-Smad3C /šnek a myší anti-a-SMA /kolagén I, boli použité pri teplote 4 ° C cez noc. Potom, sekundárne protilátky, Alexa633-králičie anti-myší imunoglobulín G a Alexa488-oslie anti-králičie imunoglobulín G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Nemecko), bola aplikovaná počas 30 minút pri teplote miestnosti. Vzorky boli upevnené pomocou Dako-Cytomation Fluorescent zalievacie médium. Sklíčka bola kontrolovaná a fotografie boli nadobudnuté na konfokálního mikroskopu (Leica, Heidelberg). Úseky bez primárnej protilátky boli použité ako negatívne kontroly.}

PCR v reálnom čase

Celková RNA bola purifikovaná z žalúdočné tkaniva s High Pure izoláciu RNA kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Nemecko) v súlade do protokolu výrobca, a koncentrácia bola meraná spektrofotometricky. cDNA bola syntetizovaná z 1 ug RNA s syntézy súpravy Transcriptor First Strand cDNA (Roche Diagnostics). Kvantitatívny real-time PCR bola vykonaná so systémom detekcie sekvencií ABIPrism 7700 (Applied Biosystems) za použitia TaqMan Universal PCR Master Mix č AmpErase Ung (časť č. 4324018). Boli použité nasledujúce génovej expresie testy: Smad2 (vpred: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; vzad: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (vpred: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; vzad: GAAGGCGAACTCACACAGC) a peptidylprolyl izomerázy A (upratovanie gén; obj Mm02342429_g1 ..). Všetky činidlá boli zakúpené od Applied Biosystems. Vzorky boli trikrát za nasledovných podmienok: počiatočné denaturácia po dobu 2 minút pri teplote 50 ° C a počas 10 minút pri teplote 95 ° C a následne 40 cyklov po 15 s pri 95 ° C a 1 minútu pri 60 ° C. Hladiny génovej expresie v každej vzorke boli stanovené s prahovú porovnávacej cyklu metódou.

Štatistická analýza

Pre vyhodnotenie asociácie medzi vybranými imunohistologických markerov a parametre nádoru, bola vykonaná Kendall-tau pozície korelačný analýza za použitia SAS verziu 9.2 (Cary, NC, USA). A p
. ≪ 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú

• Ploche ONE: Klinická Potenciál metylácie DNA v rakoviny žalúdka: metaanalýza
• Ploche ONE: priestorovom rozložení LGR5 + buniek koreluje s rakovinou žalúdka Progression