PLoS ONE: прогностическое значение MIR-181B и MIR-21 в больных раком желудка, обработанных S-1 /оксалиплатина или доксифлуридин /Oxaliplatin

Абстрактный

Фон

Цель данного исследования является оценка эффективности S-1 /Оксалиплатин против режима доксифлуридин /оксалиплатином и выявления микроРНК в качестве потенциальных прогностических биомаркеров в больных раком желудка. Выражение кандидата микроРНК количественно из пятидесяти пяти поздней стадии желудка образцов FFPE рак

Экспериментальный дизайн
<р> у больных раком желудка с КПС &Гт. 70 были набраны для суда. Контрольную группу обрабатывали 400 мг /дважды /день доксифлуридин плюс i.v.
С оксалиплатином на 130 мг /м ^{2 /первый день /4-недельного цикла. Группа тестирования обрабатывали S-1 в дозе 40 мг /дважды /день /4-недельного цикла плюс i.v.
С оксалиплатином при 130 мг /м 2 /первый день /4-недельного цикла. Всего РНК была выделена из нормальной и желудочных образцов опухолей. Уровни микроРНК были определены количественно с помощью анализа в реальном масштабе времени экспрессии QRT-PCR.}

Результаты
<р> Общий показатель объективный ответ (CR + PR) пациентов, получавших S-1 /оксалиплатина составил 33,3% (CR + PR) против.
17.6% (CR + PR) с доксифлуридин /оксалиплатина для продвинутой стадии больных раком желудка. Средняя общая выживаемость у пациентов, получавших S-1 /Оксалиплатин был 7,80 месяц по сравнению с 7,30 месяца с пациентами, принимавшими доксифлуридин /оксалиплатина. Выражение MIR-181B ( P
= 0,022) и MIR-21 ( P
= 0,0029) была значительно избыточно экспрессируется в опухолях желудка по сравнению с нормальными тканями желудка. Анализ выживаемости Каплана-Мейера показал, что низкие уровни экспрессии микроРНК-21 (Log ранговый, относительный риск: 0,17, CI = 0.06-0.45; P
= 0,0004) и микроРНК-181b (Log ранговый, опасность соотношение:. 0.37, CI = 0.16-0.87; P
= 0,018) тесно связаны с общей выживаемости пациента лучше для обоих режимов S-1 и доксифлуридин на основе

Вывод изображения <р> у пациентов, получавших S-1 /Оксалиплатин был лучший отклик, чем у пациентов, получавших доксифлуридин /оксалиплатина. микроРНК-21 и микроРНК-181b обладают большим потенциалом в качестве прогностических биомаркеров в поздней стадии рака желудка
<р> Образец цитирования:. Цзян J, Чжэн X, Сюй X, Чжоу Q, Ян H, Zhang X и др. (2011) прогностическое значение MIR-181B и MIR-21 в больных раком желудка, обработанных S-1 /оксалиплатина или доксифлуридин /оксалиплатина. PLoS ONE 6 (8): e23271. DOI: 10.1371 /journal.pone.0023271
<р> Редактор: Михаил В. Blagosklonny, Roswell Park институт рака, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 19 мая 2011 года; Принято: 10 июля 2011 года; Опубликовано: 18 августа, 2011
<р> Copyright: © 2011 Цзян и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (30950022 и 30972703) и общества Разработка планов, Департамент по науке и технике Чанчжоу (BS20092019). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка остается одним из наиболее распространенных форм рака во всем мире с приблизительно 870000 новых случаев заболевания и 650000 смертей в год. Рак желудка является одним из наиболее распространенных причин смерти от рака в Китае [1]. Раннее клиническое обнаружение рака желудка было меньше, чем 15%, и около 85% случаев были раком желудка [2]. Средний показатель смертности от рака желудка в Китае составляет более 26% мужского и 15% женского пола. Рак желудка является довольно сложным и загадочным расстройством и многие факторы, которые могут привести к развитию болезни. Epigenetics играет ключевую роль в развитии рака желудка и монтажным исследований свидетельствуют о том, что некодирующие микроРНК являются одним из основных участников рака желудка.

микроРНК представляют собой класс малых некодирующих РНК 20-22 нуклеотидов в длину, которая обрабатываются с более крупными предварительными микроРНК с помощью РНКазы III фермента шпигорезка (DICER1) в дуплексы миРНК [3]. Одна прядь этих двухуровневых ассоциированных с РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC), в то время как другой нити, как правило, деградируют под действием клеточных нуклеаз [3]. Комплекс микроРНК-RISC связывается со специфическими мРНК мишеней, что приводит к трансляционной репрессии или расщепление этих мРНК. Таким образом, микроРНК модулировать экспрессию белка, способствуя деградации РНК, ингибирования трансляции мРНК, а в некоторых случаях, влияющих транскрипцию. Хотя микроРНК-опосредованной деградации мРНК происходит у млекопитающих, большинство микроРНК млекопитающих, как полагают, чтобы репрессировать экспрессию гена-мишени на уровне трансляции [4], [5], [6] с помощью несовершенного спаривания оснований к 3'-нетранслируемые области (3 ' -UTRs) их мРНК мишеней. Эта форма трансляционной регуляции обеспечивает клетку с более точным, немедленной и энергетически эффективным способом контроля экспрессии данного белка [7], поскольку это вызывает быстрые изменения в синтезе белка без избыточной активацией транскрипции и последующих стадий обработки мРНК. Кроме того, трансляционный контроль экспрессии гена имеет то преимущество, что легко обратимыми, обеспечивая клетки с большой гибкостью в ответ на различные стрессы.
<Р> фторпиримидин химиотерапия на основе (например, S-1 /оксалиплатина и доксифлуридин /оксалиплатина) остается основным вариантом лечения для больных распространенным раком желудка. Предыдущие исследования выявили ряд микроРНК, связанных с химиорезистентность к 5-ФУ и S1 терапии, основанной в колоректального рака [8], [9], [10], [11], [12], [13]. S-1 является новым пероральный дигидропиримидиндегидрогеназа (ДПД) ингибирующее фторпиримидин (DIF) на основе биохимической модуляции 5-фторурацил (5-FU); S-1 содержит тегафур (FF) и два типа ингибитора фермента, 5-хлор-2,4-дигидроксипиридин (CDHP) и оксонат калия (Оксо) в молярном соотношении 1:0.4:1. Доксифлуридин является производным фторпиримидин и активируется в 5-фторурацил по уридин-фосфорилазы, которая более высоким уровнем экспрессии в злокачественных клетках. Ряд докладов продемонстрировали важность микроРНК в развитии рака желудка [14], [15], [16], [17]. Тем не менее, в настоящее время не существует какого-либо исследования по микроРНК, связанных с flupyrimidine на основе химиотерапии. Существует настоятельная необходимость обнаружить прогностических биомаркеров для оказания помощи клинического лечения распространенного рака желудка, так как это поможет выбрать пациентов, которые будут иметь преимущество в выживаемости от лечения, избежать токсичности для неответчиков, а также снизить стоимость медицинской помощи для пациентов.
<р> Хотя некоторые микроРНК профилирующие исследования было зарегистрировано, чтобы выявить важность микроРНК в развитии рака желудка с воздействием на контроле клеточного цикла, апоптоза, инвазии и метастазирования опухолей [14], [17], в настоящее время нет доклад ссылка микроРНК с химиотерапевтических процедур с S-1 /оксалиплатина и доксифлуридин /оксалиплатина. В данном исследовании мы систематически исследовать отношения выбранных кандидатов микроРНК (например, микроРНК-21, микроРНК-181b, микроРНК-192, микроРНК-140, пусть-7g) с точки зрения их клинической полезности при раке желудка с использованием архивных желудка образцов FFPE рака , Эти микроРНК были предыдущие сообщалось, связаны с фторпиримидинов химиорезистентности на основе колоректального рака [9], [10], [11], [12], [13]. Дохимиотерапевтическую образцы были выбраны из S-1 /Оксалиплатин и доксифлуридин /Оксалиплатин при поздних стадиях рака желудка. Мы показали, что предыдущая микроРНК являются достаточно стабильными в образцах FFPE и он идеально подходит для поиска биомаркеров [18]. У пациентов, получавших S-1 /Оксалиплатин был лучший отклик, чем доксифлуридин /оксалиплатина. Тем не менее, нет никакой разницы в выживаемости в целом пациента. Мы обнаружили, что микроРНК-21 и микроРНК-181b значительно связаны с желудочным исходом рака с S-1 /на основе оксалиплатина химиотерапии. Насколько нам известно, это первый отчет, чтобы продемонстрировать прогностическое значение микроРНК в раке желудка, связанной с S-1 /Оксалиплатин и доксифлуридин /Оксалиплатин лечения. микроРНК-21 и микроРНК-181b обладают большим потенциалом в качестве прогностических биомаркеров в поздней стадии рака желудка.

методы

Пациенты и образцы
<р> Клинические когорты образцы, используемые для этого исследования были утверждены Советом учреждения по рассмотрению действия Третьего филиал больницы Дунъу университета. Парафиновые блоки, содержащие фиксированные формалином образцы тканей (FFPE) были приобретены из архивных коллекций кафедры патологической анатомии, и используется для последующей экстракции РНК. Характеристики этих пациентов представлены в таблице 1.

Выделение РНК
<р> Использование архивных тканей FFPE, отдельные участки твердой опухоли и нормального желудочного эпителия были идентифицированы с использованием соответствующего гематоксилином и эозином окрашенные срезы и ядра размером 1,5 мм в диаметре и 2 мм в длину (приблизительно 0,005 г) извлекали. Затем образцы обрабатывали депарафинизации, гидратации, протеиназы К, и в конечном счете, тотальную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, CA, США) [18].

В реальном масштабе времени QRT-PCR-анализе микроРНК выражение
<р> микроРНК-21, микроРНК-140, пусть-7g, микроРНК-181b, микроРНК-200c, микроРНК-192 специфических праймеров и ген внутреннего контроля RNU44 были приобретены у Applied Biosystems (Калифорния, США). синтез кДНК осуществляли с помощью высокой емкости для синтеза кДНК Kit (Applied Biosystems) с микроРНК специфическими праймерами. В реальном масштабе времени количественной ОТ-ПЦР (QRT-ПЦР) проводили на Applied Biosystems 7500 система реального времени (ABI 7500HT приборов) с микроРНК специфических праймеров TaqMan Gene Expression Assay. Выражение значений микроРНК нормализовали по внутреннему контролю RNU44, а относительные значения экспрессии были построены.

Статистический анализ
<р> Все статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0. Генные значения экспрессии микроРНК Δ CТ из каждого образца рассчитывали путем нормализации в соответствии с выражением внутреннего контроля RNU44, и относительные значения количественного определения были построены. Различия между опухолью и нормальных тканей были проанализированы с помощью теста Вилкоксона совпадающая-пар. Кривая выживаемости Каплана-Мейера был создан путем выполнения Кокса регрессионного анализа для оценки уровня экспрессии микроРНК-21 и MIR-181B с выживаемостью. Статистическая значимость была создана для P
&л;. 0,05 в каждом тесте

Результаты и обсуждение
<р> колоссальная усилия были сосредоточены на обнаружении прогностические и прогностических биомаркеров для желудка рак [19]. Из-за соучастия заболевания рака желудка, она по-прежнему остается серьезной проблемой для выявления клинических полезных биомаркеров. С признанием широкого воздействия микроРНК на нескольких целей и путей, это наш интерес, чтобы определить новый класс прогнозирующих и прогностических биомаркеров рака желудка на основе микроРНК. Есть несколько преимуществ использования микроРНК в качестве биомаркеров по сравнению с мРНК, как микроРНК имеют широкую регулирующую функцию, относительно небольшое число и лучшую стабильность в архивных образцах FFPE [18]. Мы сообщаем, что уровни экспрессии микроРНК-181B и MIR-21 представляют собой сильные прогностические факторы в прогрессирующих больных раком желудка на обоих S-1 /оксалиплатина и доксифлуридин /оксалиплатина режимов. Клинические и патологические параметры у больных раком желудка, обработанных доксифлуридин /оксалиплатина или S-1 /оксалиплатином приведены в таблице 1.

Дифференциальная экспрессия микроРНК при раке желудка
<р> Мы тщательно отобрали ряд кандидатов микроРНК, которые были предыдущие сообщалось, связаны с фторпиримидинов химиорезистентности на основе колоректального рака [9], [10], [11], [12], [13]. Уровни экспрессии микроРНК были определены количественно с помощью анализа в реальном масштабе времени QRT-PCR с использованием общей РНК, выделенной из образцов желудочного FFPE рака и нормальных тканей желудка в качестве контрольных. Уровни экспрессии микроРНК были дополнительно нормировать с помощью RNU44 внутреннего контроля. Большинство микроРНК (например, микроРНК-140, микроРНК-200c) мы количественно показали дифференциальную экспрессию между нормальных и опухолевых тканей (Рисунок 1). Выражение важного микроРНК, MIR-200c, была значительно снижена при раке желудка. микроРНК-200c сообщается непосредственно связан с cheomosensitivity и эпителиально-к-мезенхимальных перехода (EMT) [20]. Выражение MIR-181B ( P
= 0,022) и MIR-21 ( P
= 0,0029) была наиболее значительно избыточно экспрессируется в опухолях желудка по сравнению с нормальными тканями желудка (рисунок 2). Наши результаты согласуются с предыдущими сообщениями, что эти микроРНК были нерегулируемых при раке желудка [21].

Ассоциация MIR-21 и MIR-181B с ответом на-1 S /оксалиплатином и доксифлуридин /оксалиплатином режима лечения <бр> <р> общий показатель объективный ответ (CR + PR) пациентов, получавших S-1 /оксалиплатина составил 33,3% (CR + PR) против.
17.6% (CR + PR) с доксифлуридин /оксалиплатина для IV больных раком желудка III стадии и. Мы выбрали несколько микроРНК, которые были показаны, чтобы быть связаны с химиорезистентности на основе фторпиримидинов при раке толстой кишки [9], [10], [11], [12], [13] и систематически оценивать их потенциальную связь с доксифлуридин /оксалиплатина и S -1 /Оксалиплатин при раке желудка. Низкий уровень экспрессии микроРНК-21 ( P
= 0,001) и MIR-181B ( P
= 0,001) были связаны с ответчиков S-1 /оксалиплатина (таблица 2). Это в высшей степени согласуется с предыдущим докладе, что микроРНК-181b выражение было связано с лечением S1 при колоректальном раке [8]. Было сообщено, что микроРНК-181b был связан с несколькими лекарственной устойчивостью (МЛУ) путем охвата BCL2 [22]. Что касается MIR-21, наши результаты согласуются с недавним докладом, что подавление MIR-21 анти-Mir сенсибилизирует панкреатических раковых клеток линии к гемцитабина (фторпиримидином аналог) лечения [23]. Тем не менее, благоприятный ответ не оказало влияния на общую выживаемость пациента как средней общей выживаемости у пациентов, получавших S-1 /Оксалиплатин (7,80 мес) была одинаковой с пациентами, принимавшими доксифлуридин /оксалиплатина (7,30 в месяц). Это не удивительно, так как часто время благоприятный ответ не перевести на благо выживания.

микроРНК-21 и микроРНК-181b были достоверно связаны с выживаемостью пациента
<р> Для того, чтобы определить, являются ли некоторые из этих микроРНК имеют потенциал в качестве прогностического биомаркера при раке желудка, мы провели анализ выживаемости пациента с использованием кривой выживаемости Каплана-Мейера Мульти вариант Cox регрессионного анализа. Каплан-Майера анализ выживаемости Кокса регрессии показали, что низкие уровни экспрессии микроРНК-21 (Log ранговый, относительный риск: 0,17, CI = 0.06-0.45; P
= 0,0004) и микроРНК-181b (Log ранг тест, отношение рисков: 0,37, CI = 0.16-0.87; P
= 0,018) тесно связаны с общей выживаемости пациента лучше для обоих S-1 и схемы лечения на основе доксифлуридин (Рисунок 3). Важность MIR-21 и MIR-181B при раке желудка была активно поддержана в недавнем докладе, что выражения MIR-21 и MIR-181B были активированы с помощью STAT3, опосредованных IL-6. микроРНК-21 и микроРНК-181b выступают в роли эпигенетической переключателя ингибировать PTEN и опухолевые супрессоры CYLD, что приводит к увеличению активности NF-кБ, необходимого для поддержания трансформированного состояния [24]. Мы также показали, что экспрессия обоих MIR-21 и MIR-181B положительно связана с точки зрения значения выражения на основе статистического анализа (корреляция Пирсона г = 0,38, P
= 0,018; Спирмен корреляции г <к югу> s = 0,38, P
= 0,018). Вполне возможно, что микроРНК-21 и микроРНК-181b выступают в роли эпигенетической переключателя в развитии рака желудка и способствуют химиорезистентности путем модуляции ключевых генов подавителя опухоли мишени, такие как Pdcd4, ANP32A и генов SMARCA4 [25]. Выражение Повышенные микроРНК-21 было сообщено во многих типах опухолей, что свидетельствует о важности MIR-21 в качестве добросовестных онкоген. Это было сказано в сообщении микроРНК-21 был связан с H. пилори
инфекции и развитие рака желудка, предполагая, что микроРНК-21 может быть потенциал эпигенетической звено воспаления H. Pylori
инфекции и опухоли инициации рака желудка [26].
<р> В заключение мы приводим здесь в первый раз, что экспрессия микроРНК-181B и MIR-21 были связаны с S-1 /оксалиплатина и доксифлуридин /лечение Оксалиплатин и выживаемость пациентов. Кроме того, он поддерживает понятие для потенциальной важности MIR-181B и MIR-21 в развитии заболевания раком желудка. Он закладывает основу для дальнейшего изучения, подчеркивающий молекулярный механизм развития рака желудка, связанных с микроРНК-181B и MIR-21, а также в полной мере подтверждения наших выводов к большой когорте, многоцентровых пациентов клинических испытаний. микроРНК-181b и микроРНК-21 может также иметь потенциал, чтобы быть, как новые терапевтические мишени при раке желудка.

Выражение признательности
<р> Хайфэн Дэн, Mingyang Лу, Бен Сюй, Мин Ли, Цзянь Лю, Zhengguang Ли и Хунбин Ши при условии, отличную техническую помощь.

• PLoS ONE: MIR-29a Тормозит пролиферацию клеток и индуцирует остановку клеточного цикла через подавление p42.3 в челове…
• PLoS ONE: геномная Профилирование подслизистых-инвазивным рака желудка на основе массивов сравнительная геномн…