PLoS One: a térbeli eloszlást LGR5 + sejtek korrelál gyomorkarcinóma Progression

absztrakt katalógusa

Ebben a tanulmányban vizsgált prevalenciája, histoanatomical elosztás és a daganat biológiai jelentősége a Wnt célfehérje és a rák őssejt marker LGR5 a tumorok az emberi gyomor-bél traktus. Differenciális expressziója LGR5 vizsgáltuk a transzkripciós (valós idejű polimeráz-láncreakció) és transzlációs szinten (immunhisztokémia) malignus és megfelelő nem-malignus szövetekben 127 beteg, amely tartalmaz hat különböző primer tumor helyszínek, azaz a nyelőcső, a gyomor, a máj, hasnyálmirigy, vastagbél és a végbél. A klinikopatológiai jelentősége LGR5 kifejezés vizsgálták 100 beteg gyomorrák (GC). Nem daganatos szövetet általában rejtegetett csak nagyon kevés elszórtan LGR5 ^{+ sejtek. A megfelelő karcinómák a nyelőcső, a gyomor, a máj, hasnyálmirigy, vastagbél és a végbél szignifikánsan több LGR5 + sejtek, valamint szignifikánsan magasabb LGR5-mRNS összehasonlítva a megfelelő nem-neoplasztikus szövetet. Kettős festés kísérletek azt mutatták, a koexpressziójának LGR5 a feltételezett őssejtmarker CD44, Musashi-1 és ADAM17. Továbbá megvizsgáltuk a hipotézist, hogy a váltások a gyomor carcinogenesis, vagyis a krónikus atrófiás gastritis, intestinalis metaplasia és invazív karcinóma, társított átcsoportosításával LGR5 + sejtek. Érdekes, hogy a térbeli eloszlása ​​LGR5 változott: nem neoplasztikus gyomor nyálkahártya, LGR5 + sejteket találtunk főleg a nyálkahártya nyaki régióban; Intestinalis metaplasia LGR5 + sejteket lokalizálódik a kripta bázis és GC LGR5 + sejtek is jelen volt a luminális, a tumor központ és az invázió előtt. A expresszióját LGR5 a tumorban központ és invázió előtt GC szignifikánsan a helyi tumornövekedést (T-kategória), valamint a csomóponti spread (N-kategória). Emellett a betegeknek a LGR5 + GC rövidebb volt a túlélésre (28,0 ± 8,6 hónap), mint akiknek LGR5 - GC (54,5 ± 6,3 hónap). Eredményeink azt mutatják, hogy LGR5 különbözőképpen fejezik ki gyomor-bélrendszeri rákot, és a térbeli eloszlása ​​histoanatomical LGR5 + sejtek figyelembe kell venni, amikor a daganat biológiai jelentősége kérik. Katalógusa}

Citation: Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM Warneke V, Ebert M, et al. (2012) a térbeli eloszlást LGR5 ^{+ sejtek korrelál gyomorkarcinóma Progression. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486 katalógusa}

Szerkesztő: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: július 5, 2011; Elfogadva: március 16, 2012; Megjelent: április 18, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Simon et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A szerzők nincs támogatás vagy támogatási jelenteni. katalógusa

Érdekütközés: a szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. katalógusa

Bevezető katalógusa

Emésztőrendszeri carcinoma közül a leggyakoribb rosszindulatú és a vezető rákos halálok világszerte [1], [2]. Az okok a rossz prognózis összetettek: számos rák a gyomor-bélrendszer diagnosztizáltak előrehaladott kivéve gyógykezelés, nincsenek megbízható tumormarkerek, amely lehetővé teszi a korai diagnózis és szűrés a magas kockázatú populációban. Kezelési lehetőségek korlátozottak lokálisan előrehaladott vagy metasztatikus betegségükre, és jelentős számú daganatok ellenére is rendszeresen visszatérnek a kezdeti terápiás választ [3]. Egy feltételezett magyarázata egy hatástalan terápia a rák jelenlétét őssejtek (CSC). A CSC hipotézis feltételezi, hogy a tumor egy konglomerátum heterogén sejt populáció. Csak egy bizonyos alcsoportja e konglomerátum fenntartja a képesség telepképződése, és így kiújulás és áttétek. CSC jobban ellenáll a kemoterápia, ami a daganat kiújulásának, progresszió és végül a beteg halálát [4], [5]. Míg a CSC-modell egyre inkább elfogadott, meghatározása és megerősítése az úgynevezett őssejt markerek natív humán szöveti nehéz és nagyrészt hiányzik. A közelmúltban, a leucin-gazdag, a G-protein kapcsolt receptor (GPCR), és Wnt célgén LGR5
azonosították, mint egy új, őssejteken marker a vékonybél, a vastagbél és a hajhagymák egerekben [6] . Expressziója LGR5 több más szervekben azt jelzi, hogy akkor lehet, hogy a globális markere felnőtt őssejtek. Azonban keveset tudunk a kifejezést a máj- és gyomor-bél traktus az emberek. Katalógusa

Ebben a tanulmányban azt kívánta pótolni ezt a hiányosságot az információk és bevált a hipotézist, hogy a rák őssejt marker LGR5 prognosztikai és a tumor biológiai jelentőséggel bír.

anyagok és módszerek katalógusa

Témák katalógusa

a formalinban fixált és paraffinba ágyazott rosszindulatú és a megfelelő nem malignus szövetben, 127 beteg tartalmazó hat anatómiai helyeken a máj- és a gyomor-bél traktusban (azaz a nyelőcső, a gyomor, a máj, a hasnyálmirigy, vastagbél és a végbél) nyertük vissza a levéltár a Institutes of Pathology a keresztény-Albrechts Egyetemen Kiel és a Charité Egyetemi Kórház Berlin (mindkettő Németország). Minden beteget üzemeltetett bármelyik University Hospital Schleswig-Holstein (1997-2009) vagy a Charité Egyetemi Kórház Berlin (1995-2008; 1. táblázat). Rögzítetlen, friss fagyasztott szövetet ről 105 ilyen beteg nyolc különböző tumor típusok, azaz Barrett adenocarcinoma (9 beteg) laphámrák (7) a nyelőcső, a vékonybél (19) és a diffúz (21) típusú gyomorrák, adenokarcinóma a vastagbél (19) és a végbél (20), a hepatocelluláris karcinóma (HCC, 4), és a cholangiocarcinoma (CC; 6). A beteg jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza katalógusa

Egy független sorozat 487 gyomorrákos betegek kivettük az archívum a Patológiai Intézet, a keresztény-Albrechts Egyetemen (2. táblázat és 3. táblázat). Ezek a betegek esett át részleges vagy teljes gastrectomia az adenokarcinóma a gyomorban vagy a gyomor-oesophago csomópont. Minden reszekció mintának átesett szövettani vizsgálatra képzett sebészeti patológusok. Az idő a beteg halála kapunk a Az epidemiológiai Rákregiszter katalógusa az állam Schleswig-Holstein, Németország. Nyomon követése betegek adatait még életben voltak lekért kórházi feljegyzéseket és a kapcsolatot a háziorvos. Katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Minden szövetet vettünk részeként diagnosztikai vagy terápiás műtét után végzett a beteg adott írásos beleegyezését. Betegek kínál mintákat a kísérletsorozat álnevesített és elemeztük anonim, tehát nem személyes vonatkozású adatokat az adatbázisban szereplő. A vizsgálatot jóváhagyta a helyi etikai bizottság az Egyetemi Kórház Kiel, Németország (ref. Szám D 453/10). Katalógusa

Valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz láncreakció katalógusa

A teljes RNS volt izoláltuk a tenyésztett sejtekből és cryoconserved szöveteket használva Ambion azon Mirvana miRNS Isolation Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Németország), majd egy DN-áz kezeléssel Turbo DNS-mentes készlet (Ambion). RNS minőségét értékelték, 1,5% -os agaróz gélen. CDNS-szintézishez, 2 ug teljes RNS-t reverz transzkripció révén Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország). Gén-specifikus primereket szintetizáltunk Biomers.net (Ulm, Németország) (táblázat S1). Valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz-láncreakció (Real-time RT-PCR) alkalmazásával hajtottuk végre a LightCyler® 480 Probes Master (Roche) és a LightCycler® 480 rendszer (Roche). Az összehasonlító Ct értékeket normalizáltuk, hogy három háztartási gének: Homo sapiens szukcinát dehidrogenáz komplex, alegység, flavoprotein (Fp) (SDHA), a Homo sapiens calpain 2 (CAPN2) hotelben és ciklofilin C ( CYCC) hotelben. Nem sablon kontrollokat (nincs cDNS PCR) futtatunk minden gén kimutatására specifikus vagy genom erősítés és primer dimerizáció. Minden kísérletet két ismétléssel végeztük.

Generation és tisztítását egy anti-LGR5-ellenanyag

poliklonális antiszérumok voltak ellen létrehozott karboxi-terminális farok a humán LGR5 receptorhoz. Nyulakat immunizáltunk három különböző peptidek azonosságát SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (ún Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (ún 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (úgynevezett 12) által Pineda-abservice (Berlin, Németország). Monospecifikus IgG-t tisztítjuk gyors protein folyadék-kromatográfiával, ÄKTAprime ™ rendszerrel (GE Healthcare, Uppsala, Svédország) alkalmazásával protein-A-oszlopon (GE Healthcare). Minden ezt követő elemzések, azaz immunfluoreszcencia, immunhisztokémia, Western-blot és immunhisztokémiai monospecifikus IgG-frakció affinitás tisztított ellen immunizáló peptideket a Pineda-abservice. Dot blot analízis és immunhisztokémiai vizsgálatok, a monospecifikus anti-IgG antitest LGR5-11b megjelenő nagy affinitással együtt erős és specifikus immunfestéssel. Ezért ez a ellenanyagot használjuk ebben a vizsgálatban. A reaktivitás és specificitása a monospecifikus antitestet jellemezte Western blot; immunfluoreszcens és immunhisztokémiai vizsgálatokban. katalógusa

plazmidkonstrukcióra katalógusa

Expression konstrukcióban LGR5 generálta felerősítve teljes kódoló szekvenciáját humán LGR5 katalógusa (NM_003667.2) PCR (táblázat S1 ). Ahhoz, hogy megkönnyíti a szubklónozást az amplifikált fragmens az expressziós vektorba pcDNA3.1 (-), a forward primer tartalmaz egy NheI restrikciós helyet adaptert, és a fordított primer tartalmaz egy BamHI helyet, és egy c-Myc toldalék, hogy ellenőrizze a sikeres transzfekció. PCR-fragmenseket, és a pcDNA3.1 (-) expressziós vektort emésztünk külön-külön Nhel és BamHI elkötés előtt T4-ligázzal (Roche). A plazmidot igazoltuk emésztéssel Nhel és BamHI-gyel és DNS-szekvenálással ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit-ek, Version 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Németország).

Sejttenyésztés és transzfekció

az emberi gyomor rákos sejtvonalat MKN74 kapunk a japán Health Science Research Resource Bank (Osaka, japán), és MKN45 a német Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Németország). HEK293 EBNA sejteket által vásárolt Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). A sejteket RPMI 1640 tápközegben (MKN74, MKN45) vagy Dulbecco-féle módosított Eagle tápközegben (HEK293), kiegészítve 10% (MKN74, HEK293) vagy 20% (MKN45) magzati borjúszérumot, 100 U /ml penicillint és 100 ng /ml sztreptomicin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Ausztria). DNS transzfekciója HEK293 EBNA, MKN74 és MKN45 sejtek alkalmazásával végeztük Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai. Röviden, sejteket hat-üregű lemezeken. Stabil transzfekció MKN74 és MKN45 expressziós plazmidok végeztük a korábban leírtak [7]. A tranziens transzfekciót HEK293 sejtek 1 jig plazmid DNS-t és 5 ul Lipofectamine LTX reagenst hígítottunk 500 ul Dulbecco-féle Modified Eagle Medium szérum nélkül, ill. Inkubálás után 30 percig szobahőmérsékleten, majd az elegyet hozzáadjuk HEK293 sejtek. Negyvennyolc órával a transzfekciót követően, a transzfektált sejteket összegyűjtöttük, és RNS-t vagy fehérjét izolálunk. Transzfektált sejtek vektor pcDNA3.1 (-) önmagában és nem transzfektált sejtek szolgáltak negatív kontrollként. Katalógusa

Immunfluoreszcenciás katalógusa

Huszonnégy órával a vetés a CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium), sejteket mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, rögzített 07:03 acetone:methanol (20 perc, -20 ° C-on), és ezt követően permeabilizált 0,1% Triton-X (5 perc, szobahőmérséklet). Lemezeket ezután inkubáltuk c-Myc egér monoklonális antitest (Clontech, Mountain View, CA, USA) éjszakán át 5 ° C-on nedves kamrában, majd egy anti-egér Alexa Fluor 555 konjugált másodlagos antitest (Invitrogen). Ahhoz, hogy érzékeli a sikeres transzfekcióját LGR5, sejteket inkubáltunk anti-LGR5-antitesttel, majd egy anti-nyúl másodlagos ellenanyagot konjugált Alexa Fluor 488 (Invitrogen) mindegyik egy órán át szobahőmérsékleten keverjük. Elhagyása primer antitestek LGR5 transzfektált HEK293 EBNA sejtek szolgáltak negatív kontrollként. Felszerelés és counterstaining végeztük Vectashield Hard-Set beleértve DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA). Katalógusa

immuncitokémiája katalógusa

immuncitokémiai festést végeztünk formalin-fixált, paraffinba beágyazott MKN45 gyomor rákos sejteket. Erre a célra, MKN45 sejteket ágyazott kis agaróz gyöngyök a korábban ismertetett módon [8]. A további feldolgozás és immunfestés anti-LGR5-antitest (hígítás 1:1000) alapján végeztük, hogy az immunhisztokémiai elemzések a humán szöveti szakaszok (lásd alább). Kihagyása a primer antitest LGR5 transzfektált MKN45 sejtek szolgáltak negatív kontrollként, míg a specificitását anti-LGR5-antitest festési igazoltuk inkubáljuk az ellenanyag az immunizáló blokkoló peptid.

Western blot

Protein lizátumokat kapunk inkubálásával emberi gyomor szövetek és tenyésztett gyomor sejtek ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Németország) és a proteáz inhibitor koktélt (Complete EDTA-mentes, Roche). Protein mintákat denaturáltuk Laemmli-pufferben (60 mM Tris-HCl, pH = 6,8, 2% nátrium-dodecil-szulfát, 10% glicerin, 5% β-merkapto-etanol és 0,01% brómfenolkék) melegítve 95 ° C-on tíz percig, majd ezt követően betöltött 4% és 16,5% SDS-poliakrilamid gélen, és láthatóvá tettük Coomassie kék. Elválasztás után a fehérjék nem festődő poliakrilamid géleket átvittük egy nitro-cellulóz-membránra (Amersham, Freiburg, Németország), immunblottoltuk az anti-LGR5-antitest (hígítás 1:20,000), és egy anti-β-aktin-antitestet (1:10,000; klón AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), hogy egyenlő Loading mennyiségben. A membránhoz kötött HRP jelzett szekunder antitestek (DakoCytomation, Glostrup, Dánia) detektáltuk erősített kemilumineszcenciás ECL alkalmazásával rendszer (Amersham). Kihagyása a primer antitest szolgált negatív kontrollként, míg a specificitását anti-LGR5-antitest festési igazoltuk inkubáljuk az ellenanyag az immunizáló blokkoló peptid.

Szövettan

A szövettani vizsgálatok, szövet mintákat fixáltuk 10% semlegesített formalin és paraffinba ágyaztuk. Paraffint metszeteket megfestjük hematoxilinnel és eozinnal (H &E). Gyomorrák sorolták a WHO szerint osztályozás [9]. A pTNM szakasz szerint határoztuk meg a 7 ^{th kiadás a Nemzetközi Rákellenes Unió [10]. Katalógusa}

Tissue micro array építőipari katalógusa

A formalinban fixált és paraffinba ágyazott szövettani minták előállításánál használt szöveti mikro tömbök a korábban leírtak szerint [11]. Négy mikrométer szakaszok a kapott tumorszövet mikroarray blokk vágtunk a további elemzéshez. Sikeres átadása tumorszövetben igazoltuk mikroszkopikusan felhasználásával H &E-festett metszeteken.

Immunhisztokémia

immunhisztokémia, formalinnal fixált és paraffinba ágyazott metszeteket használtunk. Immunfestést végezzük az anti-LGR5-antitest (hígítás 1:1000), egy monoklonális antitest ellen irányul, a CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) és a kereskedelmi poliklonális antitesteket LGR5 (LGR5 ^{COM , 1:400; ABCAM, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (hígítás 1:50; Sigma-Aldrich) és Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Miután 20 percig blokkoló hidrogén-peroxiddal blokk (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 perc kezelés Ultra V Block (Thermo Scientific) és az inkubálást az elsődleges antitesttel végeztük nedves kamrában szobahőmérsékleten 30 percig. Lemezeket mostuk lépések között Tris-pufferelt sóoldattal (TBS). Immunreakciók tettük láthatóvá az n-Histofine Egyszerű Stain MAX PO Rendszer (Nichirei Bioscience, Tokió, Japán) és DAB szubsztrátot (Linaris, Wertheim-Bettingen, Németország). Kettős festésével LGR5 a CD44, ADAM17 és Musashi-1, a szabad kötőhelyeket blokkoljuk egér-IgG-t és nyúl-IgG kontroll (ABCAM) hígítva antitest hígítóval (ZYTOMED Systems, Berlin, Németország), miután a DAB-kezelést. A mintákat hematoxilinnel ellenfestettük. Kihagyása a primer antitest szolgált negatív kontrollként. Nem daganatos humán gyomor (CD44) és az agyszövetet (LGR5 com, LGR5 és Musashi-1) szolgált pozitív kontrollként.}

értékelése immunfestés

immunfestése nem neoplasztikus epitélium és tumorsejtek szerzett alkalmazásával egy immunreakció pontozási rendszer (IRS). Röviden, A kategória dokumentált intenzitása immunfestés 0-ként (az antitest nem), 1 (gyenge), 2 (közepes) és 3 (erős). B kategória dokumentált a százalékos immunreaktív sejtek 0 (negatív), 1 (elszórt pozitív sejtek; ≤1%), 2 (2-10% pozitív sejtek), 3 (11-50%), 4 (51-80%) és 5 (> 80%). A hozzáadott A és B kategóriás eredményezett IRS terjedő 0-8 minden egyes esetben. Az elosztási változásai LGR5 ^{+ sejtek 100 whole mount szakaszait intesztinális típusú gyomorrák pontoztuk a következők: a számos immunreaktív sejtek minősíteni 0 (negatív), 1 (< 10 pozitív sejtek), 2 (10 -50 pozitív sejtek) és a 3. (> 50 pozitív sejtek) külön luminális, tumor központ és az invázió előtt. katalógusa}

Statisztikai elemzések katalógusa

a statisztikai elemzéseket végeztünk a PASW Statisztika 18 statisztikai csomag (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Az összehasonlítást a csoportok között vizsgáltuk felhasználásával Fisher-féle egzakt teszt. Korrelációja LGR5 kifejezés egy csoporton belül hozták létre Kendall tau rang-rendű korreláció. Túlélési görbéket a Kaplan-Meier-módszerrel és különbségek a túlélési értékelte a log rank teszt. A jelentősége korrelációk LGR5 expressziója primer tumor és a megfelelő nem malignus szövetben értékelték Wilcoxon tesztet. Real-time RT-PCR adat, amely értékelték a párosított, kétoldalas t-teszt, kapott logarithmized hogy körülbelül normális eloszlású adatokat. P-értékek < 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

LGR5-mRNS eltérő módon fejeződnek ki, a máj- és a gyomor-carcinoma katalógusa

LGR5 állítólag kifejezett egér őssejtek az intestinalis kripták [12], és gyakran túlexpresszálódik vastagbél rákos sejtvonalakban [13]. Annak vizsgálatára, az expressziót nem neopláziás és neoplasztikus humán szöveti értékeltük a transzkripciós expresszióját LGR5 humán klinikai mintákból áll egy széles körű hepato-gasztrointesztinális karcinómák. Real-time RT-PCR analízist végeztünk egy sor 105 beteg tartalmazó rosszindulatú és megfelelő nem-rosszindulatú szövetet, amelyet ugyanabból a betegből, nyolc különböző tumortípus: nyelőcső [Barrett adenocarcinoma (9 páciens) és pikkelysejtes karcinómák ( 7)], a gyomor [bél (19) és a diffúz típusú (21) gastricus karcinómák], a májban [HCC-k (4), a CET (6)], vastagbél (19) és a végbél (20; 1. táblázat).

LGR5-mRNS szignifikáns differenciálisán kifejezve adenocarcinoma a nyelőcső (p = 0,007), a gyomor [bél típusa (p = 0,006) és a diffúz típusú (p = 0,013)], a májban [CET (p = 0,022)], vastagbél- (p < 0,001), valamint a végbél (p = 0,002), mint a kiegyenlített, nem neoplasztikus szövetet. Azonban nem differenciális expressziót találtunk laphámsejtes karcinómák a nyelőcső (p = 0,503), és HCC összehasonlítva a megfelelő nem-neoplasztikus szövetekben (p = 0,545; 1. ábra).

A poliklonális anti-LGR5- ellenanyag érzékeli az emberi LGR5 HEK293 és MKN45 sejtek katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a histoanatomical eloszlása ​​LGR5 az emberi szövetek és kivizsgálására, klinikopatológiai jelentőségű, egy LGR5-specifikus antitest emelték, hiszen a kereskedelemben kapható antitestek tett nem felel meg a követelés (2A ábra). Ahhoz, hogy kizárja keresztreakciót az újonnan generált antitestet a legtöbb szerkezetileg hasonló LGRs, LGR4 és LGR6 végeztünk egy szekvencia igazodás a National Center for Biotechnology Information
beállító eszköz előre (az adatokat nem mutatjuk be). Nem szekvenciahomológiát találtak LGR4 vagy LGR6 a régióban a LGR5 peptid használtuk az immunizáláshoz. Kiválasztására egy erősen specifikus antitest ellen LGR5, klónozott, teljes hosszúságú cDNS-t transzfektáltuk HEK293 EBNA sejtek és használni, mint egy pozitív cél teljesítő immunfluoreszcenciával. A LGR5 cDNS-t közvetlenül címkézett egy myc-epitópot, ami lehetővé tette az értékelés a transzfekciót egy anti-myc toldalék antitesttel. Használata immunfluoreszcens kötődése az anti-myc toldalék antitestet találtak inkubációt követően LGR5 /HEK293-sejtek, de nem üres vektorral transzfektált sejtek (vektor /HEK293), nem transzfektált HEK293-sejtek, vagy a negatív kontroll a LGR5 /HEK293 sejteket inkubáltuk antitesttel hígítóval helyett az elsődleges antitesttel. Ugyanezt az eredményt kaptuk, amikor alkalmazták az anti-LGR5-antitest (3. ábra), amely kimutatja specifikus jelölését LGR5. Katalógusa

A sajátossága LGR5-immunológiai tovább validált formalin-fixált és paraffinba ágyazott MKN45 gyomor- rákos sejteket. A sejteket állítottunk elő, és megfestettük oly módon, hogy párhuzamos a feldolgozása klinikai humán szövetmintákban. Immuncitokémiai elemzések paraffin szakaszok kiderült, egy pozitív festődése az anti-LGR5-antitest MKN45 stabilan transzfektált sejteket LGR5 cDNS-t (LGR5 /MKN45). Ehelyett, üres vektorral transzfektált MKN45 sejteket (vektor /MKN45), valamint a negatív kontroll (kihagyva az elsődleges antitest) és a peptid kontroll (pre-inkubáció az antitest és annak immunizáló blokkoló peptid) a LGR5 /MKN45 sejtek mutattak nincs kötelező az antitest (ábra S1).

LGR5 fehérje specifikusan kimutatható az anti-LGR5-ellenanyag humán transzfektált MKN74 sejtek

az emberi gyomor rákos sejtvonalak MKN74, ismert, hogy rendelkezünk egy mérsékelt LGR5-mRNS expressziója (az adatokat nem mutatjuk be) és a humán nem-daganatos gyomor, mutató nagyon alacsony LGR5 kifejezés (1. ábra) úgy választottuk meg, hogy jellemezze a reaktivitás és specifitását az anti-LGR5-ellenanyag fehérje szinten.

a Western-blot analízis, LGR5 proteint ismerik fel specifikusan a monospecifikus anti-LGR5-ellenanyag hígításban 1:20,000. Ez azonosított egyik sáv látszólagos molekulatömege 100 kDa MKN74 sejtlizátumokban (4. ábra), amely illeszkedik a molekuláris számított tömeg LGR5 fehérje. Ezzel szemben nem sávot detektáltunk lizátumából a humán nem-daganatos gyomor szövet, amely kizárja a kereszt-reaktivitás anti-LGR5-antitestet celluláris fehérjéket. Összhangban mRNS expressziós adatok, erősebb expressziója LGR5 fehérje volt megfigyelhető MKN74 stabilan transzfektált sejteket LGR5 cDNS, összehasonlítva MKN74 kontroll transzfektált sejtek az üres vektorral. LGR5 fehérje expresszió humán nem-daganatos gyomor nyálkahártya túl a kimutatási határ Western blot, megjelenítésére nem zenekar. Elhagyása az anti-LGR5-antitest vagy korábbi inkubáció az antitest és annak immunizáló blokkoló peptid kijelzők nincs fehérje sávok, ill. Kimutatása β-aktin fehérje (körülbelül 43 kDa; 4. ábra) szolgált telítő szabályozás és megerősítette egyenletesen terhelt fehérjetartalma az összes sávot. Katalógusa

LGR5 fejezik ki, nem daganatos és daganatos szövetek a máj- és a gyomor-bél traktus

az expressziós és histoanatomical eloszlását LGR5 később vizsgáltuk immunhisztokémiai egy sor 127 szövet csúszdák nyert megfelelő nem-daganatos és daganatos szövet a hepato-gyomor-bél traktus, amely a nyelőcső (14 beteg), gyomor (32), máj (24), hasnyálmirigy (17), a vastagbél (20), és a végbél (20; 1. táblázat). Ebből kohorsz neoplasztikus és megfelelő nem-neopláziás szöveti mintákat 105 beteget is vizsgáltuk a transzkripciós szintet (lásd fent).

LGR5 kifejeződését a teljes kohorsz pozitív volt 65 esetben (51%) az összes nem rosszindulatú szövetek és 103 esetben (81%) az összes rákos szövetekben. Lokalizációja LGR5 expressziót figyeltek meg főleg citoplazmatikus, míg szintén szórványos membrán vagy mag membrán hangsúlyos kifejezése történt. Egy LGR5-immunreaktivitást találtak minden szöveti komponensek, azaz a stroma-sejtek, endothelialis sejtek, sejtek a nem-neoplasztikus epithelium és a rákos sejtekben (5. ábra). LGR5-immunreaktivitás stroma sejtek volt megfigyelhető 49 (39%) az összes nem-rosszindulatú szövetek és 80 esetben (63%) az összes rákos szövetekben. Egy endoteliális immunreaktivitása LGR5 volt megfigyelhető 42 esetben (33%) minden szövetben.

A nem-malignus epithelium, LGR5 volt általában megtalálható a néhány elszórt sejtek közel a alapmembrán a gyomornyálkahártya egység, hasnyálmirigy-vezetékben, és a kolorektális sírkamrák. LGR5 nem található a laphám a nyelőcső, intrahepatikus epeutak, és a hepatocitákban (6. ábra). Minden szövet típusú eltekintve nyelőcső szöveti középértéke IRS szignifikánsan magasabb volt a tumorszövet képest kiegyenlített nem malignus szövetben, megerősítve a megállapítások a transzkripciós szinten (1. táblázat).

LGR5 van jelen szétszórt sejtek a normál gyomornyálkahártya

a létezése multipotens őssejtek belül a rágcsáló gyomor demonstráltuk klonális jelölés tanulmányokat. A végleges azonosító ezek a sejtek nem sikerült eddig miatt nem áll a specifikus endogén markerek [14]. A soros szakaszok nyert hüvely reszekció minta, ami általában nyert kezelésére túlsúlyos, és nem mutattak szövettani bizonyítékot gyomorrák vagy krónikus gyomorhurut, kerestünk LGR5 ^{+ hámsejtek. Érdekes, szétszórt LGR5 + sejteket találtak a nyálkahártya nyak közötti régió a foveolae és mirigyek (7. ábra).}

LGR5 van koexpresszált más potenciális gyomor őssejt vagy progenitor sejt markerek

őssejtek nem neopláziás szövetek és CSC általában azonosított és validált kifejeződött több, mint egy őssejt marker [15]. Immunhisztokémiai, mi mellett elemeztük koexpressziójának LGR5 más feltételezett CSC markerek, vagyis ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 lett kiválasztva, mert a korábbi vizsgálatok azonosítottak ADAM17 mint egy feltételezett őssejt marker a gyomor [8]. Immunfestést (akár kettős festéssel vagy festés soros szakasz) hajtottuk végre a gyomorrák mintának és az egészséges uninflammed gyomornyálkahártya kapott hüvely gastrectomia. Általában csak néhány elszórt sejtek mutattak pozitív immunológiai egyik és /vagy a másik feltételezett őssejt marker. Érdekes, hogy a nem-daganatos gyomornyálkahártya táplál sejtek, amelyek mindegyike ADAM17 ^{+ /LGR5 + (ez megközelítőleg egyharmada immunreaktív sejtek) és ADAM17 + /LGR5 - (kétharmada) és ADAM17 - /LGR5 + (néhány elszórt sejtek ábra 2C-E). katalógusa}

Musashi-1 (MSH-1) írták le, mint egy feltételezett őssejt marker egér belét és az emberi gyomor [18], [22] és egy CSC markerként tumorokban [23]. Daganatos és nem daganatos gyomor szöveti festett pozitív sejtek túlnyomó részt MSH-1 ^{+ /LGR5 - (körülbelül kétharmada immunreaktív sejtek), kisebb mértékben a MSH-1 + /LGR5 + (egyharmad), és kevés MSH-1 - /LGR5 + sejtek (ábra 2F-H). Végül a felületi marker colorectalis rák és gyomorrák őssejtek a CD44 [21], [24] szerint a megoszlási összehasonlítható MSH-1 (ábra 2I, J). Együttesen ezek az eredmények alátámasztják azt a hipotézist, hogy a mi anti-LGR5-antitest észleli sejtek őssejt expressziós mintázatot az emberi gyomor nyálkahártyáját. Katalógusa}

A térbeli eloszlása ​​LGR5 ^{+ sejtek változások során tumorgenesisben katalógusa}

a szekvenciális változások a gyomor nyálkahártya, hogy megelőzik a fejlődését invazív rák ismert, mint a "rákmegelőző lépcsőzetes", le először 1975-ben, ahol a normális gyomornyálkahártya transzformáltunk krónikus atrófiás gyomorhurut és fejleszti multifokális atrófia és intesztinális metaplázia, majd a megjelenése diszplázia, és végül invazív carcinoma [25]. Továbbá megvizsgáltuk a hipotézist, hogy a fent említett kórszövettani elváltozásokat a gyomor nyálkahártya társított átcsoportosításával LGR5 ^{+ vélelmezett őssejtek. Szisztematikusan feltártuk a histoanatomical eloszlása ​​LGR5 + sejtek 100 beteg bél típusú gyomorrák. Whole mount szöveti metszeteket alkalmazunk, amely zárt nem neoplasztikus, metaplasztikus és daganatos rákos szövetet. Ez volt nyilvánvaló, hogy a histoanatomical eloszlása ​​LGR5 + sejtek megváltozott (lásd 7. ábra): a nem-neopláziás és nem-metaplasztikus gyomor nyálkahártya, néhány elszórt LGR5 + sejteket találtak a nyálkahártya nyak régió (ábra 7A, E). Az intesztinális metaplázia, enyhén megnövekedett számú LGR5 + sejteket lokalizált alján a metaplasztikus kripták (7B ábra, F). Azonban a bél típusú gyomorrák lokalizációját és számos LGR5 + sejtek feltűnően megváltozott. A gyomorrák, LGR5 + sejtek is jelen volt a lumen felé néző felszínén (ábra 7C, G), a tumor közepén (a lumen felé néző felszínén és invázió elöl) és az inváziós front (7D ábra). Még érdekesebb, hogy a eloszlása ​​LGR5 + gyomorrák sejtek mutattak megkülönböztető minták: a LGR5 + sejtek történt összetartó foltokban változó számú tumorsejtek kezdve < 10, 10-50 és még > 50 tumorsejtek gyakran alakítás gradiensek csökkenő festési intenzitást. A teljes elosztása ezek LGR5 + tumorsejtek foltok egyenetlen volt, és inhomogén. Együttesen növekedését tapasztaltuk a száma és intenzitása LGR5 + sejteket a nem neoplasztikus hámban a gyomorrák támogató a valós idejű RT-PCR és immunhisztokémiai adatok a párosított (nem neoplasztikus versus neoplasztikus) beteg (lásd Asztal 1). Eredményeink a megváltozott eloszlását LGR5 + sejtek leírtakkal összhangban Takeda et al. a colorectalis rák [26].}

expresszióját LGR5 Intestinalis típusú gyomorrák korrelál a helyi tumornövekedést, és csomóponti terjedését

Feltételezik, hogy a CSC befolyás beteg prognózisa, hogy képesek alkotnak tumor sejt telepek, nélkülözhetetlen előfeltétele áttétet és a betegség kiújulását. Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a jelentősége LGR5 gyomorrák, korreláltuk kifejezése LGR5 intestinalis típusú gyomorrák különböző klinikopatológiai beteg jellemzőit.

• PLoS One: Csökkent szintű aktív Smad2 korrelál rossz prognózissal gyomorrákban
• PLoS One: Glyoxalase-én egy új prognózisa tényező kapcsolódó gyomorkarcinóma Progression