PLoS ONE: LAPTM4B-35, vėžys-Susiję Genų, yra susijusi su prasta prognoze TNM Etapai I-III Skrandžio vėžiu sergantiems pacientams

Anotacija

Fonas

Lizosomos susijęs transmembraninis baltymas 4β-35 (LAPTM4B-35), iš žinduolių 4-tetratransmembrane apimanti baltymų superfamily narys, buvo pranešta, kad ekspresija į keli vėžio. Tačiau iš LAPTM4B-35 išraiška ir jos vaidmuo skrandžio vėžiu (GC) progresavimo lieka nežinoma. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti LAPTM4B-35 raišką GC per skrandžio kancerogenezėje galimą jo poveikį į clinicopathologic parametrus ir vaidmenį LAPTM4B-35.

metodų

Šios studijos, parafino išanalizuoti -embedded bandiniai su GC (n = 240, įskaitant 180 suporuotas egzempliorių) ir 24 suporuoti šviežios šaldytos audinius. KRL-PGR ir imunohistocheminis (IHC) buvo naudojami analizuoti LAPTM4B-35 raišką GC. Į LAPTM4B-35 poveikis GC ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazijos lėmė padidėjusi ir triuškinantis tyrimus.

Rezultatai

IHC parodė, kad LAPTM4B-35 buvo išreikštas 68,3% (123/180 ) GC audinių, o 16,1% (29/180) jų suporuotas gretimų noncancerous skrandžio audinių ( P
= 0,000). LAPTM4B-35
mRNR lygių GC audinių taip pat buvo ženkliai padidėjusi, lyginant su jų suporuotas gretimų noncancerous audinių ( P
= 0,017). Padidėjusi LAPTM4B-35 buvo reikšmingai susijęs su diferenciacijos laipsnis, gylis invazijos, lymphovascular invazija ir limfmazgių metastazių ( P
< 0,05). Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės parodė, kad pacientams, sergantiems LAPTM4B-35 išraiška turėjo reikšmingai sumažėjo bendrojo išgyvenamumo (OS) etapais I-III GC pacientams ( P
= 0,006). Daugiamatė analizė parodė, aukštos raiškos LAPTM4B-35 buvo nepriklausoma prognostinis faktorius OS etape I-III GC pacientų ( P
= 0,025).

Išvada

Šios išvados rodo, kad LAPTM4B-35 raiška gali būti susiję su GC progresavimo ir prastos prognozės, taigi gali tarnauti kaip naujos prognozės žymuo prognozės GC pacientų

nurodomoji dalis:. Cheng X Zheng Z "Bu Z, VU X , Zhang L, Xing X, ir kt. (2015) LAPTM4B-35, vėžys-Susiję Genų, yra susijusi su prasta prognoze TNM Etapai I-III skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. PLoS ONE 10 (4): e0121559. Doi: 10,1371 /journal.pone.0121559

Akademinė redaktorius: Ken-Ichi Mukaisho, Shiga universiteto Medicinos mokslo, Japonija

Įstojo: Balandžio 10, 2014 m Priėmė: Vasario 12, 2015 m Paskelbta: Balandžio 7, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Cheng et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas: Šis darbas buvo remiamas Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (ir Nr 30.471.677 81141024) ir Nacionalinės pagrindinė technologija R & d programa (Pekino savivaldybės Mokslas ir technologijos. Projektų Z121100007512010). Į finansuotojai prisidėjo prie tyrimo projektavimo, vykdymo, reagentų, medžiagų, duomenų analizės ir sprendimų skelbti

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra trečia labiausiai paplitusi vėžio Kinijoje ir pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių Kinijoje [1]. GC dauguma pacientų yra jau pažengę į diagnozę (III stadijos ir IV), o todėl, kad prognozės būtų niūrus, nors pagerinti chirurginės ir pagalbiniam gydymui požiūrį [2-5]. Nepriklausomai nuo chemoterapijos ir numatomą chirurginio gydymo, beveik 60% pacientų su GC plėtoti pasikartojimo ir galiausiai miršta metastazavusio [6]. GC progresavimo yra daugiaveiksnė ir daugiapakopį procesą, kuriame paveldėjo ir aplinkos veiksniai vaidina svarbų vaidmenį [7]. Ankstesni stebėjimai rodo, kad klasikinis biologiniai žymenys ir sustojimo sistemos, remiantis klinikinių ir patologinių išvadas, gali turėti savo apribojimus klinikinėje praktikoje ir priversti kurti naujus molekulinius biologinių žymeklių, kurie negali prognozuoti pacientų rezultatus ir gydymą [8, 9].

Lizosomos susijęs baltymas transmembraninis 4 beta (LAPTM4B) buvo iš pradžių klonuotas kepenų karcinoma (HCC) pagal Shao et al, kuri įsikūrusi chromosomos 8q22, regionas dažnai sustiprina krūties vėžio ir HCC [10, 11]. Jis koduoja du baltymus su skirtingomis molekulinio svorio, 24 kDa ir 35-kDa baltymų (LAPTM4B-24 ir -35) su keturiais tariamų transmembranines regionuose [12]. Iš LAPTM4B-35 lokalizacija buvo nustatyta ne tik lizosomose, bet ir plazminės membranos ir vidaus organoidus, pavyzdžiui, Goldžio kompleksas ir endosomes [13]. , Buvo pastebėta, kad LAPTM4B-35 buvo plačiai išreikštas įvairių tipų karcinoma. Ankstesnės ataskaitose nurodyta, kad padidėjusią LAPTM4B-35 yra susijęs su nepalankiomis biologinių elgesį ir blogos prognozės daugeliu vėžio, pavyzdžiui, krūties vėžio [14], HCC [15-17], tulžies pūslės karcinoma [18, 19], tiesiosios žarnos vėžiu [20] , epitelio kiaušidžių karcinoma [21] ir endometriumo karcinoma [22]. Taip pat buvo pranešta, kad Alelių variacijos LAPTM4B buvo susijęs su genetinės jautrumo GC [23]. Be to, padidėjusią LAPTM4B-35 transfekuojant LAPTM4B kDNR skatina ląstelių proliferaciją, migraciją, invazija į HCC audiniuose, nuogas pelių ir skatina atsparumą daugeliui vaistų [24]. Nokdaunas iš LAPTM4B pagal RNR trukdžių atvirkščiai atstatomi visų šių piktybinių fenotipo funkcijų HCC [24, 25].

Tačiau LAPTM4B-35 išraiška, jo tiesioginė sąsaja su clinicopathologic charakteristikas, ir biologinis vaidmuo LAPTM4B-35 GC lieka neaiški. Šioje studijoje, siekėme nustatyti LAPMT4B-35 raišką GC ir galimą jo ryšį su klinikos funkcijų, ir jos prognostinę reikšmę. Be to, in vitro, buvo atliekami funkciniai tyrimai apibūdinti biologinį poveikį LAPTMEB-35 skrandžio tumorogeniš-.

Medžiagos ir metodai

Etika

Visi pacientai pasirašė Informuoto asmens sutikimo gauti audinių mėginius, o tyrimo protokolas buvo patvirtintas klinikinių tyrimų etikos komiteto Pekino universiteto onkologijos ligoninėje.

Žmogaus skrandžio audinio mėginiai

240 (167 vyrų ir 73 moterų iš viso, amžiaus 22-87 metų, o vidutinis amžius buvo 60 metai) formalino fiksuoto parafine GC audiniai, įskaitant 180 suporuotas vėžinėmis ir suderinti gretimų noncancerous skrandžio gleivinės audinius, buvo surinkti iš GC pacientams, kuriems atliekama pašalintas skrandis ne Pekino universiteto onkologijos ligoninės nuo 2003 sausio iki gruodžio 2011. klinikinė ir histologinis informacija kiekvienu atveju taip pat buvo renkami pagal patvirtintas įstaigoje patvirtintas gaires. 1997 metų UICC-TNM kriterijus buvo naudojamas skrandžio vėžio klasifikacija. Mediana tolesnių trukmė nuo diagnozės nustatymo metu buvo 26,2 mėnesiai (diapazonas, 2.4-119.0 mėnesių). Iš viso 112 (46,7%) pacientai mirė sekami.

imunohistocheminis

Parafino skyriai (4 pm) buvo devaškuoto ir rehidratuoti xylem ir etanolio. Imunohistocheminis buvo atliktas anksčiau aprašytas [16], naudojant anti-LAPTM4B-35 antikūnas (1: 200) (gabių Pro LR Zhou.). Kaip neigiama kontrolė, sekcijos buvo apdoroti kaip tokį patį protokolą išskyrus tai, kad jie buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, blokuojančiu tirpalu be pirminio antikūno.

iš LAPTM4B-35 išraiška buvo įvertintas du patyrę patologams (Y saulė ir B Dong), kuris dirbo savarankiškai ir buvo apakinti, kad pacientų klinikinei baigčiai. Neatitikimai tarp stebėtojų buvo rasta mažiau nei 10% tirtų skaidres ir sutarimas buvo pasiektas po papildomo patikrinimo. Dažymo vertinimas buvo tiesiog naudojo pusiau kiekybiniai testo metodus klasifikuoti LAPTM4B-35 išraišką kaip teigiamų ir neigiamų tamsintas imunoreaktyviųjų ląsteles. Iš pozityvumo santykis pelnytas kaip "0" (< 10% teigiamų naviko ląstelės), "" 1 "(10-50% teigiami vėžinių ląstelių) bei" "2" (> 50% teigiamų naviko ląstelės). Dažymo intensyvumas buvo įmuštas kaip "0" (be dažymo ar silpnai tamsintas), "" 1 "(vidutinio dėmių atsiradimas), arba" "2" (stiprus dėmių atsiradimas). Iš dažymo intensyvumo balas ir procentinio balas suma buvo naudojamas apibrėžti LAPMT4B raiškos lygius: 0-2, neigiamą išraišką ir 3-4 teigiamas išraiška (14). Teigiamas išraiška vertinama tik sekcijų su ne mažiau kaip 10% teigiamas plotas navikų.

Mobilusis kultūra, LAPTM4B-35 išraiška plazmidės ir hCas9 /gRNA transfekcija

Skrandžio vėžio ląstelių linijas (SGC- 7901, BGC-823, MSV-803, MKN-28 ir MAA) buvo auginamos DMEM (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Kanada) papildytas 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) (HyClone, Logan, UT, JAV) ir 100 V /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino 37 ° C temperatūroje, yra 5% CO _{2 atmosferoje. pcDNA3
. 0 AF
kuriame visą ORF iš LAPTM4B gamybos LAPTM4B-35 baltymą buvo talentingas prof LR Zhou [11]. Transfekcija buvo atliktas su Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) pagal gamintojo protokolą. Teigiami ląstelių klonai buvo gautas antibiotikų parinkimo su G418 (Gibco, Grand Island, NY), esant 800 ng /ml koncentracija.}

hCas9 ir gRNA vektorius buvo įgytas iš Kinijos zebrafish Resource Center (CZRC). Pilnas ilgis Cas9 kDNR buvo klonuotas į pXT7 vektoriaus ir linearizuota ir apribotos iRNR buvo susintetintas naudojant mMESSAGE mMACHINE iRNR transkripcija sintezės rinkiniai (Life technologies ", Carlsbad, Kalifornija, JAV). Į gRNA gruntas sekas, buvo: į priekį gruntas, 5'-TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 ", ir atvirkštiniai gruntas: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3'.The protokolas buvo po praėjusių paskelbtas popieriaus [26]. hCas9 iRNR (3 ng /pl) ir gRNA (0,2 ng /pl) buvo cotransfected į SGC-7901 ląstelių atlikto Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

RNR išskyrimas, kiekybinis realiu laiku atvirkštinę transkripciją PGR (KRL-PGR)

viso RNR išskirta naudojant TRIzol reagentas (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) ir atvirkštinės transkripcija į kDNR naudojant "M-MLV atvirkštinės transkriptazės (Promega Madison, WI, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant ABI 7500 Greitas realaus laiko PGR sistema (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, JAV). β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Grunto sekas, yra išvardytos žemiau: LAPMT4B-35: pirmyn gruntas: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ", atvirkštinės Gruntas: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3"; β-aktino: pirmyn gruntas: 5'-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 'atvirkštinio gruntas: 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3 "

ląstelių proliferacija tyrimas

ląstelių proliferacija buvo matuojamas Mobilusis Skaičiavimo KIT-8. (CCK-8) (Dojindo, Japonija) pagal gamybos protokole. A 100μl ląstelių suspensijos tūris (3000 ląstelių viename šulinėlyje) buvo inkubuojami 96-šulinėlių plokštelės (Costar, Corning, NY) už 24, 48, 72, 96 val. 10μl iš CCK-8 tirpalo buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojami 3 val esant 37 ° C temperatūroje. tada absorbavimo vertės yra visų šulinių buvo nustatyta ne 450nm su referenciniu bangos 630nm į microplate Reader (Bio-Rad, JAV). Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus ir pakartota du kartus.

Žaizdų gijimo tyrimas

Mobilusis migracija buvo matuojamas žaizdų gijimo tyrimo, kurį IncuCyte HD sistemos (IncuCyte ZOOM, Esenas Bioscience, JAV). Ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių plokštėmis 6 × 10 ^{4 ląstelių viename gerai tankio. Žaizdos buvo per susiliejantis monomolekulinių sluoksnių ląstelių su pin blokas ir ląstelės buvo plaunami 1 × PBS, kultūringas DMEM terpėje su 10% vaisiaus galvijų kraujo serume. Fotografijos ląstelių buvo nufotografuota naudojant IncuCyte HD sistemą 4 valandų intervalais nuo 2 atskirų regionų vienam gerai naudojant 10x tikslą. Vertybės iš 2 regionuose kiekvieną duobutę buvo sujungtos ir vidutiniškai visose 3 kartotinių}

Transwell invazija tyrimai

Transwell (8μm porų dydis; Cell BioLabs, JAV). Tyrimas buvo naudojamas analizuoti ląstelių invazija pagal gamintojo instrukcijas. 8 × 10 ^{4 ląstelės buvo dedamas viršutinių rūmų žiniasklaidoje be serumo, o mažesnės kameros buvo pripildyti DMEM ir 10% FBS. Taip inkubacijos 72 val esant 37 ° C, neinvaziniai ląstelės dėl viršutinio paviršiaus Membranos buvo pašalinta su medvilnės tamponu. Membranos buvo fiksuojami metanoliu 10 min ir nudažomi su 0,5% violetinei 10 min. Ląstelės ant filtro apačioje buvo iš penkių atsitiktinai atrinktų mikroskopiniai peržiūros buvo skaičiuojami.}

Vakarų dėmė analizė

baltymų ekspresijos lygis GC ląstelių linijų buvo matuojamas Vakarų dėmė analizė. Ląstelės buvo lizuoti iš anksto atšaldyti Ripa lizės buferiniame tirpale (Pierce biotechnologijos, Rockford, IL), kurių sudėtyje yra proteazės inhibitorių kokteilis (Roche, Bazelis, Šveicarija) 30 min po centrifugavimo metu 15,000g 20 min, buvo gauta virš nuosėdų. 50μg iš baltymo ekstraktai buvo atskirtos nuo 10% SDS poliakrilamido gelio elektroforezės, ir perkelti ant 0.45μm polivinilideno difluoridą (PVDF) membrana (Whatman, Vokietija). Membrana buvo blokuojamas 1 val kambario temperatūroje su blokuojančiu buferiu (pH 7,6), kurių sudėtyje yra 5% Nonfat sauso pieno, tada inkubuojami su anti-LAPTM4B-35 antikūnas (1: 800; talentingas prof RL Zhou), esant 4 ° C temperatūroje per naktį , Pelės anti-žmogaus β-aktino antikūnas (Santa Krusas Biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija), buvo naudojamas kaip vidaus kontrolė. Imunoreaktyvių juostos buvo ryškinamos naudojant chemiluminescencja aptikimo sistemą (Pierce Biotechnologijos, Rockford, IL).

Statistinė analizė

Chi kvadrato testas buvo naudojamas palyginti į LAPTM4B-35 baltymo raiškos tarp GC skirtumo audiniai ir gretimų noncancerous audiniuose. Besąlyginė logistinė regresinė analizė modeliai buvo naudojami analizuoti ryšius tarp LAPTM4B-35 raiškos ir klinikos parametrų pakoreguotų pagal lytį statusą. Iš LAPMT4B-35
iRNR raiška tarp GC ir gretimų noncancerous audiniuose buvo analizuojamos Vilkoksono skirtumas suderinta pora testą.

Bendras išgyvenamumas (BI) kreivė buvo apskaičiuojamas Kaplan-Meier metodu ir analizuojami su log-rank testą. Santykinę riziką (RRS) mirties, susijusios su LAPTM4B-35 raiškos ir kitų Predictor kintamųjų buvo įvertintas pagal vieną požymį Cox proporciniai pavojų modelio Pirma. Daugiamatė Cox modeliai taip pat buvo pastatyti įvertinti už LAPMT4B-35 raiškos RR. Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS programinę įrangą statistinį paketą (versija 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). Dvipusis, P
vertė mažesnė nei 0,05 buvo laikomas statistinio reikšmingumo.

Rezultatai

išraiška analizė LAPTM4B-35 GC ląstelių linijas ir GKS

Pirma išnagrinėjo LAPTM4B-35
RT-PCR 5 GC ląstelių linijas (MSV-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901 ir AGS), tada aptiko išraišką jos baltymo ekspresija Vakarų dėmė. Rezultatai parodė, kad LAPTM4B-35 buvo išreikštas visų ląstelių linijų tiek mRNR ir baltymų koncentracijos (pav 1A, viršutinė ir apatinė skydelio), tada mes pasirinkome bgc-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląsteles mūsų šių ląstelių funkcijos tyrimų.

LAPTM4B-35
išraiška buvo taip pat aptikta 24 porų rezekcijos GC pavyzdžius KRL-PGR. Kaip matome iš pav 1B, LAPTM4B-35
išraiška GC audiniuose buvo gerokai padidėjusi, lyginant su suporuotas gretimų noncancerous audinių ( P
= 0,017) (pav 1B).

LAPTM4B-35 baltymo ekspresija buvo dažnai pastebėta žmogaus GC

tyrė LAPTM4B-35 GC ir gretimų noncancerous audinių išraišką naudojant imunohistocheminio analizė. LAPTM4B-35 nebuvo išreikšti įprastu skrandžio gleivinės (pav 2A), tačiau išreikšti žarnyno metaplazijos, displazija pažeidimui (duomenys buvo neparodyta) ir naviko ląstelės, ir daugiausia lokalizuotas citoplazmoje arba ant ląstelės membranos (pav 2B ir 2D -2H). LAPTM4B-35 dažnai stebimas GC audinių palyginti su suderinta gretimame noncancerous gleivinės (68,3% vs 16,1% P
= 0,000) (1 lentelė).

Santykiai tarp LAPTM4B-35 raiškos ir klinikos charakteristikos

analizavo tarp LAPTM4B-35 raiškos ir klinikos ypatybių GC pacientų santykius. Kaip lytį, kad mūsų tyrimo objektai turi savo nuokrypis (167 vs 73, 2 lentelė), apskaičiavome savo santykius pagal logistinės regresijos analizės ir koreguojami už lyčių statuso. LAPTM4B-35 buvo dažniau pastebėti prastai diferencijuoti GCS palyginti su vidutinio gerai diferencijuotų tie (65,4%, palyginti su 57,9% P
= 0,017). Be to, LAPTM4B-35 išraiška buvo susijęs su lymphovascular invazijos ( P
= 0,000), gylis invazijos ( P
= 0,016) ir limfmazgių metastazių ( P
= 0,029) (2 lentelė).

LAPTM4B-35 išraiška ir prognozė GC pacientai

3 pav vaizduoja LAPTM4B-35 raiškos ir klinikinių rezultatų analizė. Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės parodė ten buvo trumpesnį bendro išgyvenamumo tendencija (OS) GC pacientams, sergantiems LAPTM4B-35 teigiamu išraiška, palyginti su neigiamomis tie ( P
= 0,064, log-rank = 3,425) (Pav 3A). Po pacientai buvo suskirstyti pagal TNM I-III ar pacientų be lypmphovascular invazijos, pacientai, sergantys LAPTM4B-35 teigiamu išraiškos parodė žymiai trumpesnį OS nei tų neigiamus ( P
= 0,006 ir P
= 0,001 ., atitinkamai) (pav 3B ir 3D)

apie Vienaveiksnės ir daugiamatis Cox modelių OS GC pacientų TNM stadija I-III rezultatų eksponuojami kad invazijos gylis (SR = 3,103, 95% PI: 1,427 -6,748 P
= 0,004), limfmazgių metastazės (SR = 3,015, 95% PI: 1,552-5,858; P
= 0,001) ir LAPTM4B-35 išraiška lygis (SR = 2,249 , 95% PI: 1,242-4,072; P
= 0,007) reikšmingai paveikė GC, atitinkamai (3 lentelė) išlikimą; Be to, LAPTM4B-35 teigiamas išraiška buvo nepriklausoma prognostinis faktorius (SR = 1,897, 95% PI: 1,041-3,457; P
= 0,025). Limfmazgių metastazės (SR = 2,665, 95% PI: 1,362-5,213; P
= 0,001), taip pat nepriklausomai prognozuojama OS (3 lentelė)

LAPTM4B-35 paaukštintas naviko ląstelių proliferaciją

kad būtų ištirtas LAPMT4B-35 poveikį ląstelių biologijos funkciją, buvo nustatytos dvi ląstelių linijos. BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių pristatantys santykinai didesnę arba mažesnę raišką ir LAPTM4B-35 buvo atskirai pasirinktas raiškos ir triuškinantis tyrimo (pav 1A). Pirmajame, ląstelių linijos BGC-823 AF ekspresija LAPTM4B-35 stabiliai buvo įkurta, ir maketas buvo naudojamas kaip šios ląstelių linijos kontrolę. Antra, LAPTM4B-35 buvo stabiliai nuvertė towarding į SGC-7901 (hCas9 /gRNA) pagal II tipo susitelkę reguliariai per tarpą trumpi palindromic kartojasi (CRISPR) sistemos, o rezultatai buvo nustatyti Vakarų dėmė (pav 4A).

Jei ląstelių proliferacija tyrimas buvo matuojamas CCK-8 ląstelių skaičiavimo rinkinys. Sugeriamumo vertė BGC-823-AF ląstelių 72 val po plinta buvo gerokai didesnis nei tų tėvų ląstelių ir Mock ląstelių, ir rezultatas buvo priešais beldžiasi žemyn LAPTM4B-35 SGC-7901 ląstelių (pav 4b).

LAPTM4B-35 patobulintas naviko ląstelių migracija ir invazija gebėjimas

Po transfekciją su pcDNA3.0-AF ir hCas9 /gRNA, mes atliekame žaizdų gijimo tyrimą analizuoti migracijos gebėjimas LAPTM4B-35 daugiau ekspresijos /Klojinius išardomi skrandžio vėžio ląstelių (pav 5a). Rezultatai parodė, kad LAPTM4B-35 paaukštintas BGC-823 (BGC-823-AF) ląstelių migraciją, palyginti su BGC-823 ir Mock ( P
< 0,05), o žemyn reguliavimo LAPTM4B-35 išraiška galėtų pakeisti šį reiškinį SGC-7901 ląstelių ( p
< 0,05, pav 5B)

Todėl LAPTM4B-35 poveikis naviko ląstelių invazijos buvo tiriamas naudojant transwell tyrimą. (pav 6A). Mes nustatėme, kad įsiveržė ląstelių skaičius buvo gerokai didesnė LAPTM4B-35-perkeltų bgc-823 ląstelių ir mažesnis į triuškinantis SGC-7901 ląstelių, nei jų kontrolinių ląstelių, atitinkamai ( P
< 0,05, pav 6B). Šie rezultatai rodo, kad LAPTM4B-35 skatina migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląsteles.

Diskusijos

GC yra labai nevienalytė liga, kai net panašūs klinikiniai ir patologiniai bruožai sąlygoti skirtingų rezultatų [27, 28], kurioje nurodoma, kad TNM GC turi savo apribojimus ir priversti ieškoti naujų molekulinių biologinių žymenų, kurie gali prognozuoti paciento rezultatus ir gydymą. Onkogenas LAPTM4B-35 yra chromosomos 8q22 ir pelnas DNR kopijų skaičiaus chromosomos 8q22 yra dažna išvada GC pagal mūsų ankstesniame tyrime (neskelbtų duomenų). Krūties vėžiui, raiškos ir LAPTM4B-35 ir 8q22 amplifikacija buvo prisidėjo prie de Nove
Atsparumas cheminėms antraciklinų ir yra liberalus metastazavusio pasikartojimo [29].

Šiame tyrime mes ištirti LAPTM4B-35
raiška 24 skrandžio vėžiu ir jų suporuotas noncancerous skrandžio chirurginės pavyzdžius KRL-PGR ir nustatė, kad LAPTM4B-35
iRNR raiška lygis skrandžio vėžio buvo žymiai padidėjęs, palyginti su į suporuotas noncancerous audinių grupė. Be to, imunohistocheminis analizė 180 porų skrandžio vėžio parodė LAPTM4B-35 buvo ekspresija GC audinių (68,3%), palyginti su jų suporuotas noncancerous gleivinės (16,1%). LAPTM4B-35 skatina naviko augimą ir toleranciją į medžiagų apykaitos ir genų streso per autofagija indukcijos [30, 31]. Mūsų dabartinės tyrime LAPTM4B funkcija skrandžio vėžio buvo tiriamas in vitro tyrimais. Padidėjusi LAPTM4B-35 BGC-823 ląstelių, taip pat padidėjo ląstelių gyvybingumą serumo nemokama kultūros sąlygomis, taip pat. Jei šis reiškinys sukelia autophage reikia būti tiriami.

Be to, mes taip pat analizavo LAPTM4B-35 raiškos sąsajas su klinikos parametrų skrandžio vėžio. Aukštos LAPTM4B-35 išraiška reikšmingai koreliavo su diferenciacijos laipsnis, lymphovascular invazijos, gylis invazija ir limfmazgių metastazių, tai rodo, kad LAPTM4B-35 gali būti plačiai aktyvuota skrandžio vėžio ir gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio kancerogenezėje ir naviko progresavimas. Kaip navikas lymphovascular invazija ir lymphonode metastazės yra labai svarbūs klinikiniai prognostiniai rodikliai auglio augimą, mes padarėme išgyvenamumo analizė. Kaplan-Meier kreivė skirstyta pagal LAPTM4B-35 raiškos ir naviko stadijos ar lymphovascular invazijos atskleidė, kad LAPTM4B-35 teigiami pacientai turi gerokai skurdesnių OS palyginti su LAPTM4B-35 neigiamus į TNM etapuose I-III arba be lymphovascular invazijos pogrupyje. Daugiamatė Cox regresinė analizė šiame pogrupyje parodė, kad tarp visų analizuojami veiksniai, LAPTM4B-35 išraiška yra nepriklausoma prognostinis faktorius skrandžio vėžiu sergantiems pacientams TNM etapai I-III, bet IV stadijos. Ji yra pagrįsta, nes pacientas IV stadijos yra negali gauti radikalų veikimą ir gali būti gydomi daugelis kitų skirtingų paliatyviosios gydymo, visi iš kurių būtų kokią įtaką prognozė. Šie rezultatai rodo, kad už LAPTM4B-35 polinkis gali specialiai prognozuoja labiausiai agresyvus ir mirtinų tipų skrandžio vėžio atvejų anksčiau laiko ir be distalinio metastazių arba be lymphovascular invazijos.

Mūsų Šio tyrimo, mes nustatėme, kad LAPTM4B -35 teigiamas išraiška paprastai susijęs su blogesne prognoze GC pacientų skirstyta pagal naviko stadijos ar lymphovascular invazijos. Už LAPTM4B-35 funkcija GC, mes toliau atlikti in vitro tyrimo. Padidėjusi LAPTM4B-35 BGS-823 ląstelių atskleidė gerokai padidinti ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija, ir žemyn reguliavimo LAPMT4B-35 švinu priešingus rezultatus. Zhou ir kt. parodė, kad LAPTM4B-35 raiška skatina ląstelių išgyvenimą, nereguliuojamoje platinimu ir migracija HCC ląstelių [12]. Naujausi tyrimai, pranešė, kad LAPTM4B-35 buvo reikšmingai susijęs su blogesne ligos baigties daugelyje žmogaus piktybinių navikų, tokių kaip HCC [16], metastazavusiu kiaušidžių naviko [32], tulžies pūslės [19, 33], kepenyse cholangiokarcinoma [34] ir endometriumo vėžio [22]. Šių sukauptų įrodymų paremti mūsų dabartinėmis išvadomis, nurodydama, kad LAPTM4B-35 raiška gali vaidinti svarbų vaidmenį piktybinę transformaciją ir progresavimo GC.

molekuliniai mechanizmai LAPTM4B-35 naviko progresavimas savybių vis dar yra neaišku. Kai ankstesni tyrimai parodė, kad LAPTM4B-35 reikalingas Lizosomos Homeostazė, rūgštėjimo ir funkcijos, ir kad LAPTM4B-35 teikia navikines ląsteles, atsparias Lizosomos tarpininkaujant ląstelių mirtis sukėlė aplinkos ir genotoksinį įtempiai [30, 31]. Padidėjusi LAPTM4B-35 gali įjungti keletą prokalbės onkogenų, pavyzdžiui, C-myc, C-jun ir C-fos [35], ir skatinti proliferaciją, migraciją, ir invazija į kai kuriuos žmogaus vėžio linijų, kurios padidintų augimą ir metastazes HCC ksenoimplantai nuogas pelių [36]. Susiję tyrimas leido suprasti, kad LAPTM4B gali pagerinti ląstelių proliferaciją ir išlikti per į signalo perdavimo būdas, dalyvavimo, pavyzdžiui, fosfatidil 3 kinazės baltymų kinazės B keliu. Ir LAPTM4B-35 gali sąveikauti su kai kuriais vėžio susijusių baltymų, pavyzdžiui, baltymų fosfatazės 2A ir baltymų kinazės C [10]. Li ir kt nustatė, kad LAPTM4B-35 motyvuoja atsparumą vėžinių ląstelių daugiskaitos skatinant narkotikų efliuksą ir anti-apoptozę aktyvuojant PI3K /AKT signalizacijos [24] rodo, kad LAPTM4B-35 gali būti naujas tikslas terapija. Funkcinis vaidmuo ir mechanizmas LAPTM4B GC reikia atlikti papildomus tyrimus.

Taigi, dabartinis tyrimas rodo, kad LPTM4B-35 raiška vaidina svarbų vaidmenį skatinant ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija skrandžio vėžio. LAPTM4B-35 teigiamas išraiška skrandžio vėžio audiniuose susijęs su prasta rezultatus ir įrodė, kad yra nepriklausoma prognostinis faktorius pogrupyje GC pacientui TNM etapuose I-III arba be lymphovascular invazijos. Taigi, LAPTM4B-35 gali būti naudinga biologinis prognozuoti prognozės kai kuriose pogrupio GC. Be to, kaip LAPTM4B-35 vaidmenų apriboti Lizosomos tarpininkaujant ląstelių žūtį ir skatinti autofagija turėti reikšmingą išgyvenimo poveikį vėžio ląsteles ir LAPTM4B-35 buvo per išreikštas Didelė dalis skrandžio vėžiu, ji gali būti naudinga taikinys gydyti potipio grupę skrandžio vėžio.

Pagalbinė informacija
S1 duomenų rinkinį. Individualūs rezultatai santykinio mRNR iš LAPTM4B-35 raiškos, ląstelių dauginimosi, migracijos ir invazijos, išlikimo pathients ir klinikos features.
(Excel)
doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001
(XLS)

Acknowledgments

We ačiū Guoshuang Feng (nuo Kinijos centro ligų kontrolės ir prevencijos) dėl savo pobūdžio pagalbą duomenų statistiką.

• PLoS ONE: Padidėjusi receptoriaus Pažangiosios Glycation Endproducts (Rage) yra susijęs su blogos prognozės skrandžio Cancer
• PLoS ONE: poveikis naviką Expression Lygiai fluoropirimidino metabolizmą fermentų gydymo rezultatus pagalbinių medžiagų S-1 terapijos skrandžio Cancer