Achtergrond
MicroRNAs (miRNAs) worden op grote schaal onderzocht niet-coderende RNA's die genexpressie moduleren. MiRNAs gedereguleerd in verschillende tumoren, waaronder maagkanker (GC) en hebben een potentiële diagnostische en prognostische implicaties. Het doel van deze studie was om miRNA profiel GC weefsels, gevolgd door onderzoek van ontregelde miRNAs in plasma van patiënten met GC te bepalen. Met behulp van beschikbare databases en bioinformatica methoden die we ook gericht op het potentieel doelwit genen van differentieel bevestigd uitgedrukt miRNA evalueren en valideren van deze bevindingen in GC weefsels.
De studie omvatte 51 GC patiënten en 51 controles. In eerste instantie, we gescreend miRNA expressie profiel in 13 weefselmonsters van GC en 12 normale maag weefsels met TaqMan lage dichtheid array (TLDA). In de tweede fase werden differentieel tot expressie miRNAs gevalideerd in een replicatie cohort behulp qRT-PCR in weefsel en plasma monsters. Vervolgens analyseerden we potentieel doelwit genen van gedereguleerde miRNAs met behulp van bioinformatica aanpak, hun expressie in GC weefsels bepaald en uitgevoerd correlatie-analyse met targeting miRNAs.
Profilering met TLDA onthuld 15 gedereguleerd miRNAs in GC weefsels in vergelijking met normale maagslijmvlies. Replicatie analyse bevestigde dat miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p en miR-375 werden consistent gedereguleerd in GC weefsels. Analyse van plasmamonsters GC patiënten toonde significante neerwaartse regulatie van miR-148a-3p, miR-375 en up-regulatie van miR-223-3p in vergelijking met gezonde proefpersonen. Verder, met behulp van bio-informatica tools die we geïdentificeerd targets gerepliceerde miRNAs en uitgevoerd ziekte-geassocieerde gen verrijking analyse. Uiteindelijk hebben we geëvalueerd potentieel doelwit-gen BCL2 Kopen en DNMT3B Onze studie bleek miRNA profiel in GC weefsels en toonde aan dat miR-148a-3p, miR-223-3p en miR-375 worden gedereguleerd in GC plasma monsters, maar deze circulerende miRNAs toonde relatief zwakke diagnostische prestaties als enige biomarkers. Target-gen analyse toonde aan dat BCL2 Kopen en DNMT3B Visum:. Juzėnas S, Saltenienė V, KUPČINSKAS J, A Link , Kiudelis G, Jonaitis L, et al. (2015) Analyse van ontregelde microRNA's en hun target genen bij maagkanker. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10.1371 /journal.pone.0132327 Editor: Lin Zhang, Universiteit van Pennsylvania School of Medicine, VERENIGDE STATEN Ontvangen: 22 april 2015; Geaccepteerd: 13 juni 2015; Gepubliceerd: 14 juli 2015 Copyright: © 2015 Juzėnas et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden Financiering:. Dit werk van JK, LJ, Siju, LK, JS werd gesteund door het Europees Sociaal Fonds No. VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Het werk van PM wordt ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek in het kader van ERA-Net PathoGenoMics. Grant No: BMBF-0315905D. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie De ontdekking van microRNA (MiRNAs) en de vestiging van hun rol in de moleculaire pathways heeft een enorme vooruitgang gebracht in de moleculaire biologie [1] [2]. Deze kleine niet-coderende RNA's omvat ~ 22bp zijn betrokken bij post-transcriptionele regulatie van genexpressie. MiRNAs worden gekenmerkt door een hoge stabiliteit in biologische monsters in deze moleculen een aantrekkelijk doelwit biomerker onderzoeksgebied [3] [4]. Accumuleren bewijsmateriaal blijkt dat miRNAs betrokken zijn bij grote carcinogenese pathways [5]. Eerdere studies hebben aangetoond dat deregulering van miRNAs treedt vrijwel alle belangrijke soorten van kanker [5] [6]. Voorts zijn miRNAs aangetoond dat het een diagnostische of prognostische rol en ook potentiële klinische implicaties voor gerichte gentherapie bij kankerpatiënten [7] [8]. De incidentie van maagkanker (GC) in de westerse landen heeft daalde de afgelopen decennia; Dit type kanker nog steeds goed voor bijna een miljoen nieuwe ziektegevallen wereldwijd en heeft een zeer hoog sterftecijfer [9]. Recent onderzoek naar GC heeft veel nieuwe inzichten onthuld in de pathogenese van deze maligniteit. Toch is de exacte mechanismen van kwaadaardige transformatie van Helicobacter pylori De cruciale rol van miRNAs in GC werd aangetoond in verschillende studies [12]. Volinia et al. hebben ontvangen een van de eerste miRNA expressieprofielen in GC weefsel met een specifiek patroon deregulering [13]. Verdere studies hebben ook gemeld significante deregulering van miRNAs die behoren tot miR-17, miR-21, miR-223, miR-135 en vele andere gezinnen. Onder gemeld studies in GC weefsels, miR-21, miR-25, miR-92, miR-223 waren de meest consistent up-gereguleerd miRNAs, terwijl miR-375 en miR-148 waren de meest consistent down-gereguleerd [14] [ ,,,0],15] [16]. De meeste van deze studies hebben gekeken naar miRNA profiel bij patiënten met GC en gekoppeld aangrenzend normaal maagslijmvlies [14]. Belangrijke studies hebben aangetoond dat miRNAs reeds in een vroege maagkanker waaronder H Wat zijn gedereguleerd. pylori Het doel van onze huidige studie was om miRNA profiel in het GC weefsels te bepalen en te vergelijken met de normale gezonde maagslijmvlies met behulp van een brede dekking miRNA TaqMan lage dichtheid arrays. In verdere analyse, hebben we geprobeerd om onze profilering resulteert in weefsel en plasma van een grotere groep van GC-patiënten en gezonde controles van Europese afkomst te valideren. Uiteindelijk, evalueerden we de potentieel doelwit genen van bevestigde differentieel tot expressie miRNA en uitgevoerd ziekte-vereniging gen verrijking analyse van hun target genen. Ethics statement De studie werd goedgekeurd door de Kaunas Regional Research Ethics Committee Biomedical (Protocol nr BE-2-10). Alle patiënten tekenden een informed consent formulier om deel te nemen aan het onderzoek. weefselmonsters werden prospectief verzameld tussen 2011 en 2014 in de afdelingen Maag-, Darm- en Chirurgie, Ziekenhuis van de Litouwse University of Health Sciences (Kaunas, Litouwen). De studie omvatte een totaal van 51 controlepersonen en 51 GC patiënten, die werden verdeeld in de profilering (GC, n = 13; controles, n = 12) en validatie cohorten (GC, n = 38; controles, n = 39). Alle proefpersonen waren van Europese afkomst. Gastrische biopsie monsters werden verkregen uit antrale deel van de maag van controlepersonen die zijn bedoeld voor de bovenste GI endoscopie wegens dyspeptische symptomen en had geen voorgeschiedenis van maligniteit. GC weefselmonsters werden verkregen uit chirurgische monsters direct na resectie van patiënten die primaire chirurgie voor GC zonder preoperatieve bestraling en chemotherapie ondergaan. Maagdarmkanker in GC patiënten werd geverifieerd door histologie en ingedeeld naar Lauren in diffuus en intestinale soorten [22]. H Weefselcollecties voorbereiding en RNA-extractie Gastric weefselmonsters werden opgeslagen in RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) bij + 4 ° C en 24 uur later bewaard bij -80 ° C. 30 mg weefsel werd gehomogeniseerd in steriele staat voor totale RNA-isolatie met Mirvana miRNA Isolatie Kit (Ambion, Austin, TX, USA) voor het profileren van studie en miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) voor valideringsonderzoek volgens de fabrikanten instructie. De kwaliteit van RNA werd bepaald met de Nanodrop 2000 spectrofotometer (Thermo Scientific, USA). Kwaliteitsbeoordeling moeten RNA integriteit werd uitgevoerd door elektroforese op agarosegel (5%). Plasmamonsters werden verzameld van gezondheid en patiënten met GC. Het miRNA expressie in plasma cohort van plasmamonsters van 38 maagkanker patiënten en 39 gezonde vrijwilligers. Veneus bloed werd verzameld in EDTA antistolling vacuümbuizen en werd gecentrifugeerd bij 3500 rpm gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur; afgescheiden plasma werd overgebracht naar 1,5 ml buisjes en in een -80 ° C vriezer voor kortstondige opslag. Kleine RNA's werden geëxtraheerd van 200 pi plasma met de miRNeasy serum /plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) volgens instructies van de fabrikant. miRNA profilering werd uitgevoerd met de TaqMan Array Human Mirna Card Een v2.1 die nodig om 377 menselijke miRNAs gecatalogiseerd in miRBase v20 [23] te kwantificeren. Kort samengevat, 350 ng totaal RNA werd eerst reverse getranscribeerd met de Megaplex RT ingesteld pool Een versie 2,1 (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) en 800 pi cDNA werd daarna geladen op de TaqMan Array Human miRNA Card en draaien op de VIIA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Primaire analyse werd uitgevoerd met behulp van VIIa 7 Software (Applied Biosystems) tot expressie komen in termen van Ct. Gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp Bioconductor HTqPCR pakket [24]. MiRNAs met een Ct-waarde > 37 werden beschouwd onversterkt. MiRNAs die niet werden geamplificeerd in meer dan 25% van de monsters werden beschouwd als laag worden uitgedrukt en dus uitgesloten van verdere analyse. MiRNA expressie data werd genormaliseerd met behulp van rang invariant normalisering. NormFinder en geNorm algoritmen werden gebruikt om een referentie-gen te identificeren van TLDA gegevens ter validatie studie [25]. Volgens de algoritmes miR-127-3p toonde laagste Ct variantie en werd gekozen als een referentie-gen voor de validatie studie. Recente studies tonen aan dat de expressie van RNU6A en enkele andere kleine nucleaire RNA instabiel in bepaalde weefsels en voorwaarden zou kunnen zijn en kunnen niet dienen als beste referentie genen [26] [27] [28] [29]. Een recente publicatie is ook geïdentificeerd miR-127-3p als een goede kandidaat voor referentie-gen selectie [30]. Reverse transcriptie (RT ) reacties werden uitgevoerd met TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) en miRNA-specifieke RT stamlus primers (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA). Singleplex reacties werden uitgevoerd in een volume van 7,5 pl uitgevoerd. Elke reactie omvatte 2,08 ul nuclease vrij water, 0,74 ui 10 × RT buffer, 0,08 pl dNTPs (100 mM), 1,5 pi 5 × miRNA-specifieke RT primers, 0,1 ui RNase inhibitor, 0,5 ul Multiscribe reverse transcriptase en een vast volume van miRNA template (2,5 ui). gedurende 30 minuten met een houden bij 4 ° C 16 ° C, 42 ° C gedurende 45 min en 85 ° C gedurende 5 min, gevolgd TaqMan real: RT werd uitgevoerd in een thermocycler onder de navolgende omstandigheden. -tijd PCR reacties werden in duplo reacties omvattende 6,25 pi TaqMan 2 × Universal PCR Master mix met nr AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) 0,625 gl 20 x miRNA-specifieke primer en probe-mengsel van de TaqMan miRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA), 3 pi van de reverse transcriptie product en 2,625 ul nuclease vrij water. 95 ° C gedurende 10 min, vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 60: RT-PCR werd uitgevoerd onder toepassing van een 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) onder de volgende omstandigheden ° C gedurende 60 s, gevolgd door een greep bij 4 ° C. Elk monster werd in duplo. De gegevens werden geanalyseerd met automatische instellingen voor het toekennen van de basislijn, en de gemiddelde Ct en SD-waarden werden berekend. De expressie niveau van miRNA in het weefsel werd genormaliseerd naar miR-127-3p en de expressie niveau in plasma was genormaliseerd tot HSA-miR-16-5p. De resultaten werden berekend volgens de methode ΔΔCT [31]. De gegevens werden geanalyseerd met automatische instellingen voor het toekennen van de basislijn, en de gemiddelde Ct en SD-waarden werden berekend. cDNA voor BCL2 Kopen en DNMT3B De lijsten van gevalideerde doelwit genen van de kandidaat-miRNAs werden verkregen uit miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) en miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) databases. Gene-ziekte vereniging gegevens werden opgehaald uit de DisGeNET database (http://www.disgenet.org/). Om GC-geassocieerde genen, de term "adenocarcinoom" (UMLs: C0278701) werd gebruikt als query voor de database. Biologische netwerken zijn gemaakt met Cytoscape v3.2 open-source software met CyTargetLinker toepassing [32]. De klinische kenmerken tussen groepen werden vergeleken met behulp van de χ miRNA expressie profilering van GC en gezond maagslijmvlies weefsel door TLDA TaqMan Human miRNA Low-Density array analyse werd uitgevoerd om kandidaat miRNAs vertonen veranderde expressie bij maagkanker weefsel identificeren. Weefsel miRNA profielen van GC patiënten werden vergeleken met profielen van gastrische mucosa van gezonde individuen. Na filtering voor lage overvloedige miRNAs (Ct-waarde > 37 en niet-detecteerbaar in meer dan 25% van de monsters), een set van 193 miRNAs (van in totaal 377) bleef voor verdere analyse. Een vergelijking van kankercellen versus normaal weefsel geïdentificeerd 15 differentieel tot expressie miRNAs, waarvan 7 werden up-gereguleerd en 8 werden down-gereguleerd met FDR aangepast p-waarde < 0,01 en vouw verandering > 2 (tabel 2). De resultaten worden aangetoond in vulkaan grafiek (figuur 1). Onder deze, 6 miRNAs (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-375, miR-223-3p en miR-155-5p), met de hoogste betekenis en vouw verandering waarden, werden geselecteerd voor de validatie studie. Hiërarchische clustering onder Euclidische afstand van geselecteerde miRNA expressie genormaliseerde gegevens duiden twee subgroepen: die overeenkomt met de controlegroep en de tweede in hoofdzaak overeenkomt met de patiëntengroep. (Figuur 2). De zes kandidaat miRNAs geselecteerd voor de verificatie werden gekwantificeerd met behulp van qRT-PCR. Ter referentie-gen selectie werd het TLDA gegevens geanalyseerd met behulp van twee verschillende algoritmes (NormFinder en geNorm) te verwijzen genen te identificeren. MiR-127-3p toonde hoogste uitdrukking stabiliteit in alle monsters in TLDA data en vanwege deze functie miR-127-3p werd gekozen als een referentie-gen om qPCR data te normaliseren. De expressieniveaus van miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p en miR-375 bleek significant differentiële expressie in dezelfde richting als in de ontdekking onderzoek (FDR aangepast p < 0,05), terwijl geen significante verschillen werden ontdekt in de expressie van miR-135a-5p en miR-155-5p (FDR aangepast p > 0,05; figuur 3) Plasma miRNAs als potentiële biomarkers voor maagkanker Doel genpredictie Om verder te onderzoeken van de mogelijke doelwitten van miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223- 3P en miR-375, al hun experimenteel gevalideerde miRNA-doelwit interacties werden verkregen uit twee verschillende databases (miRTarbase en miRecords). De gegevens werden gevisualiseerd in Cytoscape als biologisch netwerk waarin alle genoemde miRNAs en hun targetinteracties (figuur 5). Elke interactie in het netwerk bestond uit twee knooppunten, een regelgevend miRNA knooppunt (rood) en een doelwit mRNA knooppunt (roze), verbonden door een gerichte rand. Over het algemeen, het netwerk opgenomen gevalideerde targets 593, 419 van hen zijn toegewezen aan miR-375, 88 toegewezen aan miR-204-5p, 83 toegewezen aan miR-148a-3P en 21 toegewezen aan miR-223-3p. Het netwerk analyse toonde aan dat miR-148a-3P en miR-375 had zes gedeelde doelstellingen (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 en RAB10), miR-204-5p en miR-375 had ook zes gedeelde doelstellingen (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 en IL1RAP), miR-148a-3P en miR-204-5p had twee gedeelde doelstellingen (AURKB en CDC25B), miR-223-3p en miR-148a-3p had ook twee deelden targets (HSP90B1 en IRS1), miR-223-3p en miR-375 had een gedeeld doel (PARP1) en miR-148a-3p, miR-204-5p en miR-375 had ook een gedeeld doel (BCL2). Target genen die gelijktijdig werden geregeld door twee of drie miRNAs vertegenwoordigd zijn in oranje en groene kleuren, respectievelijk (Figuur 5). Om vast te stellen of de ziekte geassocieerde genen werden aanzienlijk verrijkt in onze set van miRNA targets, werd verrijking analyse uitgevoerd. Eerst werd het gen lijst opgehaald DisGeNet database. Als query voor de database hebben we de term "adenocarcinoom" (UMLs: C0149826). Na het uitfilteren van miRNA, lncRNA en genen die niet in miRTarbase en miRecords waren 115 genen werden geïdentificeerd te worden geassocieerd met GC. In de netwerkanalyse 20-GC geassocieerde genen werden overlapt, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 en JAG1) van hen is toegewezen aan miR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 en SPARC) toegewezen aan miR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 en CCKBR) toegewezen aan miR-148a-3P en 2 (STMN1 en IGF1R) toegewezen aan miR-223-3p. Doelgenen die zijn geassocieerd met GC zijn weergegeven in blauw (figuur 5). Tenslotte werd ziekte-geassocieerde gen verrijking analyse uitgevoerd met behulp van een hypergeometrische-distributie gebaseerde test die hebben geleid om te beoordelen of het aantal GC-geassocieerde genen is groter dan verwacht in de set van target genen van geselecteerde miRNAs. Verrijking analyse bleek dat-GC-geassocieerde genen significant oververtegenwoordigd (p < 0,05) in miR-148a-3p, miR-204-5p en miR-223-3p, terwijl er geen significante verrijking in miR-375 target genen werd waargenomen (p > 0,05) (tabel 3) BCL2 Kopen en DNMT3B Discussie Altered miRNA expressie profielen hebben. gerapporteerd bij GC weefsel en bloedmonsters [13] [20] [14] [38]. Sommige van deze miRNAs gedereguleerd zijn verbonden met overleving, metastatisch gedrag van tumoren en andere klinische en pathologische kenmerken van GC [39] [40]. Voorts zijn miRNAs aangetoond tumorgroei regelen door het beïnvloeden proliferatie, adhesie, invasie en migratie in GC cellijnen [41]. Belangrijker doelgenen van ontregelde miRNAs in GC zijn betrokken bij apoptose, celcyclus en andere cruciale carcinogenese pathways [12]. Daarom kan onderzoek miRNAs en de potentiële doelgenen in GC dienen voor verdere ontwikkeling van belangrijke diagnostische en therapeutische alternatieven. Het is evident dat miRNAs zijn grote spelers in de maag carcinogenese, maar we nog steeds geen exacte gegevens over de mechanismen en potentiële klinische toepassingen van deze moleculen in GC. Onze huidige studie had als doel om het profiel van gedereguleerde miRNAs in GC bepalen weefsels, beoordeelt deze in plasmamonsters en potentiële doelgenen van ontregelde miRNAs evalueren. Met behulp van TaqMan miRNA TLDA kaarten, omvat 377 miRNAs primers, vonden we 15 verschillend tot expressie miRNAs tussen kankercellen GC en gezonde maag weefsels. Acht miRNAs werden down-gereguleerd (let-7a-5p, laat-7G-5p, miR-26b-5p, miR-30b-5p, miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR -375), terwijl zeven miRNAs werden up-gereguleerd (miR-146b-5p, miR-155-5p, miR-214-3p, miR-223-3p, miR-224-5p, miR-331-3p en buitenspiegels 484). Onze profiling resultaten niet onthullen een aantal van de algemeen gedereguleerde miRNAs, die eerder zijn gemeld te worden gedereguleerd in andere studies, met inbegrip van miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-29c-3p, en anderen [15] [19] [14]. Een van de mogelijke verklaringen voor deze ontbrekende miRNAs bijvoorbeeld ook in verband met zeer strikte statistische criteria die werden toegepast TLDA analyse van onze data (FDR gecorrigeerde p-waarde < 0,01 en fold change > 2). Bovendien zou een zekere mate van verschil in miRNA profilering resultaten van de studies voortkomen uit verschillen in de anatomische locatie van de maag, histologische subtype, statistische analyse en vooral profilering werkwijzen [18]. Een studie door Mestdagh et al. toont aan dat de verschillende platforms van miRNA profilering hebben verschillende detectie, specificiteit en reproduceerbaarheid, en dat de meest geschikte platform moet worden gekozen op basis van de experimentele setting en de specifieke onderzoeksvragen (Mestdagh et al., 2014). in de tweede fase van onze studie gebruikten we qRT-PCR in replicatie cohort waaronder zes meest geliberaliseerde miRNAs uit de profilering fase (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-155-5p, miR-204-5p , miR-223-3p en miR-375). We toonden aan dat miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p en miR-375 consequent werden gedereguleerd tussen normale en kankercellen GC weefsels. De resultaten van ons cohort replicatie worden ondersteund door eerdere rapporten. Verschillende studies hebben aangetoond dat miR-148a-3p significant neerwaarts gereguleerd GC cellijnen en weefselmonsters in vergelijking met de aangrenzende normale weefsels [42] [43]. Lage expressie van miR-375 werden ook gemeld door studies, hypothese dat miR-375 werd geassocieerd met de maag carcinogenese [44] [16]. We vastgesteld miR-223-3p aanzienlijk opgereguleerd in GC weefsel in vergelijking met normaal weefsel, zoals door verscheidene eerdere rapporten [15] [19]. MiR-204-5p is minder vaak gemeld in GC miRNA profilering studies; Niettemin, onze resultaten zijn in lijn met een eerdere studie die aanzienlijke neerwaartse regulatie van deze miRNA in GC weefsel en GC cellijnen [45] liet zien. MiR-135a-5p expressie was lager in GC weefsels dan in controle onderwerpen; De waargenomen neerwaartse regulatie trend was vergelijkbaar met eerdere rapporten [15] en misschien bereikte significantie vereist een groter aantal individuen binnen de groepen. Het is de moeite waard erop te wijzen dat we geen verschillen miR-155-5p in onze replicatie cohort vergelijken controlepersonen en patiënten GC vond. Hoogstwaarschijnlijk deze bevinding is gekoppeld aan het feit dat in de eerste beoordeling cohort controlepersonen waren H Om de mogelijke rol van differentieel tot expressie miRNAs als biomarkers in GC onderzoeken, analyseerden we gedereguleerd miRNAs in plasmamonsters. Circulerende miRNAs, met name de combinatie van verschillende miRNAs, kunnen als veelbelovende biomarkers dienen voor de diagnose van maagdarmkanker [21]. Een studie door Zhu et al. aangetoond dat een panel van vijf miRNAs als een potentiële biomarker in het opsporen vroeg stadium GC [47] kunnen dienen. Tot op heden gemeld miRNA profielen GC serum of plasma aanzienlijk verschillen tussen afzonderlijke studies [21].
expressie door qRT-PCR in GC weefsel, dat gecorreleerd met targeting miRNA meningsuiting.
Conclusies
meningsuiting in GC weefsel gecorreleerd met hun targeting miRNA meningsuiting
( H
. pylori
) infectie tot chronische atrofische gastritis, intestinale metaplasie en GC is nog steeds slecht begrepen [10 ]. De huidige hypothese van GC ontwikkeling impliceert gecombineerde effecten van bacteriële, gastheer en nutritionele factoren; echter, tot nu toe, deze theorie suggereert weinig klinisch gezonde translationele implicaties [11]. De meeste GC gevallen gediagnosticeerd in latere stadia van de ziekte, die wordt geassocieerd met slechte resultaten bij patiënten. Daarom is een van de belangrijkste focussen GC onderzoek de evaluatie van potentiële moleculaire biomarkers die kunnen worden gebruikt voor de vroege niet-invasieve diagnose van kwaadaardigheid.
gastritis en premaligne stadia van maag-atrofie en intestinale metaplasie [17] [18]. Interessant sommige miRNAs tegengestelde deregulering richtingen in de aanwezigheid van GC, als afzonderlijke profiling studies tonen aanzienlijke inconsistentie tussen ontregelde miRNAs [14]. MiR-9 werd gevonden dat opwaarts gereguleerd in twee studies [15] [19], terwijl twee andere belangrijke documenten neerwaartse regulatie van miRNA in GC weefsels [13] [20] heeft. Deze verschillen ten aanzien van tegenover de deregulering resultaten voor miR-9 en vele andere miRNAs zijn het meest waarschijnlijk verband houden met verschillen in de anatomische locatie van de GC, histologisch subtype, ziektestadium, het profileren van platforms, statistische analyse en vele andere mogelijke verstorende factoren. Daarnaast meeste momenteel gepubliceerde studies over miRNA profiel GC weefsels gaan onder uit Aziatische landen; Ondertussen, gegevens over Europese GC patiënten is nog steeds schaars is [21].
Materialen en methoden
Studiepopulatie
. pylori
status werd beoordeeld in GC en controle proefpersonen met behulp van indirecte ELISA aan het serum-specifieke IgG-antigen (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Duitsland) op te sporen. Klinische en pathologische kenmerken van de patiënt cohorten met inbegrip van leeftijd, geslacht en ziektestadium zijn samengevat in tabel 1.
Plasma monstervoorbereiding en RNA-extractie
miRNA profilering met de TaqMan Low-Density Array
Kwantitatieve reverse transcriptie polymerase chain reacties (qRT-PCR)
genexpressie analyse werd gesynthetiseerd uit 500 ng van RNA met behulp van een High-Capacity cDNA reverse transcriptie Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA). Singleplex reacties werden uitgevoerd in een volume van 7,5 pl uitgevoerd. Elke reactie bestond uit 2,1 pi nuclease gratis water, 1 ui 10 × RT buffer, 0,4 pl dNTPs (100 mM), 1 ui 10 × RT Random primers, 0,5 ul Multiscribe reverse transcriptase en een vast volume van miRNA template (2,5 pi). gedurende 10 min, 37 ° C gedurende 120 min en 85 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door houden bij 4 ° C 25 ° C: RT-PCR werd uitgevoerd in een thermocycler onder de navolgende omstandigheden. Voordat qPCR cDNA monsters werden verdund 1: 1 met nuclease gratis water en 2 pl gebruikt in 10,5 pl RT-qPCR reacties samen met 6,25 pi 2x TaqMan Fast Universal Master mix (Life Technologies, Carlsbad, California, USA), 0,625 pl 20x TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) en 3,625 pi steriel water. RT-qPCR assays werden in drievoud op een 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) onder de volgende omstandigheden: 95 ° C gedurende 10 min, vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 60 s, gevolgd door een greep bij 4 ° C. De expressie niveaus van BCL2 Kopen en DNMT3B
in het weefsel werd genormaliseerd naar ACTB
.
Target genetische netwerk analyse
Statistische analyse
2-test en Fisher's exact test voor kwalitatieve gegevens, en t-test voor kwantitatieve gegevens. De TLDA gegevens werden geanalyseerd met de t-test en Benjamini Hochberg correctie voor verkeerde ontdekking zodanig dat differentiële expressie werd significant geacht met een p <is; 0,01. De gegevens werden genormaliseerd met behulp van rang invariant normalisatie [33] en geanalyseerd met behulp van de HTqPCR pakket. De validatie en plasma-qPCR expressie gegevens werden geanalyseerd met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney U test. Een Benjamini Hochberg aangepaste p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Voor qRT-PCR data, de relatieve expressieniveaus van elk doel miRNA (Log2 relatieve) werden berekend volgens het verschil in CT-waarden tussen het doel en miRNAs miR-127-3p in weefselmonsters en miR-16-5p in plasmamonsters (OCT) [34]. Hypergeometrische test werd gebruikt voor GC geassocieerd doelwit verrijking analyse. A receiver operating characteristic (ROC) curve werd gegenereerd voor elke miRNA gebruik OCT data. Het gebied onder de curve (AUC) waarde en 95% betrouwbaarheidsintervallen (CI) werden berekend om de specificiteit en gevoeligheid te bepalen. Diagnostische waarde Gecombineerd veranderingen in plasma miRNA niveaus analyseren, werd de univariate genexpressie gemiddelde algoritme [35]. ROC curves werden gegenereerd met ROCR pakket [36]. Alle data analyses werden uitgevoerd met behulp van R versie 3.1.1 software.
Resultaten
Mirna validatie in GC en gezond maagslijmvlies weefsel met qRT-PCR
ziekte-geassocieerde gen verrijking analyse
over-expressie en inverse correlatie met targeting miRNAs bij maagkanker weefsels
als een vermeende doelwit voor miR-148a-3p, miR-204-5p en miR-375 en DNMT3B
voor miR-148a-3p en miR-375. Al deze miRNAs in ons onderzoek bleken te zijn downgereguleerd bij maagkanker weefsel. Ter verdere ondersteuning van deze resultaten, eerst de expressie analyse van de BCL2 Kopen en DNMT3B
genen werd uitgevoerd. De gegevens van qRT-PCR toonde significante toename in de expressie niveaus van zowel BCL2 Kopen en DNMT3B
genen bij maagkanker weefsel. BCL2
vertoonde een 2,7-voudige toename, terwijl DNMT3B
hadden een 16,7-voudige toename van mRNA-niveaus (Figuur 6). Pearson's correlatie-analyse werd uitgevoerd om de relatie tussen de BCL2
onthullen en DNMT3B
mRNA en hun targeting miRNA niveaus in normale en kankerachtige weefsels maag (figuur 6). Een inverse correlatie werd waargenomen voor zowel de voorspelde DNMT3B
-targeting miRNAs: miR-375 (r = -0,49; p = 0,00001) en miR-148a-3P (r = -0,26; p = 0,0328) . Een negatieve correlatie werd waargenomen tussen de BCL2 Kopen en miR-375 (r = -0,32; p = 0,0116), terwijl er geen verband gevonden tussen de BCL2 Kopen en miR-148a-3P (r = -0,06; p = 0,6631), of BCL2 Kopen en miR-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)
. pylori free, terwijl in de replicatie set, een deel van de controle onderwerpen positieve serologie voor deze bacterie. Het is algemeen bekend dat miR-155-5p is betrokken bij inflammatoire pathways inclusief H
. pylori
gastritis [46]; dus dit kan een zekere vertekening van onze resultaten. Onze resultaten zijn in lijn met eerdere studie door Link et al. (2015), waarbij het verschil in de expressie van miR-155 in biopten van GC vergelijking met controles niet statistisch significant [18] bereikte. In de replicatie stadium van onze miRNA profilering onderzoek selecteerden we zes miRNAs, met de hoogste biologische relevantie en statistische significantie vertoonden. We zijn het eens dat het de moeite waard om überhaupt aanzienlijk gedereguleerde miRNAs kijken zou zijn en dat een mogelijke taak verder onderzoek zou kunnen zijn.
Metformine kan een lekkende darm helpen
Leidt hypertensie altijd tot ernstige COVID-19?
Omgaan met het prikkelbare darm syndroom
Markering van potentiële moleculaire voorspellers van respons op biologische therapieën bij colitis ulcerosa
Nieuwe studie kan dodelijke infecties bij baby's helpen voorkomen
Nieuw ontdekte grote fagen vervagen de grens tussen leven en niet-leven
Genetisch risico op auto-immuniteit kan verband houden met verschillen in darmmicrobioom
Kinderen met een verhoogd genetisch risico op diabetes type 1 hebben een ander darmmicrobioom dan kinderen met een laag risico. een nieuwe studie gevonden. Een team van onderzoekers van de Linköping
Lichaamstrillingen helpen ontstekingen te verminderen,
dankzij het darmmicrobioom Lichaamstrillingen lijken veel symptomen van diabetes mellitus type II te verbeteren, waarbij glucose en destructieve ontstekingen omhoog schieten. De procedure helpt het li
GSK-3-remmers zijn veelbelovend bij de behandeling van coronavirusinfecties
Onderzoekers in de Verenigde Staten hebben een nieuwe benadering voorgesteld voor de behandeling van infectie met coronavirussen, zoals het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV