De abstracte
Achtergrond
Lysosome-geassocieerde transmembraaneiwit 4β -35 (LAPTM4B-35), een lid van de zoogdier-4 tetratransmembrane spanning eiwit superfamilie, is gerapporteerd dat overexpressie in verschillende kankers. Maar de expressie van LAPTM4B-35 en zijn rol in de progressie van maagkanker (GC) is niet bekend. Het doel van deze studie was om te onderzoeken LAPTM4B-35 expressie in GC, de potentiële relevantie voor clinicopathologic parameters en de rol van LAPTM4B-35 tijdens de maag carcinogenese.
In de huidige studie, paraffine Ingebedde exemplaren met GC (n = 240, waarvan 180 gepaarde exemplaren) en 24 gepaarde vers ingevroren weefsels werden geanalyseerd. qRT-PCR en immunohistochemie (IHC) werden gebruikt om de expressie van LAPTM4B-35 GC te analyseren. De effecten van LAPTM4B-35 op de proliferatie GC cel, migratie en invasie werden bepaald door overexpressie en knock-down assays.
IHC bleek dat LAPTM4B-35 werd uitgedrukt in 68,3% (123/180 ) van GC weefsels, terwijl in 16,1% (29/180) van hun gepaarde aangrenzende goedaardige maag weefsels ( P Deze bevindingen geven aan dat LAPTM4B-35 overexpressie kan worden gerelateerd aan GC progressie en een slechte prognose, en kan dus dienen als een nieuwe marker voorspelling van prognose bij patiënten GC Citation:. Cheng X, Z Zheng, Bu Z, X Wu , Zhang L, Xing X, et al. (2015) LAPTM4B-35, een kanker-gerelateerde Gene, wordt in verband gebracht met een slechte prognose in TNM Stadia I-III maagkankerpatiënten. PLoS ONE 10 (4): e0121559. doi: 10.1371 /journal.pone.0121559 Academic Editor: Ken-ichi Mukaisho, Shiga Universiteit van medische wetenschap, JAPAN Ontvangen: 10 april 2014; Aanvaard: 12 februari 2015; Gepubliceerd: 7 april 2015 Copyright: © 2015 Cheng et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden Financiering: Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 30471677 en 81141024) en de Nationale Key Technology R & D Program (Beijing Municipal Science and Technology. project Z121100007512010). De financiers hebben bijgedragen aan de studie design, prestaties, reagentia, materialen, data-analyse en besluitvorming te publiceren Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Maagkanker is de derde meest voorkomende kanker in China en de voornaamste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in China [1]. De meeste patiënten GC reeds in een vergevorderd stadium ten tijde van de diagnose (stadium III en IV), waardoor de prognose somber, ondanks verbetering chirurgische en adjuvante behandelmethode [2-5]. Onafhankelijk van chemotherapie en bedoeld curatieve operatie, bijna 60% van de patiënten met GC ontwikkelen herhaling en uiteindelijk sterven van metastatische ziekte [6]. GC progressie is een multifactoriële en multi-step proces waarin erfelijke en omgevingsfactoren spelen een belangrijke rol [7]. Vorige waarnemingen wijzen erop dat de klassieke biomarkers en enscenering systemen, op basis van klinische en pathologische bevindingen, kunnen hun beperkingen hebben voor klinische toepassingen en aanzetten tot nieuwe moleculaire biomarkers welke patiënt uitkomst en behandeling kunnen voorspellen [8, 9]. lysosoom-geassocieerd eiwit transmembraan 4 beta (LAPTM4B) werd oorspronkelijk gekloneerd in hepatocellulaire carcinomen (HCC) van Shao et al, die zich op chromosoom 8q22, een regio vaak geamplificeerd in borstkanker en HCC [10, 11]. Het codeert twee proteïnen met verschillend molecuulgewicht, 24 kDa en 35 kDa eiwitten (LAPTM4B-24 en -35) met vier vermeende transmembranaire gebieden [12]. De lokalisatie van LAPTM4B-35 is niet alleen in lysosoom, maar ook plasmamembraan en interne organellen zoals Golgi apparaat en endosomen [13]. Vermeld is dat LAPTM4B-35 schaal werd tot expressie gebracht in verschillende typen carcinoom. Eerdere rapporten gaven aan dat overexpressie van LAPTM4B-35 is geassocieerd met ongunstige biologische effecten en slechte prognose bij veel kankers, zoals borstkanker [14], HCC [15-17], galblaascarcinoom [18, 19], colorectale kanker [20] , epitheliaal ovariumcarcinoom [21] en endometriumcarcinoom [22]. Ook is gemeld dat allelische variatie LAPTM4B geassocieerd met genetische gevoeligheid van GC [23]. Bovendien overexpressie van LAPTM4B-35 door transfectie van cDNA LAPTM4B stimuleert celproliferatie, migratie, invasie in HCC xenotransplantaten in naakt muizen en induceert multidrug resistentie [24]. Knockdown van LAPTM4B door RNA interferentie omgekeerd omgekeerd al deze kwaadaardige fenotypische functies in HCC [24, 25]. Maar LAPTM4B-35 expressie, relevantie ervan voor de clinicopathologic kenmerken en biologische rol van LAPTM4B-35 in GC blijven onduidelijk. In deze studie was het doel om LAPMT4B-35 expressie in GC en de potentiële relatie met klinische en pathologische kenmerken en de prognostische betekenis identificeren. Bovendien, in vitro functionele testen werden uitgevoerd om de biologische effecten van LAPTMEB-35 karakteriseren maag tumorgeniciteit. Ethics Alle patiënten hadden getekend geïnformeerde toestemming voor het verkrijgen van weefselmonsters, en de studie protocol werd goedgekeurd door de Clinical Research Ethics Committee van de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis. Human gastric weefselmonsters Een totaal van 240 (167 mannen en 73 vrouwen, 22-87 jaar oud, en de mediane leeftijd was 60 jaar) formaline gefixeerde in paraffine ingebedde GC weefsels, waaronder 180 gepaarde kankercellen en afgestemd aangrenzende noncancerous maagslijmvlies weefsels werden verzameld van GC patiënten die gastrectomie aan de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis van januari 2003 tot december 2011. De klinische en histologische gegevens voor elk geval werd ook verzameld op basis van goedgekeurde institutionele richtlijnen. De 1997-UICC TNM criteria werden gebruikt voor de indeling van maagkanker. De mediane follow-up periode sinds de tijd van de diagnose was 26,2 maanden (range, 2,4-119,0 maanden). In totaal zijn 112 (46,7%) patiënten overleden in de follow-up periode. Paraffinecoupes (4 micrometer) werden van was ontdaan en gerehydrateerd in xyleem en ethanol. Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [16] met behulp van anti-LAPTM4B-35 antilichaam (1: 200) (gegeven door Pro RL Zhou.). Als negatieve controles werden de coupes behandeld als hetzelfde protocol, behalve dat ze gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C in blokkerende oplossing zonder het primaire antilichaam. De expressie van LAPTM4B-35 werd beoordeeld door twee ervaren pathologen (Y zon en B Dong), die onafhankelijk van elkaar gewerkt en werden blind voor de klinische resultaten van de patiënten. Verschillen tussen de waarnemers in minder dan 10% van de onderzochte glijbanen en een consensus bereikt na verdere beoordeling. Kleuring assessment was gewoon gebruik gemaakt van de semi-kwantitatieve methoden te classificeren LAPTM4B-35 uitdrukking als negatieve en positieve gekleurd immunoreactieve cellen. De verhouding van positiviteit werd gescoord als '' 0 "(< 10% positieve tumorcellen), '' 1" (10-50% positieve tumorcellen), en '' 2 "(> 50% positieve tumorcellen). De kleuring intensiteit werd gescoord als '' 0 "(geen vlekken of zwak gekleurd), '' 1 '(matig vlekken), of' '2" (sterke kleuring). De som van de kleurintensiteit score en het percentage score werd gebruikt om de LAPMT4B expressie niveaus te definiëren: 0-2, negatieve expressie en 3-4, positieve uitdrukking (14). De positieve expressie alleen beoordeeld door de secties met ten minste 10% positieve gebied van tumoren. Maagkanker cellijnen (SGC- 7901, BGC-823, MGC-803, MKN-28 en AGS) werden gekweekt in DMEM (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canada) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) en 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2. De pcDNA3 hCas9 en gRNA vector werd gekregen van China zebravis Resource Center (CZRC). De volledige lengte van Cas9 cDNA werd gekloneerd in de vector pXT7 en gelineariseerde en capped mRNA werd gesynthetiseerd onder toepassing mMESSAGE mMachine mRNA transcriptie-synthese kit (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). De gRNA primersequenties waren: voorwaartse primer, 5'- TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 'en reverse primer: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3'.The protocol werd gevolgd door de vorige gepubliceerde document [26]. hCas9 mRNA (3 ng /pl) en gRNA (0,2 ng /ul) werden gecotransfecteerd in SGC-7901 cel uitgevoerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA-isolatie, kwantitatieve real-time reverse transcriptie PCR (qRT-PCR) Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Real-time PCR werd uitgevoerd met de ABI 7500 Fast real-time PCR systeem (Life Technologies, Carlsbad, California, USA). β-actine werd gebruikt als een interne controle. LAPMT4B-35: De primersequenties worden hieronder opgesomd voorwaartse primer: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ', reverse primer: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; β-actine: voorwaartse primer: 5'-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 'reverse primer: 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3' Cell proliferatie assay Cell proliferatie werd gemeten door Cell Counting Kit-8. (CCK-8) (DOJINDO, Japan) volgens het protocol van de fabrikant. Een volume van 100 ul celsuspensie (3000 cellen per putje) geïncubeerd in een 96-putjesplaat (Costar, Corning, NY) gedurende 24, 48, 72, 96 uur. 10 ui van de CCK-8-oplossing werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 3 uur bij 37 ° C. Absorptiewaarden van putjes werden vervolgens bepaald bij 450 nm met een referentie golflengte van 630nm in Microplate Reader (Bio-Rad, USA). Het experiment werd in drievoud uitgevoerd en tweemaal herhaald. Celmigratie werd gemeten door wondgenezing assay door het IncuCyte HD systeem (IncuCyte ZOOM, Essen BioScience, USA). Cellen werden gezaaid in 96-well platen in de dichtheid van 6 x 10 4 cellen per putje. Wond werd gemaakt via confluente monolaag cellen met een penblok en cellen werden gewassen met 1 x PBS, gekweekt in DMEM-medium met 10% foetaal runderserum. Foto's van cellen werden afgebeeld met behulp van de IncuCyte HD-systeem op 4-uur interval van 2 afzonderlijke regio's per putje met behulp van een 10x doelstelling. Waarden uit 2 delen van elk putje werden verzameld en gemiddeld over alle replicaten 3 Transwell invasie assays De Transwell (8 urn poriegrootte, Cell Biolabs, USA). Assay werd gebruikt voor het analyseren celinvasie volgens de instructies van de fabrikant. 8 x 10 4 cellen in de bovenste kamers geplaatst in serumvrije media en de onderste kamers werden gevuld met DMEM en 10% FBS. Na incubatie gedurende 72 uur bij 37 ° C werden niet-invasieve cellen op het bovenoppervlak van de membranen verwijderd met een wattenstaafje. De membranen werden gefixeerd met methanol gedurende 10 minuten en gekleurd met 0,5% kristalviolet gedurende 10 min. De cellen op de onderzijde van het filter waren vijf willekeurig gekozen microscopische geteld. De proteïne expressieniveaus van GC cellijnen werden gemeten door Western Blot analyse. Cellen werden in voorgekoeld RIPA lysisbuffer (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) met proteaseremmer cocktail (Roche, Bazel, Zwitserland) gelyseerd gedurende 30 min na centrifugeren bij 15.000 g gedurende 20 min, werd het supernatant verkregen. 50 ug van eiwitextracten werden gescheiden door 10% SDS polyacrylamide gelelektroforese en overgebracht op de 0,45 urn polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (Whatman, Duitsland). Het membraan werd geblokkeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met blokkerende buffer (pH 7,6) die 5% magere melkpoeder, vervolgens geïncubeerd met anti-LAPTM4B-35 antilichaam (1: 800, geschonken door prof RL Zhou) bij 4 ° C overnacht . Muis-anti-humaan β-actine antilichaam (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) werd toegepast als een interne controle. Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescentie detectiesysteem (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). chikwadraattoets werd gebruikt om het verschil in LAPTM4B-35 eiwitexpressie tussen GC vergelijk weefsels en aangrenzende goedaardige weefsels. Onvoorwaardelijke logistische regressie modellen werden gebruikt om relaties tussen LAPTM4B-35 expressie en clinicopathologische parameters bepalen door geslacht de status te analyseren. Het verschil van de LAPMT4B-35 De totale overleving (OS) curve werd berekend met de Kaplan-Meier-methode en geanalyseerd met de log-rank test. Relatieve risico (RR) van de dood in verband met LAPTM4B-35 expressie en andere voorspellende variabelen werden geschat op basis van de univariate Cox proportionele hazards model in de eerste plaats. Multivariate Cox modellen werden ook gebouwd om de RR voor LAPMT4B-35 expressie te schatten. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de SPSS-software statistisch pakket (versie 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Een tweezijdige P Expressie analyse van LAPTM4B-35 in GC cellijnen en GC We hebben in de eerste plaats gekeken naar de expressie van LAPTM4B-35 LAPTM4B-35 LAPTM4B-35 eiwit expressie werd frequent waargenomen in de menselijke GC We onderzochten de expressie van LAPTM4B-35 in GC en aangrenzende goedaardige weefsels door middel van immunohistochemische analyse. LAPTM4B-35 niet tot expressie in normale maagslijmvlies (figuur 2A), maar uitgedrukt in de intestinale metaplasie, dysplasie laesie (gegevens niet getoond) en tumorcellen, en hoofdzakelijk gelokaliseerd in het cytoplasma of op het celmembraan (figuur 2B en 2D 2H). LAPTM4B-35 frequent waargenomen in GC weefsels in vergelijking met matchende aangrenzende goedaardige slijmvlies (68,3% vs. 16,1%, P We analyseerden de relatie tussen LAPTM4B-35 expressie en klinisch-pathologische kenmerken van GC patiënten. Zoals het geslacht, de objecten in onze studie is de afwijking (167 vs. 73, Tabel 2) berekenden we de relatie van logistische regressieanalyse dat varieert genderstatus. LAPTM4B-35 werd vaker waargenomen slecht gedifferentieerde GC in vergelijking met matige-goed gedifferentieerd degenen (65,4% vs. 57,9%, P LAPTM4B-35 expressie en prognose voor patiënten GC figuur 3 toont de analyse van LAPTM4B-35 expressie en klinische resultaten. Kaplan-Meier survival curves toonde was er een tendens van kortere totale overleving (OS) in GC patiënten met LAPTM4B-35 positieve uitdrukking in vergelijking met de negatieve ( P De resultaten van univariate en multivariate modellen Cox's voor OS van GC patiënten in TNM stadium I-III tentoongesteld die diepte van de invasie (RR = 3,103, 95% CI: 1.427 -6,748; P LAPTM4B-35 bevorderd tumor celproliferatie om het effect van LAPMT4B-35 in de functie van celbiologie onderzoek, twee cellijnen werden gevestigd. BGC-823 en SGC-7901 cellen presenteren relatief lagere of hogere expressie van LAPTM4B-35 werden afzonderlijk geselecteerd voor overexpressie en knock-down assay (figuur 1A). In de eerste, cellijn overexpressie BGC-823-AF LAPTM4B-35 stabiel werd opgericht, en bespotten werd gebruikt als de controle voor deze cellijn. Ten tweede, werd LAPTM4B-35 stabiel neergehaald towarding naar SGC-7901 (hCas9 /gRNA) van het type II geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen (CRISPR) systeem, en de resultaten werden geïdentificeerd door Western blot (figuur 4A). celproliferatie assay werd gemeten door CCK-8 celtellingen kit. De absorptie waarde van de BGC-823-AF cellen op 72 uur na de verspreiding was significant hoger dan de ouder cellen en bespotten cellen, en het resultaat was tegenover door neerhalen van LAPTM4B-35 in SGC-7901-cellen (figuur 4B). LAPTM4B-35 verbeterde tumorcel migratie en invasie vermogen Na transfectie met pcDNA3.0-AF en hCas9 /gRNA, voerden we wondgenezing assay om de migratie vermogen van LAPTM4B-35 te analyseren overexpressie /knock-down maagkanker cellen (Fig 5A). De resultaten toonden aan dat LAPTM4B-35 bevorderd BGC-823 (BGC-823-AF) celmigratie vergelijking met BGC-823 en bespotten ( P Restaurant < 0,05), en down-regulatie van LAPTM4B-35 expressie kon reverse dit fenomeen SGC-7901-cellen ( P Dienovereenkomstig werd het effect van LAPTM4B-35 op de invasiviteit van tumorcellen werd bestudeerd door Transwell assay. (figuur 6A). We vonden dat de binnengedrongen celaantal was significant hoger in de LAPTM4B-35 getransfecteerde BGC-823 cellen en lager in de knockdown SGC-7901-cellen dan in de controlecellen, respectievelijk ( P GC is een zeer heterogeen ziekte waarbij zelfs vergelijkbare klinische en pathologische kenmerken leiden tot verschillende resultaten [27, 28], wat aangeeft dat TNM-classificatie voor GC heeft zijn beperkingen en aanzetten om te zoeken naar nieuwe moleculaire biomarkers die uitkomst en behandeling de patiënt kan voorspellen. Het oncogen LAPTM4B-35 bevindt zich op chromosoom 8q22 en winst van DNA kopieaantal op chromosoom 8q22 is vaak voor te komen in GC volgens onze vorige studie (ongepubliceerde gegevens). In borstkanker, overexpressie van LAPTM4B-35 en 8q22 versterking werden bijgedragen aan de de nove In deze studie hebben we onderzocht LAPTM4B-35 Verder analyseerden we ook de correlatie van LAPTM4B-35 expressie met clinicopathologische parameters bij maagkanker. Hoge LAPTM4B-35 expressie was significant gecorreleerd met de mate van differentiatie, lymfovasculaire invasie, invasiediepte en lymfeknoop metastasen, wat suggereert dat LAPTM4B-35 uitgebreid worden geactiveerd maagkanker en kan een belangrijke rol spelen bij maag- en progressie van kanker. Als de tumor lymfovasculaire invasie en lymphonode metastase zijn zeer belangrijke klinische voorspellende indicatoren voor tumor herhaling, we maakten een survival analyse. Kaplan-Meier curves gestratificeerd LAPTM4B-35 expressie en tumor stadium of lymfovasculaire invasie bleek dat LAPTM4B-35 positieve patiënten significant slechtere OS in vergelijking met LAPTM4B-35 negatieve in TNM stadium I-III of zonder lymfovasculaire invasie subgroep. Multivariate Cox regressie-analyse in deze subgroep aangetoond dat onder alle geanalyseerde factoren, LAPTM4B-35 expressie is een onafhankelijke prognostische factor bij maagkanker patiënten in TNM stadium I-III, maar in fase IV. Het is redelijk omdat patiënten in fase IV kan niet radicaal ontvangstbewerking en kunnen worden behandeld met vele andere verschillende palliatieve behandelingen, die gevolgen hebben voor de prognose. Deze resultaten geven aan dat de neiging van LAPTM4B-35 specifiek kan voorspelt de meest agressieve en dodelijke vormen van maagkanker in gevallen met vroege en zonder distale metastase of invasie zonder lymfovasculaire. In de huidige studie vonden we dat LAPTM4B -35 positieve uitdrukking over het algemeen gecorreleerd met een slechtere prognose in GC patiënten gestratificeerd door tumor stadium of lymfovasculaire invasie. Voor de functie van LAPTM4B-35 in GC, we verder uitgevoerd in vitro assay. Overexpressie van LAPTM4B-35 in BGS-823 cellen onthulde een significante toename in celproliferatie, migratie en invasie, en neerwaartse regulatie van LAPMT4B-35 leidde tot de tegengestelde resultaten. Zhou et al. heeft aangetoond dat LAPTM4B-35 overexpressie bevordert celoverleving, gedereguleerde proliferatie en migratie in HCC cellen [12]. Recente studies hebben gemeld dat LAPTM4B-35 geassocieerd is met een slechtere klinische uitkomst in vele menselijke maligniteiten, zoals HCC [16], metastatische ovariale tumor [32], galblaas [19, 33], extrahepatische cholangiocarcinoom [34] en endometriumkanker [22]. Deze cumulatieve bewijzen ondersteunen onze huidige bevindingen geven dat LAPTM4B-35 overexpressie een belangrijke rol bij de maligne transformatie en progressie van GC kunnen spelen. De moleculaire mechanismen van LAPTM4B-35 in tumorprogressie gegevens blijven onduidelijk. Sommige eerdere studies aangegeven dat LAPTM4B-35 is nodig voor lysosoom homeostase, verzuring en functie, en dat LAPTM4B-35 maakt tumorcellen resistent tegen lysosoom gemedieerde celdood veroorzaakt door milieu en genotoxische stress [30, 31]. Overexpressie van LAPTM4B-35 kan wat proto-oncogenen, zoals c-myc, c-jun en c-fos [35] te activeren en bevorderen de proliferatie, migratie en invasie in sommige humane kanker lijnen die de groei en metastase van zou verbeteren HCC xenotransplantaten in naakt muizen [36]. Verwante onderzoek impliceerde dat LAPTM4B celproliferatie of overleving door de betrokkenheid bij de signaaltransductie route, kan verbeteren, zoals de fosfatidylinositol 3-kinase-proteïne kinase B pathway. En LAPTM4B-35 kan communiceren met een aantal kanker-gerelateerde eiwitten, zoals proteïne fosfatase 2A en proteïnekinase C [10]. Li et al bleek dat LAPTM4B-35 motiveert multidrug resistance van kankercellen door het bevorderen van drug efflux en anti-apoptose door het activeren van PI3K /AKT signalering [24], wat aangeeft dat LAPTM4B-35 een nieuw doel van de therapie kan zijn. De functionele rol en het mechanisme van LAPTM4B in GC nodig verder onderzoek. Concluderend, de huidige studie geeft aan dat LPTM4B-35 overexpressie speelt een belangrijke rol bij het bevorderen van celproliferatie, migratie en invasie van maagkanker. LAPTM4B-35 positieve uitdrukking bij maagkanker weefsels gecorreleerd met de slechte afloop en bleek een onafhankelijke prognostische factor in subgroep van GC patiënt in TNM stadium I-III of zonder lymfovasculaire invasie. Aldus kan LAPTM4B-35 een nuttig biomarker voor prognose van subgroep GC voorspellen vormen. Bovendien, als de rol van LAPTM4B-35 in beperkende lysosoom gemedieerde celdood en bevorderen autofagie significante overlevingseffecten in kankercellen en LAPTM4B-35 werd tot overexpressie gebracht in een groot deel van maagkanker, kan het een nuttig doelwit voor de behandeling van het subtype groep van maagkanker. Ondersteunende informatie Acknowledgments We dank Guoshuang Feng (van de Chinese Center for Disease Control and Prevention) voor zijn vriendelijke hulp in statistische gegevens.
= 0.000). LAPTM4B-35
mRNA levels in GC weefsels werden eveneens significant verhoogd in vergelijking met hun gepaarde aangrenzende goedaardige weefsels ( P
= 0,017). Overexpressie van LAPTM4B-35 was significant geassocieerd met de mate van differentiatie, de diepte van invasie, lymfovasculaire invasie en lymfeklieren metastase ( P Restaurant < 0,05). Kaplan-Meier bleek dat patiënten met LAPTM4B-35 expressie hadden een significante afname in totale overleving (OS) in stadium I-III GC patiënten ( P
= 0,006). Multivariate analyse toonde hoge expressie van LAPTM4B-35 was een onafhankelijke prognostische factor voor OS in fase I-III GC patiënten ( P
= 0,025).
Conclusie
Materialen en Werkwijzen
Immunohistochemie
Celkweek, LAPTM4B-35 expressieplasmide en hCas9 /gRNA transfectie
. 0-AF
met de hele ORF van LAPTM4B produceren LAPTM4B-35 eiwit werd gegeven door Prof. RL Zhou [11]. De transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens het protocol van de fabrikant. Positieve celklonen werden verkregen door antibiotica selectie met G418 (Gibco, Grand Island, NY) bij een concentratie van 800 ng /ml.
Wondhelende assay
Western blotanalyse
Statistische analyse
mRNA expressie tussen GC en aangrenzende goedaardige weefsels werd geanalyseerd door de Wilcoxon matched pair-test.
waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
door RT-PCR in 5 GC cellijnen (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901 en AGS), en vervolgens gedetecteerd zijn eiwit expressie door Western blot. De resultaten toonden aan dat LAPTM4B-35 werd tot expressie gebracht in alle cellijnen, zowel mRNA en eiwitniveaus (figuur 1A, de bovenste en onderste paneel), dan kozen we BGC-823 en SGC-7901 cellen voor onze volgende celfunctie testen.
expressie werd ook gedetecteerd in 24 paren van weggesneden GC exemplaren door qRT-PCR. Zoals we kunnen zien in de figuur 1B, de LAPTM4B-35
expressie in GC weefsels was significant verhoogd in vergelijking met gepaarde aangrenzende goedaardige weefsels ( P
= 0,017) (figuur 1B).
= 0,000) (tabel 1).
Verband tussen LAPTM4B-35 expressie en klinisch-pathologische kenmerken
= 0,017). Bovendien werd LAPTM4B-35 expressie in verband met lymfovasculaire invasie ( P
= 0.000), de diepte van de invasie ( P
= 0,016) en de lymfeklieren metastase ( P
= 0,029) (Tabel 2).
= 0,064, log-rank = 3,425) (Fig 3A). Na patiënten werden gestratificeerd door TNM I-III of patiënten zonder lypmphovascular invasie, patiënten met LAPTM4B-35 positieve uitdrukking toonde aanzienlijk korter OS dan de negatieve ( P
= 0,006 en P
= 0,001 ., respectievelijk) (Fig 3B en 3D)
= 0,004), lymfeklier metastase (RR = 3,015, 95% BI: 1,552-5,858; P
= 0,001) en LAPTM4B-35 expressie niveau (RR = 2,249 , 95% BI: 1,242-4,072; P
= 0,007) significant beïnvloed de overleving van GC, respectievelijk (tabel 3); bovendien LAPTM4B-35 positieve expressie was een onafhankelijke prognostische factor (RR = 1,897, 95% BI: 1,041-3,457; P
= 0,025). Lymfeklier metastase (RR = 2,665, 95% BI: 1,362-5,213; P
= 0,001) ook onafhankelijk voorspelde OS (tabel 3)
< 0,05, figuur 5B)
< 0,05, figuur 6B). Deze resultaten suggereren dat LAPTM4B-35 bevordert de migratie en invasie van maagkanker cellen.
Discussie
chemoresistance om anthracyclines en zijn facultatief voor uitgezaaide herhaling [29].
expressie in 24 maagkanker en hun gepaarde goedaardige gastrische chirurgische monsters met qRT-PCR en vonden dat LAPTM4B-35
mRNA-expressieniveau in maagkanker was significant verhoogd vergeleken met die in de gekoppelde goedaardige weefsels groep. Bovendien immunohistochemische analyse 180 paren maagkanker toonde LAPTM4B-35 werd overexpressie in GC weefsels (68,3%) vergeleken met hun gepaarde goedaardige mucosa (16,1%). LAPTM4B-35 bevordert de tumorgroei en tolerantie voor metabole en genetische spanning door de inductie van autofagie [30, 31]. In onze studie, de functie van LAPTM4B bij maagkanker werd onderzocht door in vitro assays. Overexpressie van LAPTM4B-35 in BGC-823 cellen ook toegenomen levensvatbaarheid van de cellen in serumvrije kweekomstandigheden ook. Als dit fenomeen wordt veroorzaakt door autophage nodig te onderzoeken.
S1 Dataset. Individuele resultaten van de relatieve mRNA van LAPTM4B-35 expressie, celproliferatie, migratie en invasie, overleving van pathients en clinicopathologische features.
(Excel)
doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001
(XLS)
Microben kunnen fatale gevolgen voorspellen bij geventileerde COVID-19-patiënten
Neil Bell benoemd tot Chief Development Officer van Avacta Life Sciences
Darmbacteriën in wespen helpen pesticiden te overwinnen
Colitis ulcerosa en een ontbrekende microbe in de darm
Wat is de deal met hepatitis C?
Nieuw model voor vaginale microbioomtransplantatie
Patiënten met PDS kunnen baat hebben bij vitamine D-supplementen,
suggereert nieuw onderzoek Volgens een nieuwe studie van onderzoekers van de Universiteit van Sheffield, het nemen van vitamine D-supplementen kan helpen om de pijnlijke symptomen van het prikkelbare
Visslijm kan een potentiële bron van antibiotica zijn, blijkt uit onderzoek
Met de komst van multiresistente bacteriën en het gebrek aan nieuwe antibiotica, onderzoekers zijn op zoek geweest naar nieuwe moleculen die deze ziekteverwekkers kunnen bestrijden. Een team van onder
Pasgeboren muismodel levert aanwijzingen op voor de oorzaak van verwoestende darmaandoeningen bij bloedarmoede preemies
Artsen vermoeden al lang dat rodebloedceltransfusies die aan premature babys met bloedarmoede worden gegeven, hen in gevaar kunnen brengen necrotiserende enterocolitis te ontwikkelen, of NEC, een pote