PLOS ONE: Vascular CXCR4 Expression - un roman anti-angiogénique cible dans le cancer gastrique

Résumé

Contexte

récepteurs G couplés aux protéines (RCPG) sont les premiers candidats pour les stratégies de prévention et de traitement du cancer nouveaux. Nous avons cherché GPCR exprimés de manière différentielle dans le noeud carcinomes gastriques positifs.

Méthodologie /Principales constatations

L'expression différentielle des RCPG dans trois nœuds par rapport positif de trois noeuds de type intestinal négatif carcinomes gastriques a été analysé par ensemble de gènes la technologie. Les gènes candidats CXCL12 et son récepteur CXCR4 ont été validés par temps réel transcription inverse réaction en chaîne par polymérase dans un ensemble indépendant de 37 carcinomes gastriques. La traduction a été étudiée par immunohistochimie 347 carcinomes gastriques à l'aide de puces à ADN de tissus ainsi que dans les 61 correspondants des métastases des ganglions lymphatiques. L'expression des protéines a été corrélée avec les caractéristiques des patients clinicopathologiques et la survie. 52 GPCR et les gènes GPCR liés étaient haut ou bas réglementés dans le noeud cancer gastrique positif, y compris CXCL12. l'expression différentielle de CXCL12 a été confirmée par RT-PCR et en corrélation avec la croissance tumorale locale. CXCL12 immunopositivité est négativement associée à des métastases à distance et le grade de la tumeur. Seulement 17% des carcinomes gastriques a montré des cellules tumorales immunopositif CXCR4, qui était associée à l'étendue supérieure de la tumeur locale. 29% des carcinomes gastriques a montré CXCR4 microvaisseaux tumorales positives. expression vasculaire CXCR4 était significativement associée à l'extension tumorale locale plus élevée, ainsi que la hausse UICC-étapes. Lors de l'expression à la fois, CXCL12 dans les cellules tumorales et CXCR4 dans les micro-vaisseaux tumoraux, ces tumeurs ont également été très significativement associés à T- supérieur et UICC étapes. Trois métastases ganglionnaires ont révélé l'expression de CXCR4 vasculaire alors que les cellules tumorales complètement manqué CXCR4 dans tous les cas. L'expression de CXCL12 et CXCR4 n'a eu aucun impact sur la survie des patients.

Conclusions /Importance

Nos résultats corroborent l'importance des RCPG sur la biologie des cancers gastriques et fournissent la preuve que la voie CXCL12-CXCR4 pourrait être une nouvelle cible antiangiogénique prometteuse pour le traitement des carcinomes gastriques

Citation:. Ingold B, Simon E, Ungethüm U, Kuban RJ, Müller BM, Lupp a, et al. (2010) Vascular CXCR4 Expression - un roman anti-angiogénique cible dans le cancer gastrique? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10.1371 /journal.pone.0010087

Editeur: Irene Oi Lin Ng, Université de Hong Kong, Hong Kong

Reçu le 22 Septembre 2009; Accepté le 16 Mars 2010; Publié: 8 Avril 2010

Droit d'auteur: © 2010 Ingold et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenue par des subventions de la Berliner Krebshilfe (Berlin Canceraid). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'un des cancers les plus courants dans le monde entier, au quatrième rang dans la fréquence globale et représentant plus de 650.000 décès par an [1]. Le taux de mortalité du cancer gastrique est seulement excellait par le cancer du poumon. cancer gastrique précoce provoque souvent aucun symptôme spécifique. L'absence de symptômes précoces retarde le diagnostic. Par conséquent, 80-90% des patients occidentaux avec le cancer gastrique présente avec des tumeurs avancées lorsque des métastases locales ou distantes avait déjà eu lieu [1]. Le statut des ganglions lymphatiques, en particulier le rapport de la /des ganglions lymphatiques métastases métastases négatif positif, est le plus fort facteur pronostique du cancer gastrique [2]. Le taux de survie à 5 ans pour les patients atteints 1-6 métastases ganglionnaires est de 44% et se terminant avec seulement 11% chez les patients avec plus de 15 ganglions lymphatiques positifs. gastrectomie partielle ou totale, associée à une radiothérapie adjuvante et /ou la chimiothérapie comme indiqué, promet une guérison complète que chez les patients atteints de la maladie à un stade précoce. Dans la maladie métastatique, actuellement utilisé schémas radiothérapeutiques et chimiothérapeutiques ont une faible efficacité et résistantes aux maladies de traitement progression conduit à la mort en quelques mois [3]. À ce jour, il n'y existe pas de marqueur prédictif spécifique comme HER2 dans le cancer du sein, le carcinome EGFR dans un petit non du poumon ou de K-RAS dans le carcinome colorectal, ce qui permet une stratégie thérapeutique plus individualisée. Par conséquent, de nouvelles approches thérapeutiques moléculaires ciblées sont nécessaires.

G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) représentent de loin la plus grande famille de molécules de surface cellulaire, qui relaient des signaux par l'intermédiaire d'une protéine de liaison au GTP (protéines G ) -initiated deuxième cascades de messager dans la cellule [4]. RCPG sont réglementés par de nombreux agonistes, mais tous partagent un noyau caractéristique composé de sept transmembranaire α-hélices, qui sont liés par trois intra- et trois boucles extracellulaires. Ces récepteurs contrôlent les fonctions physiologiques clés, y compris la neurotransmission, l'hormone et la libération d'enzymes de endocrines et exocrines des glandes, des réponses immunitaires, la contraction musculaire et la régulation de la pression sanguine pour ne nommer que quelques-uns [4].

Les cellules malignes détournent souvent le physiologique normal les fonctions de GPCR pour survivre, proliférer de manière autonome et d'échapper au système immunitaire. En outre RCPG jouent un rôle central dans l'angiogenèse induite par la tumeur et les métastases du cancer. De nombreuses tumeurs solides dépendent de GPCR pour induire une réponse angiogénique, soit en agissant sur endothéliales ou stromales composants directement ou par régulation de la libération ou l'activité d'autres médiateurs angiogéniques tels que le facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF) ou facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) par stromales et les cellules immunitaires [5]. Les cellules cancéreuses manipulent GPCR pour attirer les cellules endothéliales et les amener à envahir la masse tumorale, de manière à former de nouveaux vaisseaux pour fournir des nutriments et de l'oxygène. De nombreux cancers métastasent à des organes spécifiques, ce qui est fréquemment causé par l'expression aberrante des RCPG dans les cellules cancéreuses - récepteurs en particulier chimiokines - concomitant avec la libération de chimiokines des organes secondaires [6]

La livraison de drogue, d'imagerie de la tumeur. et les biomarqueurs prédictifs malignité sont des applications de GPCR pour mettre en évidence: peptides radio-marqués qui se lient à RCPG pourraient avoir de vastes applications pour le diagnostic et le traitement du cancer [7]. Ligands qui se lient RCPG ont également été conjugués à des agents cytotoxiques pour cibler spécifiquement les cellules malignes qui surexpriment ces récepteurs, ce qui réduit les effets secondaires [8]. En outre, les GPCR peuvent être des biomarqueurs utiles pour le diagnostic du cancer comme prouvé par des études dans le cancer de la prostate [9].

Par conséquent, nous avons cherché à (i) d'évaluer les GPCR exprimés de manière différentielle dans nodal négative par rapport nodal type intestinal carcinome gastrique positive GeneChip technique de tableau. (Ii) la transcription des gènes candidats a été validé en temps réel la réaction en chaîne à transcription inverse de polymérase temps réel (RT-PCR). Nous avons évalué la traduction et la distribution histoanatomical du CXCL12 chimiokine et son récepteur de chimiokine correspondant CXCR4 dans une grande série de 347 échantillons de carcinome gastrique immunohistochimique utilisant le tissu microarray technologie, ainsi que dans 61 correspondants ganglions lymphatiques métastases sur des lames classiques (iii). Nous avons corrélé les profils d'expression traductionnelles avec un ample ensemble de caractéristiques clinico des patients, y compris la survie des patients (iv).

Résultats

expression génique différentielle dans le noeud négatif et noeud gastrique tissu cancéreux
positif

d'abord, nous avons étudié l'expression différentielle de l'ARNm dans une série de patients atteints de cancer gastrique de type 6 intestinal (3 avec et 3 sans métastases ganglionnaires) en utilisant le GeneChip Human Genome U133 plus 2.0 tableau de Affymetrix qui détecte 47.000 transcriptions et variantes ainsi que 38.500 gènes humains bien caractérisés. L'ARNm a été extrait et transcrit uniquement à partir des échantillons de tissus obtenus à partir des tumeurs primaires. Un total de 115 transcriptions ont été jugées en amont et 219 pour être régulée à la baisse dans le noeud cancer gastrique positif par rapport aux nœuds cancers gastriques négatifs (tableau S1). Suivant nous avons cherché GPCR différentiellement exprimés. Nous avons identifié 52 GPCR et les gènes GPCR liés, qui étaient en amont ou régulé à la baisse avec un facteur de changement de pli >. 1.5 (tableau S2)

En silico
analyse

Nous avons ensuite cherché le la base de données de ENTREZ de « national Center for Biotechnology information (NCBI)
" pour les entrées des RCPG et GPCR-ligands et leur rôle présumé dans la biologie de la tumeur . L'importance de l'angiotensine II de type 1-récepteur dans le cancer gastrique a été préalablement vérifiée par notre propre groupe [10]. Plusieurs études ont montré que l'expression du récepteur de chimiokines de groupe sanguin Duffy (DARC) est inversement corrélée avec la fréquence et le pronostic du cancer de la prostate [11] - [13]. Dans le modèle animal de cancer du sein, l'expression de EDG2 en corrélation avec l'incidence des métastases pulmonaires [14]. FPRS médient les effets de l'annexine 1 sur la motilité et l'invasion cellulaire, qui sont importants pour le potentiel métastatique des cellules tumorales [15]. LGR5 a été récemment montré être un marqueur de cellules souches de cellules de l'intestin grêle et du côlon et de cellules souches perte spécifique de résultats Apc en néoplasies croissance progressive [16]. Collectivement, ces données fournissent la preuve que notre approche a identifié GPCR et GPCR-ligands qui peuvent être impliqués dans la biologie du cancer gastrique. En ce qui concerne les récepteurs de chimiokines et de chimiokines, l'expression de la chimiokines CCL2 et CXCL12 ont augmenté dans le cancer gastrique positif nodal par rapport aux cas négatifs nodaux (tableau supplémentaire S2). Etant donné que l'axe CXCL12-CXCR4 joue un rôle important dans la tumorigenèse, la promotion de l'angiogenèse et de la migration des cellules tumorales vers des sites métastatiques [17] - [19], nous avons choisi CXCL12 et son récepteur CXCR4 pour des analyses ultérieures

Transcription. CXCL12 et CXCR4 dans le cancer gastrique

L'expression différentielle des CXCL12- et CXCR4-ARNm a été validé en temps réel par RT-PCR dans un ensemble indépendant de 37 type intestinal échantillons de carcinome gastrique. Nous avons comparé la muqueuse non néoplasique avec la tumeur primaire, ainsi que des tumeurs primaires du noeud négatif avec des tumeurs primaires de cancers positifs de nœuds.

expression de CXCL12 était significativement augmenté dans le carcinome gastrique par rapport à la muqueuse non néoplasiques (p = 0,033 ). Confirmant les données du tableau, l'expression CXCL12 a également été régulés à la hausse dans le carcinome gastrique positif nodal par rapport aux cas négatifs nodaux. Cependant, cette différence n'a pas atteint la signification statistique (p = 0,132; la figure 1a). En ce qui concerne la croissance tumorale locale, il n'y avait pas de différence significative dans l'expression de CXCL12 dans pT1 /T2 tumeur à un stade pT3 contre les tumeurs /T4. Mais il est intéressant, l'expression de CXCL12 a montré une association significative de pT1 /PT2A contre pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; figure 1b)

Il n'y avait ni une différence d'expression CXCR4 dans le carcinome gastrique par rapport à un tissu non néoplasique. (p = 0,229), ni dans nodal négative contre le carcinome gastrique positif nodal (p = 0,22; la figure 1c). En comparant l'expression CXCR4 avec l'étendue de la tumeur locale, les niveaux CXCR4-ARNm ont augmenté avec la croissance tumorale locale. (P = 0,079; la figure 1d)

Traduction de CXCL12 dans le carcinome gastrique, corrélation avec les paramètres clinicopathologiques et analyses de survie

La traduction et la distribution histoanatomical de CXCL12 a ensuite été étudiés par immunohistochimie dans 347 échantillons de carcinome gastrique. Dans 291 cas, CXCL12 immunoréactivité était évaluable. Les cellules tumorales expriment CXCL12 à 244 sur 291 (84%) échantillons. Une forte réaction immunologique cytoplasmique et membranaire a été observée chez 143 (49%) des cas et une faible coloration dans 101 (35%). 47 tumeurs (16%) manquaient CXCL12-immunoréactivité. Tous les échantillons de tumeur ont montré une CXCL12 positivité distincte des cellules endothéliales vasculaires, qui a servi comme un contrôle positif interne (figure 2a-c). Les analyses statistiques ont montré une corrélation significative entre l'expression de CXCL12 dans les cellules tumorales et les métastases à distance (p = 0,043) ainsi que le grade tumoral (p = 0,0064). Tous les autres paramètres clinicopathologiques ont montré aucune association avec l'expression de CXCL12 dans les cellules tumorales (tableau 1). Lorsque l'on divise la cohorte en deux groupes, à savoir du type intestinal et le carcinome gastrique de type diffus, aucune corrélation n'a été trouvée entre l'expression de CXCL12 et tous les paramètres clinico de chaque groupe (données non présentées). L'expression de CXCL12 dans les cellules tumorales n'a eu aucun impact sur la survie des patients (groupe entier: p = 0,830; carcinome type intestinal: p = 0,766; diffus de type carcinome: p = 0,817).

Traduction de CXCR4 dans le carcinome gastrique, corrélation avec les paramètres clinicopathologiques et analyses de survie

Traduction de CXCR4 a également été étudiée par immunohistochimie. Immunoréactivité dans les cellules tumorales était évaluable dans 293 échantillons de tumeurs, dont seulement 6 (2%) ont montré une coloration membraneuse sans équivoque (catégorie 2+; la figure 2d). La plupart des échantillons de tumeurs positives CXCR4 seulement révélé une immunoréactivité de CXCR4 cytoplasmique faible (catégorie 1+, 44 cas, 15%; la figure 2e). CXCR4 nucléaire immunoréactivité n'a été observée dans tous les cas et quel type de cellule. Un ensemble de 83% (243 sur 293) des carcinomes gastriques étaient immunonegative pour CXCR4, la plupart d'entre eux montrant des leucocytes positifs concomitants CXCR4 comme un contrôle positif interne (figure 2f). Fait intéressant, comme observé précédemment dans les cancers colorectaux, 86 293 carcinomes gastriques (29%) présentaient des microvaisseaux positifs CXCR4 dans le stroma de la tumeur avec une forte immunoréactivité CXCR4 de cellules endothéliales (figure 3a). La nature vasculaire de ces structures délicates a été confirmée par un immunomarquage CD34 (figure 3b).

Lors de corréler l'expression de CXCR4 dans les cellules tumorales avec différents paramètres clinicopathologiques, l'expression CXCR4 était significativement associée à l'étendue supérieure locale de la tumeur (T-état p = 0,030). Cependant, aucune association de l'expression de CXCR4 tumorale et d'autres variables clinico-pathologiques ont été trouvées (tableau 2). Lors de l'analyse du sous-groupe des carcinomes gastriques de type intestinal, aucune association n'a été trouvée avec tous les paramètres clinico (données non présentées).

Ensuite, nous avons étudié la corrélation entre l'expression de CXCR4 dans les cellules endotheliales (expression de CXCR4 vasculaire, vCXCR4) de la tumeur microvaisseaux et divers paramètres clinicopathologiques. Fait intéressant, l'expression de CXCR4 dans les microvaisseaux fortement corrélé de manière significative avec la croissance tumorale locale (T-catégorie; p = 0,0001) ainsi qu'avec le stade UICC-tumorale (p = 0,0059). Même dans les sous-groupes de type intestinal et le carcinome gastrique de type diffus, l'expression vCXCR4 était significativement associée à l'extension tumorale locale (type intestinal: p = 0,004; diffuse Type: p = 0,030) et le stade UICC-tumeur (type intestinal: p = 0,020) . En outre l'expression vCXCR4 était significativement associée à l'âge du patient (p = 0,0148) dans l'ensemble du groupe (tableau 3).

L'analyse de survie a montré que l'expression de CXCR4 dans les cellules tumorales de carcinome gastrique, ainsi que dans les microvaisseaux tumoraux n'a eu aucune incidence . sur la survie

concomitantes CXCL12 /expression vCXCR4 dans gastrique carcinome

Depuis l'axe CXCL12-CXCR4 a été montré pour être impliqués dans la progression tumorale [17] - [19], nous avons étudié la corrélation de l'expression concomitante de CXCL12 et vCXCR4 avec des paramètres clinicopathologiques. En effet, les tumeurs positives CXCL12-vCXCR4 ont été associés à l'étendue locale de la tumeur plus élevée (p = 0,0014) et les stades UICC plus élevés (p = 0,017). Cependant, il n'a eu aucun impact sur la survie des patients, même dans les sous-groupes de carcinome gastrique de type intestinal et diffus.

motif d'expression de CXCL12 et CXCR4 à faire correspondre les métastases ganglionnaires

Les axes CXCL12-CXCR4 a été signalé à être impliqués dans les processus métastatiques dans diverses entités tumorales. Nous avons donc examiné CXCL12 et CXCR4 immunoréactivité dans un sous-ensemble 61 correspondant de métastases des ganglions lymphatiques. Le motif d'expression de CXCL12 était disponible pour 46 métastases. Dans l'ensemble, 4 métastases ganglionnaires étaient CXCL12 négatifs comme leur tumeur primaire correspondante. 40 métastases des ganglions lymphatiques ont montré une positivité de CXCL12 clair, selon la tumeur primaire. L'intensité de la coloration est très hétérogène montrant des cellules tumorales fortement positives grappes de cellules tumorales adjacentes à légèrement teinté. Cependant, deux métastases ont révélé CXCL12 immunoréactivité bien qu'aucune expression de CXCL12 a été détectée dans la tumeur primaire.

CXCR4 immunoréactivité a été évaluée dans 54 métastases des ganglions lymphatiques. Fait intéressant, aucun d'entre eux a montré une expression de CXCR4. Même les tumeurs (n = 6), montrant une positivité de CXCR4 faible dans la tumeur primaire, manquait l'expression de CXCR4 dans les métastases des ganglions lymphatiques correspondants. Cependant, toutes les métastases des ganglions lymphatiques ont clairement révélé les lymphocytes positifs CXCR4, qui ont servi de contrôle positif interne. Fait intéressant, dans trois cas intratumorales microvaisseaux positifs CXCR4 étaient détectables.

Discussion

récepteurs G couplés aux protéines représentent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires. Cinq pour cent de l'ensemble du code des gènes humains pour plus de 800 GPCR différents et environ 80 ligands différents ont été identifiés jusqu'à présent [20]. RCPG sont des cibles pharmacologiques les plus courantes dans la médecine, à savoir près de 30% de tous les médicaments sont dirigés contre les RCPG. La preuve que les GPCR augmente peuvent également être des cibles prometteuses pour le traitement du cancer. Dans cette étude, nous avons cherché à trouver des GPCR qui sont exprimés différemment dans les cancers gastriques positifs de noeuds et peuvent donc être considérés comme des objectifs futurs pour le traitement du cancer gastrique. Nous avons trouvé 52 GPCR et les gènes GPCR-connexes qui sont en amont ou régulé à la baisse dans le tissu ganglionnaire primaire de cancer gastrique par rapport au noeud cancer négatif. Plusieurs des GPCR ont été précédemment montré pour être impliqués dans la biologie de la tumeur, comme AT1R, EDG2, DARC et FPR1 [10], [11], [14], [15]. Le plus intéressant, la liste comprenait également LGR5 [16], qui a été récemment révélé être un marqueur de cellules souches dans l'intestin grêle et le côlon. En outre, la perte spécifique de Apc dans les cellules des résultats de LGR5 positifs dans les néoplasies croissantes progressivement. Ainsi, in silico
validation de nos données soutenu l'hypothèse que les RCPG sont impliqués dans la biologie des tumeurs du cancer gastrique.

Nos études de validation suivantes à l'aide d'un groupe de patients indépendants ont montré que la GPCR- CXCL12 ligand est exprimé dans les cellules tumorales de la majorité des cancers gastriques. En outre, l'expression de CXCL12 est négativement associée à des métastases à distance et le grade de la tumeur. Au contraire, seulement 17% des carcinomes gastriques a montré des cellules tumorales immunopositif CXCR4, qui était associée à l'étendue supérieure de la tumeur locale. Fait intéressant, environ un tiers des carcinomes gastriques a montré CXCR4 microvaisseaux tumorales positives. expression vasculaire CXCR4 était significativement associée à l'extension tumorale locale plus élevée, ainsi que la hausse UICC-étapes. Lors de l'expression à la fois, CXCL12 dans les cellules tumorales et CXCR4 dans les microvaisseaux tumorales, ces tumeurs ont également été significativement associés à T- supérieur et UICC-étapes, soutenant le rôle de l'axe CXCL12-CXCR4 dans néoangiogenèse du cancer gastrique.

parmi les GPCR, le système de chimiokine contribue de manière significative la progression de la tumeur par la modulation de la réaction inflammatoire locale, la prolifération des cellules tumorales, la migration et la survie, ainsi que la néo-angiogénèse [4]. CXCR4 récepteur de chimiokine a été trouvé initialement pour réguler le homing des lymphocytes dans l'inflammation et représente un co-récepteur du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) [21]. Physiologiquement, l'axe CXCL12-CXCR4 est impliqué dans la migration des cellules embryonnaires du système nerveux central, la moelle osseuse et le cœur [22], [23]. Elle joue un rôle crucial dans les processus métastatiques, comme indiqué pour le sein [24], [25], de l'ovaire [26] et le cancer de la prostate [27] et CXCL12 est fortement exprimé dans les organes qui sont des sites fréquents de métastases à distance tels que les poumons, le foie et les ganglions les noeuds [28]. Dans le cancer gastrique, les données concernant la voie de CXCL12-CXCR4 sont rares [29]. Il existe certaines preuves que CXCR4 exprimant des carcinomes gastriques plus susceptibles de développer un écart péritonéale de la tumeur, et l'ascite maligne contient des concentrations élevées de CXCL12 [30]
.

La comparaison de nos données de tableau de gènes avec ceux obtenus par RT-PCR et immunohistochimie, il est intéressant de noter que l'expression différentielle de CXCL12 dans le carcinome gastrique positif noeud a été confirmé sur la transcription mais pas sur le niveau de la traduction. Ici, la détection immunohistochimique de CXCL12 dans les cellules tumorales en corrélation uniquement avec des métastases distantes et le grade de la tumeur, mais pas avec la propagation nodal. Cependant, CXCL12 a été trouvé non seulement dans les cellules tumorales, mais aussi dans les cellules endothéliales et les cellules stromales [31] et l'expression globale dans le compartiment de tissu entier est plus difficile à évaluer par immunohistochimie. Au contraire, nos études de transcription utilise des homogénats de tissus qui intègrent tous CXCL12 exprimant des cellules du tissu tumoral. Néanmoins, il convient de garder à l'esprit que la transcription du gène ne pas toujours en corrélation avec la traduction d'ARNm et que l'effet biologique de la tumeur de CXCL12 peut également dépendre de la présence et de la distribution histoanatomical de CXCR4. À l'appui de cette affirmation, nous avons pu montrer que l'expression concomitante de CXCL12 dans les cellules tumorales et CXCR4 dans les microvaisseaux tumorales en corrélation avec la croissance tumorale locale et le stade UICC-tumeur.

Il a été signalé que tumorale CXCR4 positivité est en corrélation significative avec le développement de carcinose péritonéale [30]. En outre, l'expression de CXCR4 forte était significativement associée à des métastases des ganglions lymphatiques, les étapes de l'UICC plus élevés et un taux de survie à 5 ans réduite [32]. Nos résultats semblent différer de ces études antérieures. Lors de l'évaluation immunoréactivité CXCR4 dans les cellules tumorales, on a observé un taux d'expression faible. Seulement 17% des échantillons de tumeur a montré une CXCR4 immunoréactivité la plupart du temps faible. En outre, tous les 61 correspondants métastases ganglionnaires manquaient l'expression de CXCR4. Ce schéma de coloration peut expliquer, pourquoi, par exemple dans les carcinomes gastriques de type intestinal, l'expression CXCR4 seulement était significativement associée à la croissance locale de la tumeur (T-catégorie), mais pas avec d'autres facteurs clinicopathologiques comme décrit précédemment. Nous avons utilisé un anticorps CXCR4 caractérisé soigneusement avec une plus grande spécificité que les anticorps disponibles dans le commerce, comme indiqué par Fisher et al [33]. Cette différence de spécificité pourrait servir pour différents motifs de coloration. Par exemple, une expression de CXCR4 nucléaire, qui a été signalé à être associée à des métastases ganglionnaires dans le cancer colorectal, n'a pas été vu dans notre série [34]. En outre, on n'a jamais détecté CXCR4 positivité dans les cellules stromales comme décrit dans une étude de Saigusa et ses collègues [35]. Pour clarifier, si la voie de CXCR4-CXCL12 contribue finalement à la génération des métastases dans le cancer gastrique, en particulier les métastases ganglionnaires, d'autres études sont nécessaires.

Environ un tiers des carcinomes gastriques examinés a montré CXCR4 à la tumeur positif microvaisseaux environnante . Les cellules tumorales requièrent quantité suffisante d'oxygène et de nutriments pour maintenir la survie. Même avec des anomalies génétiques qui dysréguler la croissance et la survie des cellules individuelles, les tumeurs ne peuvent pas agrandir au-delà de 1-2 mm ^{3 sans vascularisation et la mort cellulaire induite par l'hypoxie se produit. Il a été démontré que le CXCR4 est exprimé par les cellules endothéliales et la stimulation de CXCR4 par CXCL12 a un effet pro-angiogénique [36]. En outre, CXCR4 est un gène inductible par l'hypoxie, régulée par le facteur 1α induite par l'hypoxie (HIF1α). Lorsque l'oxygène est rare, comme dans les tumeurs à croissance rapide, HIF1α améliore l'expression de CXCR4 [37]. L'augmentation de l'expression de CXCR4 dans les cellules endotheliales observée dans notre collectif de la tumeur peut faire partie d'une réponse hypoxique intégrée de la croissance tumorale qui permet la génération de nouveaux vaisseaux sanguins. Dans notre groupe d'étude, l'expression de CXCR4 vasculaire corrélée de façon significative avec la mesure de la croissance tumorale locale. Dans 8% des tumeurs T1 /PT2A (4 sur 52) et dans 34% des T2b /T3 /tumeurs pT4 (81 sur 239) microvaisseaux positifs CXCR4 étaient détectables. carcinomes gastriques T2b /T3 /T4 stade plus probable abritent un micro-environnement hypoxique que les tumeurs T1 /T2a stade et par conséquent pourraient induire l'expression du gène CXCR4 et l'angiogenèse. La détection de micro-vaisseaux positifs CXCR4 dans les grandes métastases des ganglions lymphatiques (> 9 mm de diamètre) a corroboré ces observations. De plus, nous avons précédemment montré des résultats comparables dans le carcinome du côlon [38]. En outre, comme indiqué dans le glioblastome [39], des échantillons de tumeur révélant les deux, CXCL12 cellules tumorales positives et microvaisseaux positives CXCR4 ont été très significativement associé à l'extension tumorale locale élevée et stades élevés UICC, soutenant en outre l'importance d'un axe fonctionnel CXCL12-CXCR4 dans la biologie du cancer gastrique}

en résumé, nous démontrons que des GPCR sont exprimés de manière différentielle dans le tissu du cancer gastrique et peuvent contribuer à la biologie tumorale. les tumeurs exprimant à la fois, CXCL12 dans les cellules tumorales et CXCR4 dans la tumeur microvaisseaux environnante, montrent une très association significative avec la croissance tumorale locale et stades UICC. Ces résultats, ainsi que nos données antérieures sur le carcinome colorectal, corroborent le rôle de l'axe CXCL12-CXCR4 dans la tumeur néovascularisation dans les tumeurs gastro-intestinales. La voie CXCL12-CXCR4 pourrait être nouvelle cible antiangiogénique prometteuse pour le traitement des cancers gastriques.

Matériel et méthodes

échantillons tumoraux

Des échantillons de tissus de cancer gastrique ont été obtenus chirurgicalement au la Charité University Hospital de Berlin (1995-2008). tissu frais congelé de 6 cas de carcinome gastrique de type intestinal a été utilisé pour l'analyse GeneChip (nodal négative: 3 patients; nodal positif: 3 patients; femelle-mâle-rapport: 1h02). Une série indépendante de tissus normaux et cancéreux tumeur adjacents par paires à partir de 37 carcinomes gastriques de type intestinal ont été examinés en temps réel par RT-PCR (nodale négatif: 12 patients; nodal positif: 25 patients; femelle-mâle rapport: ~1:1 , pour les caractéristiques détaillées des patients voir le tableau S3). Pour les analyses immunohistochimiques, une cohorte de patients de 347 patients consécutifs atteints de cancer gastrique a été examiné, comprenant 194 type intestinal et 122 carcinomes diffus de type selon la classification Laurén. 31 échantillons ont montré d'autres sous-types histologiques (à savoir mucinous, tubulaire, indifférencié). En bref, la cohorte est composée de 220 hommes et 127 femmes. L'âge moyen des patients au moment du diagnostic était de 64 ans. Les données de survie était disponible à partir de 196 de ces patients. Les données de suivi pour les autres patients étaient absents parce que ces patients ne résident pas à proximité de l'hôpital et ont été perdus de vue. Sur 196 patients, 124 sont morts au cours du suivi. Le suivi médian pour les patients encore en vie à l'extrémité de l'analyse était de 33 mois. Sur les 61 patients, tissu correspondant métastases ganglionnaires était disponible (27 type intestinal, 26 type diffus, 8 autres sous-types histologiques). Seuls les patients avec histologiquement confirmé le cancer gastrique et de tissus adéquats disponibles ont été inclus. Les patients atteints de cancer de l'estomac neoadjuvantly traités ou d'autres tumeurs malignes connues ont été exclus de l'étude. Ce projet a été approuvé par le comité d'éthique local (ref. Numéro EA1 /06/2004).

analyse GeneChip

L'ARN total a été isolé avec du phénol-chloroforme à l'aide du kit d'isolation MIRVANA ™ miRNA ( Ambion, Austin, États-Unis). ADN contaminant a été éliminé par traitement DNase (kit Turbo DNAfree; Ambion, Austin, États-Unis) à 37 ° C pendant 30 min. Nous avons utilisé le GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 tableaux (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) selon le protocole du fabricant pour analyser les niveaux d'expression d'ARNm. Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS 1.4) automatise le contrôle des GeneChip® stations fluidiques et GeneChip Scanner 3000.

Bioinformatics

Les données brutes ont été analysées avec le logiciel Affymetrix GeneChip Operating (GCOS 1.4) . La détection p-valeur d'une transcription détermine l'appel de détection, qui indique si la transcription est détectée de manière fiable (p < 0,05; présent) ou non détectée (absent). Pour permettre la comparaison entre les puces les données ont été mises à l'échelle à une intensité globale de 500. Les données Mining Tool 3.0 (Affymetrix) et progiciel de GeneSpring 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) ont été utilisés pour des résultats moyens à partir de différents échantillons et effectuer des statistiques analyse pour comparer entre le cancer gastrique (N1) et sans métastases des ganglions (N0) lymphatiques. Les données de six tableaux ont été normalisées pour tenir compte de la variabilité dans l'hybridation des paires de sondes et d'autres objets d'hybridation. La normalisation comprend les trois étapes suivantes: d'abord, la transformation des données (ensemble des mesures moins 300,0 à 300,0); en second lieu, par puce (normaliser chaque puce au 50e percentile des mesures prises à partir de cette puce); et troisièmement, par gène (normaliser chaque gène à la médiane des mesures pour ce gène). Le facteur de variation a été calculé pour chaque gène comme étant la moyenne arithmétique des valeurs d'expression normalisées de N1, divisé par la moyenne arithmétique des valeurs d'expression normalisées de N0. Les données brutes provenant des expériences de puces à ADN ont été téléchargés sur le Gene Expression Omnibus Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).

Real-time inverser la réaction en chaîne par polymérase transcriptase

Pour la synthèse d'ADNc, 2 pg de l'ARN total a été transcrit inverse en utilisant le kit Omniscript RT (Qiagen). Les amorces spécifiques du gène ont été conçues par le BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlin, Allemagne). Les séquences des amorces sont les suivantes: CXCR4 5 'CAG CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 'CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG; beta2-microglobuline 5 'ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA, 3' ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG. En temps réel de la transcriptase inverse amplification en chaîne par polymérase (Real-time RT-PCR) a été réalisée en utilisant le kit QuantiTect SYBR ™ Green PCR (Qiagen) et le système LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne). Les C _{t valeurs comparatives ont été normalisées à celle du gène de ménage beta2-microglobuline. Aucun contrôle de modèle (pas d'ADNc dans la PCR) ont été effectués pour chaque gène pour détecter l'amplification non spécifique ou génomique et dimérisation amorce.}

histologie

Pour les analyses histologiques, des échantillons de tissus ont été fixés dans 10% de formaline neutralisé et noyés dans de la paraffine. Coupes déparaffinées ont été colorées en utilisant hématoxyline et l'éosine. Le carcinome gastrique a été classée selon la classification de l'OMS [1]. L'étape de pTNM a été déterminée selon les lignes directrices de l'UICC

microréseau tissulaire construction

Formol-fixe et des échantillons de tissus de paraffine ont été utilisés pour générer des microarrays de tissu comme décrit précédemment [40], [41. ]. En bref, trois à six régions morphologiquement représentatives des blocs les paraffine «donateurs» ont été choisis.

• PLOS ONE: Signatures Gene Expression peut distinguer les qualités de cancer gastrique et Stages
• PLOS Genetics: miR-218 inhibitions Invasion et métastase du cancer gastrique en ciblant les Robo1 Receptor