Абстрактный
Фон
G-белком рецепторы (GPCRs) являются первыми кандидатами на новой профилактике рака и стратегии лечения. Мы искали дифференцированно выраженных GPCRs в лимфатических узлов желудка карцином.
Финансирование:. Это исследование была поддержана грантами Berliner Krebshilfe (Берлин Canceraid). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире, занимая четвертое место в общей частоте и составляет более 650 тысяч смертей в год [1]. Смертность от рака желудка превосходил только рака легких. Ранний рак желудка часто не вызывает никаких специфических симптомов. Отсутствие ранних симптомов задерживает диагноз. Следовательно, 80-90% западных пациентов с желудочной настоящее время рака с запущенными опухолями, когда местные или отдаленные метастазы уже [1] произошло. статус лимфатических узлов, особенно отношение метастазирования-положительных /метастазирования-отрицательных лимфатических узлов, является самым сильным прогностическим фактором рака [2] желудка. Уровень 5-летней выживаемости у пациентов с метастазами в 1-6 лимфатических составляет 44%, и заканчивая у пациентов только 11% с более чем 15 положительных лимфатических узлов. Частичная или полная гастрэктомия, в сочетании с адъювантной лучевой терапии и /или химиотерапии, как указано, обещает полное излечение только у пациентов с ранней стадией заболевания. В метастазами, в настоящее время используется радиотерапевтических и химиотерапевтических препаратов у бедных прогрессирования эффективность и лечение устойчивостью заболевание приводит к смерти в течение нескольких месяцев [3]. На сегодняшний день не существует каких-либо конкретных прогностическую маркер как HER2 при раке молочной железы, EGFR в немелкоклеточного рака легкого или K-RAS в колоректального рака, что позволяет более индивидуализированной терапевтической стратегии. Таким образом, необходимы новые молекулярно-целевые терапевтические подходы.
G-белком рецепторы (GPCR,) представляют на сегодняшний день является крупнейшей семейства молекул клеточной поверхности, который передают сигналы через ГТФ-связывающего белка (G-белок ) -initiated вторичного мессенджера каскады в клетку [4]. GPCRs регулируются многими агонистами, но все разделяют характерную сердцевину, состоящую из семи трансмембранных альфа-спиралей, которые связаны через три внутри- и внеклеточной трех петель. Эти рецепторы контролируют основные физиологические функции, в том числе нейротрансмиссии, гормона и высвобождение фермента из эндокринных и экзокринных желез, иммунных реакций, мышечного сокращения и регулирования кровяного давления, чтобы назвать несколько [4].
<Р> Злокачественные клетки часто угнать нормальный физиологический функции GPCR, чтобы выжить, размножаться автономно и уклоняться от иммунной системы. Кроме того GPCR, играют центральную роль в ангиогенезе, индуцированном опухолью и метастазирование рака. Многие солидные опухоли полагаются на GPCR, чтобы вызвать ангиогенный ответ либо путем воздействия на эндотелиальные или стромальных компонентов непосредственно или посредством регулирования высвобождения или активности других ангиогенных медиаторов, таких, как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) или основной фактор роста фибробластов (bFGF) путем стромы и клетки иммунной системы [5]. Раковые клетки манипулировать GPCRs для привлечения эндотелиальные клетки и привести их к вторжению опухолевой массы, тем самым образуя новые сосуды, чтобы обеспечить питательными веществами и кислородом. Многие виды рака метастазировать в определенные органы, то, что часто вызвано аномальным экспрессии GPCRs в раковых клетках - особенно рецепторов хемокинов - одновременно с выходом хемокинов из вторичных органов [6]
<р> Доставка лекарств, визуализации опухоли. и биомаркеры, предсказывающие злокачественности являются применение GPCRs, чтобы выделить: Радио-меченых пептидов, которые связываются с GPCR, могут иметь широкое применение для диагностики и лечения рака [7]. Лиганды, которые связываются с GPCRs также конъюгированы с цитотоксическими агентами, чтобы специфически нацелены злокачественные клетки, которые сверхэкспрессируют эти рецепторы, тем самым уменьшая побочные эффекты [8]. Кроме того, GPCRs может быть ценным биомаркеров для диагностики рака, как доказано исследованиями при раке простаты [9].
<Р> Таким образом, мы стремились (I) оценки дифференцированно выраженных GPCRs в узловой отрицательным по сравнению с узловой положительного кишечного типа карциномы желудка путем GeneChip техника массив. (II) транскрипцию генов-кандидатов была подтверждена в реальном времени обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (в режиме реального времени RT-PCR). Мы оценили перевод и histoanatomical распределение хемокинов CXCL12 и соответствующий рецептор хемокинов CXCR4 в большой серии из 347 образцов желудочного рака иммуногистохимии с использованием ткани микрочипов-технологии, а также в 61 согласующих метастазов в лимфатических узлах на обычных слайдах (III). Мы сопоставили поступательные паттерны экспрессии с достаточным набором клинико-патологическими характеристик пациента, в том числе выживаемость пациентов (IV).
Дифференциальная экспрессия генов в узле отрицательным и положительным узлом желудка раковой ткани
<р> во-первых, мы изучали дифференциальную экспрессию мРНК в серии типа 6 кишечного рака желудка больных (3 с и 3 без метастазов в лимфатических узлах) с использованием генома U133 GeneChip® Human Plus 2.0 массив из Affymetrix, который обнаруживает 47000 стенограммы и варианты а также 38500 хорошо охарактеризованные человеческие гены. мРНК экстрагировали и транскрибируется только из образцов тканей, полученных от первичных опухолей. В общей сложности 115 транскриптов были признаны вверх и 219, чтобы быть понижающей регуляции в лимфатических узлов раком желудка по сравнению с узловыми отрицательным рака желудка (таблица S1). Затем мы искали дифференцированно выраженных GPCRs. Мы определили 52 GPCRs и GPCR-родственных генов, которые были вверх или вниз регулируется с коэффициентом кратным изменением &Гт. 1.5 (таблица S2)
В силикомарганца Транскрипция. CXCL12 и CXCR4 при раке желудка Перевод CXCL12 при раке желудка, корреляция с клинико-патологическими параметрами и анализа выживаемости <бр> перевод и histoanatomical распределение CXCL12 был впоследствии изучен иммуногистохимии в 347 образцах карциномы желудка. В 291 случаях CXCL12 иммунореактивности был обложению. Опухолевые клетки экспрессируют CXCL12 в 244 из 291 (84%) образцов. Сильный цитоплазматический и мембранозной иммунореакция наблюдалось у 143 (49%) больных и слабым окрашиванием в 101 (35%). 47 опухолей (16%) не имели CXCL12-иммунореактивности. Все образцы опухолей показали отличную CXCL12 положительность сосудистых эндотелиальных клеток, которые служили в качестве внутреннего положительного контроля (рисунок 2а-с). Статистический анализ показал значительную корреляцию между экспрессией CXCL12 в опухолевых клетках и отдаленных метастазов (р = 0,043), а также степени дифференцировки опухоли (р = 0,0064). Все остальные параметры клинико-патологических не показали никакой связи с выражением CXCL12 в опухолевых клетках (таблица 1). При делении когорты на две группы, т.е. типа кишечный и диффузный тип рака желудка, никакой корреляции не было найдено между экспрессией CXCL12 и любой клинико-патологическими параметра либо группы (данные не показаны). Выражение CXCL12 в опухолевых клетках не оказывает влияния на выживаемость пациентов (вся группа: р = 0,830; кишечного типа рака: р = 0,766; диффузный типа карциномы: р = 0,817). Сопутствующее CXCL12 /экспрессии vCXCR4 в карциномы желудка Образцы Опухолевые Биоинформатика Real-time с использованием обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции
анализа
<р> затем мы обыскали ENTREZ
база данных о " Национальный центр биотехнологической информации (NCBI)
" для записей в GPCRs и GPCR-лигандов и их ориентировочное роль в биологии опухоли , Значение ангиотензина II типа 1-рецептора при раке желудка была ранее подтверждена нашей собственной группой [10]. Несколько исследований показали, что экспрессия рецептора хемокинов Duffy группы крови (DARC) обратно коррелировала с распространенностью и прогноза рака предстательной железы [11] - [13]. В животной модели рака молочной железы экспрессия EDG2 коррелирует с частотой метастазов в легких [14]. FPRs опосредуют действие аннексина 1 на клеточной подвижности и инвазии, которые являются важными для метастатического потенциала опухолевых клеток [15]. LGR5 было недавно показано, что стволовые клетки маркером клеток тонкой кишки и толстой кишки и стволовых клеток специфическая потеря результатов в APc прогрессивно растущих неоплазий [16]. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что наш подход определил GPCRs и GPCR-лиганды, которые могут быть вовлечены в желудочном биологии рака. Что касается рецепторы хемокинов и хемокинов, экспрессия CCL2 хемокинов и CXCL12 в узловой положительного рака желудка были увеличены по сравнению с узловыми негативных случаев (дополнительную таблицу S2). Так как ось CXCL12-CXCR4 играет заметную роль в tumourigenesis, стимуляции ангиогенеза и миграции опухолевых клеток к метастазирования [17] - [19], мы выбрали CXCL12 и его рецептора CXCR4 для дальнейших анализов
<р> дифференциальное выражение CXCL12- и CXCR4-мРНК была подтверждена в реальном времени RT-PCR в независимом наборе 37 образцов кишечного типа рака желудка. Мы сравнили неопухолевых слизистую оболочку с первичной опухоли, а также первичные опухоли узла с отрицательным первичных опухолей лимфатических узлов раковых образований.
<Р> Выражение CXCL12 было значительно увеличено при раке желудка по сравнению с неопухолевых слизистой оболочки (р = 0,033 ). Подтверждение данных массива, экспрессия CXCL12 также повышающей регуляции в узловой положительного рака желудка по сравнению с узловыми негативных случаев. Тем не менее, эта разница не достигала статистической значимости (р = 0,132; рисунок 1а). Что касается роста местной опухоли, не было никакого существенного различия в экспрессии CXCL12 в /Т2 опухоли стадии pT1 против опухолей /Т4 pt3. Но что интересно, экспрессия CXCL12 показал статистически значимую связь в pT1 /pT2a по сравнению с pT2b /T3 /T4 (р = 0,049; рисунок 1b)
<р> Был ни разница в экспрессии CXCR4 в желудочном карциномы по сравнению с не-опухолевой ткани. (р = 0,229), ни в узловой отрицательным по сравнению с узловой желудочной карциномы (р = 0,22; фигура 1c). Сравнивая выражение CXCR4 со степенью локальной опухоли, уровни CXCR4-мРНК увеличивается с ростом локальной опухоли. (Р = 0,079; фигура 1d)
Перевод CXCR4 при раке желудка, корреляция с клинико-патологическими параметрами и анализа выживаемости
<р> Перевод CXCR4 также была изучена методом иммуногистохимии. Иммунореактивности в опухолевых клетках был обложению в 293 образцах опухолей, из которых только 6 (2%) показали однозначный мембранную окрашивания (категория 2+, рисунок 2d). Большинство образцов опухолей положительным CXCR4 только показал слабый цитоплазматический CXCR4 иммунореактивности (категория 1+, 44 случаев заболевания, 15%; фигура 2Е). Ядерный CXCR4 иммунореактивности не наблюдалось в любом случае и любого типа клеток. В целом 83% (243 из 293) желудочных карцином были immunonegative для CXCR4, большинство из них, показывая сопутствующую CXCR4 положительные лейкоциты в качестве внутреннего положительного контроля (рисунок 2f). Интересно отметить, что, как ранее наблюдалось в колоректальных карцином, 86 из 293 желудочных карцином (29%) показали положительные CXCR4 микрососуды в строме опухоли с сильным CXCR4 иммунореактивности эндотелиальных клеток (фигура 3a). Сосудистый характер этих деликатных структур было подтверждено CD34 иммунным окрашиванием (фигура 3b).
<Р> Когда соотнесения экспрессию CXCR4 в опухолевых клетках с различными клинико-патологическими параметрами, выражение CXCR4, было в значительной степени связано с более высокой степени локальной опухоли (Т-статус; р = 0,030). Тем не менее, никаких дальнейших ассоциаций опухолевой экспрессии CXCR4 и других клинико-патологических переменных не были найдены (таблица 2). При анализе подгруппы кишечной желудочных карцином типа, никакие ассоциации не были найдены с любым клинико-патологическими параметра (данные не показаны).
<Р> Затем мы исследовали корреляцию между экспрессией CXCR4 в эндотелиальных клетках сосудов (выражение CXCR4, vCXCR4) опухоли микрососуды и различные параметры. клинико-патологических Интересно, что экспрессия CXCR4 в микрососудах коррелировали сильно заметно с локального роста опухоли (Т-категории; р = 0,0001), а также со стадией МСБР опухоли (р = 0,0059). Даже в подгруппах типа кишечного и диффузного типа рака желудка, экспрессия vCXCR4 была в значительной степени связано с локальной степени опухоли (кишечный тип: р = 0,004; диффузный тип: р = 0,030) и стадии UICC-опухоли (типа кишечных: р = 0,020) , Кроме того экспрессия vCXCR4 была значимо связана с возрастом пациента (р = 0,0148) во всей группе (таблица 3).
<Р> Анализ выживаемости показал, что экспрессия CXCR4 в опухолевых клетках карциномы желудка, а также в опухолевых микрососудов не оказывает влияния . на выживание
<р> Так как оси CXCL12-CXCR4 было показано, участвует в прогрессии опухоли [17] - [19], мы исследовали корреляцию сопутствующего экспрессии CXCL12 и vCXCR4 с клинико-патологическими параметрами. Действительно, CXCL12-vCXCR4 положительные опухоли были связаны с более высокой степени локальной опухоли (р = 0,0014) и более поздних стадиях UICC (р = 0,017). Тем не менее, это не оказало влияния на выживаемость пациентов, даже в подгруппах кишечника и диффузного рака желудка типа.
паттерн экспрессии CXCL12 и CXCR4 в соответствие метастазами в лимфатических узлах
<р> Ось CXCL12-CXCR4 сообщалось, что участвует в метастатических процессов в различных опухолевых образований. Поэтому мы исследовали CXCL12 и CXCR4 иммунореактивности в подгруппе 61 согласующих метастазов в лимфатических узлах. Паттерн экспрессии CXCL12 был доступен в течение 46 метастазов. В целом, 4 метастазов в лимфатических узлах были CXCL12 отрицательным, как и их соответствующей первичной опухоли. 40 метастазами в лимфатических узлах показали четкую CXCL12 позитивности в соответствии с первичной опухоли. Интенсивность окрашивания была очень неоднородна показывая сильно положительные опухолевые клетки, примыкающие к слабо окрашиваются скопления опухолевых клеток. Тем не менее, два метастазах показали CXCL12 иммунореактивности, хотя ни одно выражение CXCL12 не обнаружено в первичной опухоли.
<Р> CXCR4 иммунореактивность оценивали в 54 метастазов в лимфатических узлах. Интересно, что ни один из них не показал никакого выражения CXCR4. Даже те опухоли (п = 6), показывая слабый CXCR4 положительность в первичной опухоли, не хватало экспрессии CXCR4 в соответствующих метастазов в лимфатических узлах. Тем не менее, все метастазов в лимфатических узлах выявлены четко CXCR4 положительные лимфоциты, которые служили в качестве внутреннего положительного контроля. Интересно, что в трех случаях intratumoural CXCR4 положительных микрососудов были обнаружены.
Обсуждение
<р> G-белком рецепторы представляют собой самую крупную семейство трансмембранных рецепторов. Пять процентов всех генов человека кода для более чем 800 различных GPCRs и около 80 различных лигандов выявлено не было до сих пор [20]. GPCRs являются наиболее распространенными фармакологические мишени в медицине, то есть почти 30% всех лекарств направлены против GPCRs. Растет объем фактических данных, что GPCRs также могут быть перспективными объектами для терапии рака. В данном исследовании мы стремились найти GPCRs, которые дифференцированно выражены в лимфатических узлов рака желудка и, следовательно, могут рассматриваться в качестве будущих мишеней для лечения рака желудка. Мы нашли 52 GPCRs и GPCR-родственных генов, которые вверх или вниз регулируется в узле положительной первичной желудочной ткани рака по сравнению с узлом негативным раком. Некоторые из GPCRs были ранее показано, участвует в биологии опухолей, таких как AT1R, EDG2, DARC и FPR1 [10], [11], [14], [15]. Самое интересное, что наш список вошли также LGR5 [16], который в последнее время было показано, что стволовая клетка маркером в тонкой кишке и толстой кишке. Кроме того, удельные потери АРС в LGR5-позитивных клетках приводит к прогрессивно растущих неоплазий. Таким образом, в силикомарганца
проверки наших данных подтвердили гипотезу о том, что GPCRs участвуют в биологии опухоли рака желудка.
<Р> Наши последующие исследования по валидации, с помощью группы независимых пациентов показали, что GPCR- лиганд CXCL12 выражается в опухолевых клетках большинства желудочных карцином. Более того, экспрессия CXCL12 отрицательно связана с отдаленными метастазами и степени дифференцировки опухоли. Напротив, только 17% желудочных карцином показали CXCR4 иммунопозитивные опухолевых клеток, что было связано с более высокой степени локальной опухоли. Интересно, что около одной трети желудка карцином показали CXCR4 положительная опухоль микрососудов. выражение Сосудистый CXCR4 было в значительной степени связано с более высокой степени местной опухоли, а также высших UICC стадий развития. При экспрессии обоих, CXCL12 в опухолевых клетках и CXCR4 в опухолевых микрососудов, эти опухоли также были связаны с более высокими Т- и UICC стадий развития, поддерживая роль оси CXCL12-CXCR4 в неоангиогенезом рака желудка
. <Р> Среди GPCRs, система хемокиновых вносит значительный вклад в развитие опухоли посредством модуляции местной воспалительной реакции, пролиферации опухолевых клеток, миграцию и выживаемость, а также неоангиогенезом [4]. CXCR4-рецептора хемокина первоначально был найден регулировать хоминга лимфоцитов в воспалении и представляет собой корецептор для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [21]. Физиологически, ось CXCL12-CXCR4 участвует в миграции зародышевых клеток центральной нервной системы, костного мозга и сердца [22], [23]. Он играет важную роль в метастатических процессах, как показано на рак молочной железы [24], [25], яичников [26] и рак предстательной железы [27] и CXCL12 сильно выражены в органах, которые являются частыми местами отдаленных метастазов, как легких, печени и лимфы узлы [28]. При карциноме желудка, данные о CXCL12-CXCR4 пути немногочисленны [29]. Существует ряд доказательств, что CXCR4 выражения желудочных карцином более вероятно развитие перитонеальный распространение опухоли, и злокачественные асцит содержит высокие концентрации CXCL12 [30]
. <Р> Сравнивая наши данные набора генов с результатами, полученными с помощью ОТ-ПЦР и иммуногистохимии, было интересно отметить, что дифференциальное выражение CXCL12 в узле положительного рака желудка был подтвержден на транскрипционном, но не на уровне трансляции. Здесь иммуногистохимическое определение CXCL12 в опухолевых клетках коррелирует только с отдаленными метастазами и степени дифференцировки опухоли, но не с узловой распространения. Тем не менее, CXCL12 был обнаружен не только в опухолевых клетках, но и в эндотелиальных и стромальных клеток [31], и общее выражение в отделении всей ткани труднее оценить с помощью иммуногистохимии. Напротив, наши транскрипционные исследования использовали гомогенатах ткани, которые объединяют все CXCL12, выражающую клетки ткани опухоли. Тем не менее, он должен иметь в виду, что ген транскрипции не всегда коррелируют с трансляции мРНК и что опухоль биологический эффект CXCL12 может также зависеть от наличия и histoanatomical распределение CXCR4. В поддержку этого утверждения, мы смогли показать, что сопутствующее экспрессию CXCL12 в опухолевых клетках и CXCR4 в опухолевых микрососудов коррелирует с ростом локальной опухоли и стадии UICC-опухоли.
<Р> Было сообщено, что туморальный CXCR4 позитивности значительно коррелирует с развитием перитонеального карциноматоза [30]. Кроме того, сильное выражение CXCR4 было в значительной степени связано с метастазами в лимфатических узлах, более высокие ступени UICC и пониженной ставке 5-летняя выживаемость [32]. Наши результаты по всей видимости, отличаются от этих предыдущих исследований. При оценке CXCR4 иммунореактивность в опухолевых клетках, наблюдалась низкая скорость экспрессии. Только 17% образцов опухолей показал преимущественно слабый CXCR4 иммунореактивности. Кроме того, все 61 согласующих метастазов в лимфоузлах не хватало экспрессии CXCR4. Эта картина окрашивания может объяснить, почему, например, в кишечных желудочных карцином типа, экспрессия CXCR4 только была в значительной степени связано с ростом местной опухоли (Т-категории), но не с другими клинико-патологическими факторами, как описано выше. Мы использовали тщательно характеризующийся CXCR4 антитела с более высокой специфичностью, чем коммерчески доступных антител, как показано Фишером и его коллегами [33]. Эта разница в специфичности может служить для различных моделей окрашивания. Например, выражение ядерного CXCR4, который, как сообщается, связан с метастазами в лимфатических узлах при колоректальном раке, не был замечен в нашей серии [34]. Кроме того, мы никогда не обнаруживали CXCR4 положительности в стромальных клетках, как описано в исследовании Saigusa и его коллеги [35]. Чтобы уточнить, если CXCR4-CXCL12 путь в конечном счете, способствует генерации метастазов при карциноме желудка, особенно метастазов в лимфатических узлах, необходимы дальнейшие исследования.
<Р> Около одной трети исследованных желудочных карцином показал положительный результат CXCR4 tumour- окружающих микрососудов , Опухолевые клетки требуют достаточного количества кислорода и питательных веществ для поддержания выживания. Даже с генетическими аномалиями, которые dysregulate роста и выживания отдельных клеток, опухоли не могут увеличить за пределы 1-2 мм 3 без васкуляризации и гипоксия-индуцированной гибели клеток происходит. Было показано, что CXCR4, экспрессируется эндотелиальными клетками и стимуляции CXCR4 путем CXCL12 имеет проангиогенные эффект [36]. Кроме того, CXCR4 является гипоксия индуцируемый ген, регулируется гипоксией фактор индуцированного (1 α HIF1α). Когда кислород не хватает, как и в быстро растущих опухолей, HIF1α усиливает выражение CXCR4 [37]. Повышенная экспрессия CXCR4 в эндотелиальных клетках, наблюдаемых в нашей опухоли коллектива может быть частью комплексной гипоксического реакции растущей опухоли, что позволяет для генерации новых кровеносных сосудов. В нашем исследовании группы, сосудистая экспрессия CXCR4 достоверно коррелирует со степенью роста местной опухоли. В 8% T1 /pT2a опухолей (4 из 52) и в 34% t2b /T3 /pT4 опухолей (81 из 239) CXCR4 положительных микрососудов были обнаружены. T2b /T3 /T4-стадии карциномы желудка, более вероятно питают гипоксического микросреду, чем опухоли /T2a стадии Т1 и, таким образом, может индуцировать экспрессию гена CXCR4 и ангиогенез. Обнаружение CXCR4 положительных микрососудов в крупных метастазов в лимфатических узлах (> 9 мм в диаметре) подтвердили эти наблюдения. Кроме того, ранее мы показали сопоставимые результаты при колоректальном раке [38]. Кроме того, как показано на глиобластомы [39], образцы опухолей, раскрывающие как, CXCL12 положительная опухолевые клетки и CXCR4 положительные микрососудов были высоко в значительной степени связано с высокой локальной степени опухоли и высоких стадиях UICC, что также подтверждает важность функциональной оси CXCL12-CXCR4 в желудка биологии рака
<р> Таким образом, мы покажем, что GPCRs дифференцированно выражены в желудочном раковой ткани и может способствовать биологии опухоли:. опухоли выражающий как, CXCL12 в опухолевых клетках и CXCR4 в опухоли окружающей микрососуды, показывают очень значимая связь с ростом местной опухоли и UICC стадиях. Эти результаты, вместе с нашими предыдущими данными о колоректального рака, обосновать роль оси CXCL12-CXCR4 в опухолевой-неоангиогенезом в желудочно-кишечных опухолей. Путь CXCL12-CXCR4 может быть новым перспективным антиангиогенная мишенью для лечения язвы желудка карцином.
Материалы и методы
<р> Образцы ткани рака желудка хирургическим путем были получены при Шарите University Hospital Berlin (1995-2008). Свежезамороженную ткань 6 случаев рака желудка кишечного типа был использован для анализа GeneChip (узловая отрицательным: 3 пациентов; узловая положительным: 3 больных; женский-мужской соотношение: 1:02). Независимая серия спаренных раковых и опухолевых соседнему нормальных тканей от 37 кишечного типа желудочных карцином были рассмотрены в режиме реального времени RT-PCR (узловая отрицательный: 12 пациентов; узловая положительным: 25 пациентов; женский-мужчина-соотношение: ~1:1 , для детальных характеристик пациента смотри таблицу S3). Для иммуногистохимического анализа, пациент когорте 347 последовательных пациентов с раком желудка исследовали, включающий 194 тип кишечную и 122 диффузных карцином типа в соответствии с классификацией Lauren. 31 образцы показали другие гистологические подтипы (т.е. коллоидный, трубчатые, недифференцированные). Вкратце, когорта состояла из 220 мужчин и 127 женщин. Средний возраст больных на момент постановки диагноза составил 64 года. Данные выживаемости были доступны от 196 из этих пациентов. Последующие данные для других пациентов не хватало, потому что эти пациенты не проживали около больницы и были потеряны для наблюдения. Из 196 пациентов, 124 умерли в течение периода наблюдения. Медиана наблюдения для тех пациентов, все еще живы в конечной точке анализа было 33 месяцев. Из 61 пациентов, ткани совпадающих метастазами лимфатических был доступен (27 типа кишечного тракта, 26 диффузного типа, 8 других гистологических подтипов). Только пациенты с гистологически подтвержденным раком желудка и адекватной ткани доступной были включены. У больных с neoadjuvantly обработанной карциномы желудка или другие известные злокачественные новообразования были исключены из исследования. Этот проект был одобрен местным комитетом по этике (см. Номер EA1 /06/2004).
GeneChip анализ
<р> Общую РНК выделяли фенол-хлороформ с использованием Isolation Kit Mirvana ™ микроРНК ( Амбион, Остин, США). Примесной ДНК была удалена обработкой ДНКазой (Turbo DNAfree комплект; Ambion, Austin, USA) при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Мы использовали GeneChip® генома человека U133 Plus 2.0 массивы (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителей для анализа уровней экспрессии мРНК. Affymetrix GeneChip® Операционная система (GCOS 1.4) автоматизирует управление GeneChip® Флюидика станций и сканера GeneChip® 3000.
<р> Исходные данные были проанализированы с Affymetrix GeneChip Операционная система (1.4 ГСНК) , Обнаружение р-значение транскрипта определяет вызов обнаружения, который указывает, является ли надежно обнаружить транскрипт (р &Лт; 0,05; имеется) или не обнаружена (отсутствует). Чтобы включить сравнение между чипами данные были масштабируется к глобальной интенсивности 500. Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) и GeneSpring пакет программного обеспечения 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) использовали для средних результатов из различных образцов и выполнять статистический анализ для сравнения между раком желудка с (N1) и без метастазов (N0) лимфы. Данные шести массивов были нормализованы для учета изменчивости в гибридизации для пар зондов и других артефактов гибридизации. Нормализация состоит из следующих трех этапов: во-первых, преобразование данных (набор измерений меньше, чем 300,0 до 300,0); во-вторых, за чип (нормализуют каждый чип на 50-й процентили измерений, взятых из этого чипа); и в-третьих, на ген (нормализуют каждый ген медиане измерений для этого гена). Складка изменение было рассчитано для каждого гена, как среднее арифметическое нормированных значений экспрессии N1, разделенное на среднее арифметическое нормированных значений экспрессии N0. Исходные данные из микрочипов экспериментов были загружены в экспрессии генов Омнибус базы данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).
<р> Для синтеза кДНК, 2 мкг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора OmniScript RT (Qiagen). Праймеры геноспецифических разработан BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Берлин, Германия). Последовательности праймеров были следующими: CXCR4 5 'CAG CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 'CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG; бета2-микроглобулина 5 'ACC CCC ACT GAA AAA GAT Г.А., 3' ATC TTC AAA ССТ CCA TGA TG. В режиме реального времени обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (в режиме реального времени RT-PCR) проводили с использованием набора QuantiTect ™ SYBR® Green PCR (Qiagen) и системы LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Сравнительные C <суб> значения т были нормализованы к тому, что гена домашнего хозяйства бета2-микроглобулина. Нет шаблонов управления (без кДНК с помощью ПЦР) не были проведены для каждого гена, чтобы обнаружить неспецифическую или геномную амплификацию и праймера димеризации.
гистологии
<р> Для гистологических анализов, образцы тканей фиксировали в 10% формалине нейтрализованного и заливали в парафин. Депарафинировали срезы окрашивали с помощью гематоксилином и эозином. Желудочный рак был классифицирован в соответствии с классификацией ВОЗ [1]. Этап pTNM был определен в соответствии с руководящими принципами UICC.
Ткань микрочипов строительство
<р> были использованы фиксированные формалином и парафином образцы ткани для создания микрочипов ткани, как описано ранее [40], [41 ]. В кратком изложении, были выбраны от трех до шести морфологически представительные области блоков парафина "донора.
Технология органных чипов улучшает исследование кишечника для персонализированной медицины
Западная диета может увеличить риск «смертельного сепсиса»,
Научный симпозиум в LABVOLUTION посвящен ключевым вопросам наук о жизни
Иммунные клетки кишечника могут быть ответственны за изменения метаболизма, находит исследование
COVID-19:как выглядит болезнь
Вакцинация против ротавируса не связана с риском сахарного диабета 1 типа
Апоптоз - важный медиатор патогенеза коронавирусной инфекции животных.
Апоптоз - это форма запрограммированной гибели клеток, который возникает в клетках, которые непоправимо повреждены, или в клетках, инфицированных некоторыми вирусами. Этот механизм чрезвычайно важен д
Метформин может помочь при повышенной кишечной проницаемости
Команда исследователей из Калифорнийского университета, Сан Диего, успешно использовали органоиды кишечника в своей лаборатории, чтобы продемонстрировать действие лекарств для лечения таких состояний,
Люди против вирусов - сможем ли мы избежать исчезновения в ближайшем будущем?
Эксперт утверждает, что антропогенные изменения окружающей среды могут привести к появлению болезнетворных микроорганизмов, не только извне, но и из нашего собственного микробиома, которые могут проло