PLoS ONE: de ruimtelijke spreiding van Lgr5 + cellen correleert met maagkanker Progression

Abstract

In deze studie hebben we de prevalentie, histoanatomical distributie en tumor biologische betekenis van het Wnt target eiwitten en kanker stamcellen marker Lgr5 in geteste tumoren van het menselijke maagdarmkanaal. Differentiële expressie van Lgr5 werd bestudeerd transcriptionele (Real-time PCR) en translationele niveau (immunohistochemie) in kwaadaardige en overeenkomstige niet-kwaadaardige weefsels van 127 patiënten die zes verschillende primaire tumor site, dwz slokdarm, maag, lever, pancreas, colon en het rectum. De clinico-pathologische betekenis van Lgr5 expressie werd onderzocht bij 100 patiënten met maagcarcinoom (GC). Non-neoplastisch weefsel meestal koesterde slechts zeer weinig verspreid Lgr5 ^{+ cellen. De overeenkomstige carcinomen van de slokdarm, maag, lever, pancreas, colon en rectum vertoonden significant Lgr5 + cellen alsmede significant hogere Lgr5-mRNA in vergelijking met de overeenkomstige niet-neoplastisch weefsel. Dubbele kleuring experimenten bleek een co-expressie van Lgr5 met de vermeende stamcel markers CD44, Musashi-1 en ADAM17. Volgende testten we de hypothese dat de opeenvolgende wijzigingen van maagkanker, d.w.z. chronische atrofische gastritis, intestinale metaplasie en invasieve carcinoom, zijn geassocieerd met een herverdeling van de Lgr5 + cellen. Interessant is dat de ruimtelijke verdeling van Lgr5 veranderd: in niet-neoplastische maagslijmvlies, Lgr5 + cellen werden voornamelijk in het slijmvlies halsgebied gevonden; in intestinale metaplasie Lgr5 + cellen gelokaliseerd in de crypte basis en in GC Lgr5 + cellen aanwezig in het luminale oppervlak, het tumor centrum en het invasiefront waren. De expressie van Lgr5 in de tumor centrum en de invasie voorkant van GC significant gecorreleerd met de lokale groei van de tumor (T-categorie) en de knooppunten spread (N-categorie). Bovendien, patiënten met Lgr5 + GC's hadden een kortere mediane overleving (28,0 ± 8,6 maanden) dan patiënten met Lgr5 - GC (54,5 ± 6,3 maanden). Onze resultaten tonen aan dat Lgr5 differentieel wordt uitgedrukt in gastro-intestinale kankers en dat de ruimtelijke verdeling van histoanatomical Lgr5 + cellen moet worden overwogen wanneer hun tumor biologische betekenis wordt gevraagd}

Visum:. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) de ruimtelijke verdeling van Lgr5 ^{+ cellen correleert met maagkanker Progression. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10.1371 /journal.pone.0035486}

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 5 juli 2011; Aanvaard: 16 maart 2012; Gepubliceerd: 18 april 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze auteurs hebben geen steun of financiering aan te melden

Competing belangen:.. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Gastro-intestinale carcinomen behoren tot de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en zijn een belangrijke oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1], [2]. De redenen voor de slechte prognoses zijn complex: vele vormen van kanker van het maagdarmkanaal zijn gediagnosticeerd in een vergevorderd stadium met uitzondering van curatieve behandeling, zijn er geen betrouwbare tumormarkers die vroege diagnose of screening van hoog-risicogroepen kunnen toestaan. Behandelingsopties beperkt lokaal gevorderde en metastatische ziekte en een groot aantal tumoren terugkeren ondanks aanvankelijke therapeutische respons [3]. Een mogelijke verklaring van een ineffectieve therapie is de aanwezigheid van kanker stamcellen (CSC). De CSC hypothese stelt dat een tumor is een conglomeraat van heterogene celpopulaties. Slechts een subpopulatie van het conglomeraat handhaaft het vermogen van kolonievorming en dus herhaling en metastatische verspreiding. CSC zijn beter bestand tegen chemotherapie, waardoor de tumor recidief, progressie en uiteindelijk de dood van de patiënt [4], [5]. Terwijl de CSC-model steeds meer wordt geaccepteerd, de identificatie en de bevestiging van de zogenaamde stamcellen markers in de moedertaal van menselijk weefsel is moeilijk en grotendeels ontbreekt. Onlangs heeft de leucine-rich, G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en Wnt doelwitgen Lgr5
werd geïdentificeerd als nieuw stamcel marker van de dunne darm, colon en in de haarfollikels van muizen [6] . Expressie van Lgr5 in meerdere andere organen aan dat het een biomarker voor volwassen stamcellen kunnen vormen. Er is echter weinig bekend over de expressie in de lever en maag-darmkanaal van de mens.

In deze studie hebben we geprobeerd om deze leemte van informatie in te vullen en testte de hypothese dat de kanker stamcellen marker Lgr5 heeft prognostische en tumor biologische betekenis.

Materialen en methoden

onderwerpen

formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde maligne en overeenkomstige niet-kwaadaardig weefsel van 127 patiënten, waarvan zes anatomische locaties van de lever en gastro-intestinale darmkanaal (dwz slokdarm, maag, lever, alvleesklier, dikke darm en rectum) werden opgehaald uit het archief van de Institutes of Pathologie van het christelijk-Albrechts-Universität in Kiel en de Charité Universitair Ziekenhuis Berlijn (beide Duitsland). Alle patiënten werden geopereerd aan beide University Hospital Sleeswijk-Holstein (1997-2009) of Charité Universitair Ziekenhuis Berlijn (1995-2008; tabel 1). Gefixeerde bevroren weefsel te verkrijgen waren 105 van deze patiënten met acht verschillende tumorsoorten, namelijk Barrett adenocarcinoom (9 patiënten) en plaveiselcelcarcinoom (7) van de slokdarm, darm (19) en diffuse (21) type maagkanker, adenocarcinoom van het colon (19) en de endeldarm (20), hepatocellulair carcinoom (HCC, 4), en cholangiocarcinoom (CC; 6). De patiënt kenmerken zijn samengevat in tabel 1.

Een onafhankelijke reeks van 487 patiënten met maagkanker werd opgehaald uit het archief van het Instituut voor Pathologie van het christelijk-Albrechts-Universität (tabel 2 en tabel 3). Deze patiënten hadden ofwel een gehele of gedeeltelijke gastrectomie voor adenocarcinoom van de maag of oesophago-maag overgang ondergaan. Elke resectiepreparaat had histologisch onderzoek door getrainde chirurgische pathologen ondergaan. Het tijdstip van overlijden van de patiënt werd verkregen uit de Epidemiologische Cancer Registry
van de staat Sleeswijk-Holstein, Duitsland. Follow-up gegevens van de patiënten nog in leven waren opgehaald uit het ziekenhuis administratie en contact opnemen met de huisarts.

Verklaring Ethiek

Alle weefselmonsters werden verkregen als onderdeel van een diagnostische of therapeutische ingreep uitgevoerd na de patiënt gaven schriftelijk informed consent. Patiënten met monsters voor de studie werden pseudoniemen en anoniem geanalyseerd, zodat geen persoonsgebonden data worden in de databank. De studie werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie van het Academisch Ziekenhuis in Kiel, Duitsland (ref. Nummer D 453/10).

Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction

Totaal RNA was geïsoleerd uit gekweekte cellen en weefsels met behulp cryoconserved Ambion's Mirvana miRNA Isolatie kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Duitsland) gevolgd door een behandeling met DNase Turbo DNA-kit (Ambion). RNA kwaliteit werd beoordeeld in een 1,5% agarosegel. Voor cDNA-synthese 2 pg totale RNA werd reverse getranscribeerd met behulp Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). Genspecifieke primers werden gesynthetiseerd door Biomers.net (Ulm, Duitsland) (Tabel S1). Real-time reverse transcriptase polymerase kettingreactie (real-time RT-PCR) werd uitgevoerd volgens de LightCyler® 480 Probes Master (Roche) en de LightCycler® 480 System (Roche). De vergelijkende Ct-waarden werden genormaliseerd aan die van drie housekeeping genen: Homo sapiens succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoproteïne (FP) (SDHA), Homo sapiens calpaïne 2 (CAPN2) Kopen en cyclofiline C ( CYCC)
. Templateloze controles (geen cDNA in PCR) werden uitgevoerd voor elk gen te onbepaald en genomische amplificatie en primer dimerisatie detecteren. Alle experimenten werden in duplo.

Productie en zuivering van anti-Lgr5 antilichaam

Polyklonale antisera werden gegenereerd tegen de carboxy-eindstandige staart van de humane receptor Lgr5. Konijnen werden geïmmuniseerd met drie verschillende peptiden van de identiteit van SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (genaamd Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (zogenaamde 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (genaamd 12) van Pineda-abservice (Berlijn, Duitsland). Monospecifieke IgG werd gezuiverd door snelle proteïne vloeistofchromatografie met ÄKTAprime ™ -systeem (GE Healthcare, Uppsala, Zweden) met een proteïne A-kolom (GE Healthcare). Voor alle volgende analyses, dat wil zeggen immunofluorescentie, immunocytochemie, western blot en immunohistochemie, de monospecifieke IgG-fractie was affiniteit gezuiverd tegen de immuniseren peptiden door de Pineda-abservice. In dot blot analyses en immunohistochemische onderzoeken, de monospecifieke IgG anti-LGR5-11b antilichaam getoond hoge affiniteit, samen met een sterke en specifieke immunokleuring. Daarom werd dit antilichaam gebruikt in deze studie. De reactiviteit en specificiteit van het monospecifieke antilichaam werd gekenmerkt door Western blot; immunofluorescentie en immunocytochemische assays.

Plasmid construeren

Expression construct voor Lgr5 werd gegenereerd door het versterken van de gehele coderende sequentie van de menselijke Lgr5
(NM_003667.2) door PCR (Tabel S1 ). (-) Om subkloneren van het geamplificeerde fragment in de expressievector pcDNA3.1 vergemakkelijken, de voorwaartse primer bevatte een NheI restrictieplaats adapter en de reverse primer bevatte een BamHI-plaats en een c-Myc tag succesvolle transfectie verifiëren. PCR-fragmenten en de pcDNA3.1 (-) expressievector werden afzonderlijk geknipt met Nhel en BamHI voor ligatie met T4-ligase (Roche). Het plasmide werd gecontroleerd door knippen met NheI en BamHI en DNA-sequentiebepaling met gebruikmaking van ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Version 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Duitsland).

Celkweek en transfectie

de menselijke maagkanker cellijn MKN74 werd verkregen uit de Japanse Health Science Research Resource Bank (Osaka, Japan), en MKN45 de Duitse Verzameling van Micro-organismen en celkweken (Braunschweig, Duitsland). HEK293 EBNA cellen werden gekocht door Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). De cellen werden gekweekt in RPMI 1640 Medium (MKN74, MKN45) of Dulbecco's Modified Eagle Medium (HEK293) aangevuld met 10% (MKN74, HEK293) of 20% (MKN45) foetaal bovien serum, 100 U /ml penicilline en 100 ug /mL streptomycine (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Oostenrijk). DNA transfectie van HEK293 EBNA, MKN74 en MKN45 cellen werd uitgevoerd met Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden cellen gekweekt in platen met zes putjes. Stabiele transfectie van MKN74 en MKN45 met expressieplasmiden werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [7]. Voor transiënte transfectie van HEK293-cellen 1 ug plasmide-DNA en 5 gl Lipofectamine LTX reagens verdund in 500 pl Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium zonder serum, respectievelijk. Na incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur werd het mengsel HEK293 cellen toegevoegd. Achtenveertig uur na transfectie werden getransfecteerde cellen geoogst en RNA of eiwitten werden geïsoleerd. Cellen getransfecteerd met de vector pcDNA3.1 (-) staan ​​getransfecteerde cellen dienden als negatieve controles

Immunofluorescentie

Vierentwintig uur na het enten op CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, België). cellen werden gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing, in 07:03 acetone:methanol gefixeerd (20 minuten, -20 ° C) en vervolgens doorlaatbaar gemaakt met 0,1% Triton-X (5 minuten, kamertemperatuur). Glaasjes werden vervolgens geïncubeerd met c-Myc muis monoklonaal antilichaam (Clontech, Mountain View, CA, USA) gedurende de nacht bij 5 ° C in een vochtige kamer, gevolgd door een anti-muis Alexa Fluor 555 geconjugeerd secundair antilichaam (Invitrogen). De succesvolle transfectie van Lgr5 detecteren werden cellen geïncubeerd met anti-Lgr5 antilichaam gevolgd door een anti-konijn secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (Invitrogen) elk voor één uur bij kamertemperatuur. Weglaten van primaire antilichamen op Lgr5 getransfecteerde HEK293 EBNA cellen dienden als negatieve controle. Montage en tegenkleuring werd uitgevoerd met Vectashield Hard-set met DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Immunocytochemie

immunocytochemische kleuring werd uitgevoerd op met formaline gefixeerd paraffine ingebedde MKN45 maagkanker cellen. Hiertoe werden MKN45 cellen ingebed in agarose kleine korrels zoals eerder beschreven [8]. Verdere verwerking en immunokleuring met anti-Lgr5 antilichaam (verdunning 1:1000) werd volgens de immunohistochemische analyses verricht menselijke weefselsecties (zie hieronder). Weglating van het primaire antilichaam op MKN45 Lgr5 getransfecteerde cellen dienden als negatieve controle, terwijl de specificiteit van anti-Lgr5 antilichaam kleuring werd bevestigd door incubatie van het antilichaam met het immuniserende peptide blokkeren.

Western blotting

Eiwit lysaten werden verkregen door incuberen van menselijk maagweefsel en gekweekt maag cellen met ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Duitsland) en de cocktail van proteaseremmers (complete EDTA-vrij, Roche). Eiwit monsters werden gedenatureerd in Laemmli buffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfaat, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol en 0,01% broomfenol blauw) door verwarming bij 95 ° C gedurende tien minuten en werden vervolgens geladen op 4% tot 16,5% SDS-polyacrylamidegels en zichtbaar gemaakt door kleuring met Coomassie blauw. Na scheiding werden eiwitten op niet-gekleurde polyacrylamidegels overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (Amersham, Freiburg, Duitsland), aan immunoblotting met anti-Lgr5 antilichaam (verdunning 1:20,000) en een anti-β-actine-antilichaam (1:10,000; kloon AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) met gelijke aantal vellen. Membraangebonden HRP gelabelde secundaire antilichamen (DakoCytomation, Glostrup, Denemarken) werden gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie met het ECL systeem (Amersham). Weglating van het primaire antilichaam diende als negatieve controle, terwijl de specificiteit van anti-Lgr5 antilichaam kleuring werd bevestigd door incubatie van het antilichaam met het immuniserende peptide blokkeren.

Histologie

Voor histologische analyses, tissue monsters werden gefixeerd in 10% geneutraliseerd formaline en ingebed in paraffine. Ontdaan van paraffine secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E). Maagcarcinoom werd ingedeeld volgens de WHO-classificatie [9]. De pTNM etappe werd bepaald op basis van de 7 ^{e editie van de International Union Against Cancer [10].}

Tissue micro-array bouw

formaline gefixeerde en weefselmonsters in paraffine ingebedde waren gebruikt om weefsel microarrays genereren zoals eerder beschreven [11]. Vier micrometer gedeelten van de resulterende tumorweefsel microarrays blokken werden gesneden voor verdere analyse. Succesvolle overdracht van tumorweefsel werd microscopisch bevestigd met behulp van H &. E-gekleurde coupes

Immunohistochemie

Voor immunohistochemie, met formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde secties werden gebruikt. Immunokleuring werd uitgevoerd met het anti-Lgr5 antilichaam (verdunning 1:1000), een monoklonaal antilichaam gericht tegen CD44 uitgevoerd (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) en commerciële polyklonale antilichamen gericht tegen Lgr5 (Lgr5 ^{com , 1:400, Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (verdunning 1:50, Sigma-Aldrich) en Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Na 20 minuten blokkeren met waterstofperoxide blok (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minuten behandeling met Ultra V Block (Thermo Scientific) en incubatie met het primaire antilichaam werd uitgevoerd in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Dia's werden gewassen tussen de stappen met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS). Immuunreacties werden gevisualiseerd met de n-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) en DAB-substraat (Linaris, Wertheim-Bettingen, Duitsland). Voor dubbele kleuring van Lgr5 met CD44, ADAM17 en Musashi-1, werden gratis bindingsplaatsen geblokkeerd met muis-IgG en konijn-IgG controle (Abcam) verdund in antilichaam oplosmiddel (ZYTOMED Systems, Berlijn, Duitsland) na de DAB-behandeling. De monsters werden tegengekleurd met hematoxyline. Omissie van het primaire antilichaam dienden als negatieve controles. Non-neoplastische menselijke maag (CD44) en hersenweefsel (Lgr5 com, Lgr5 en Musashi-1) diende als positieve controles.}

Evaluatie van immunokleuring

Immunokleuring van niet-neoplastische epitheel en tumorcellen werd gescoord door toepassing van een scoringssysteem immunoreactiviteit (IRS). Kort categorie A gedocumenteerd de intensiteit van immunokleuring als 0 (geen immunokleuring), 1 (zwak), 2 (matig) en 3 (sterk). Categorie B gedocumenteerde het percentage immunoreactieve cellen als 0 (negatief), 1 (verspreide positieve cellen; ≤1%), 2 (2-10% positieve cellen), 3 (11-50%), 4 (51-80%) en 5 (> 80%). De toevoeging van de categorie A en B geleid tot een IRS tussen 0 en 8 voor elk individueel geval. De distributionele veranderingen van Lgr5 ^{+ cellen in 100 ganse berg delen van de darm soort maagkanker werd als volgt gescoord: het aantal immunoreactieve cellen werd gecategoriseerd als 0 (negatief), 1 (< 10 positieve cellen), 2 (10 -50 positieve cellen) en 3 (> 50 positieve cellen) afzonderlijk voor het luminale oppervlak, tumorcentrum en invasiefront}

Statistische analyses

Statistische analyses werden uitgevoerd met de PASW Statistics 18. statistisch pakket (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vergelijkingen tussen groepen werden getest met behulp van Fisher's exact test. Correlatie van Lgr5 meningsuiting binnen één groep werd opgericht door Kendall's tau rangorde correlatie. Survival curves werden uitgerust met de Kaplan-Meier-methode en de verschillen in overleving beoordeeld door de log rank test. De betekenis van de correlatie van Lgr5 expressie in primaire tumoren en overeenkomstige niet-kwaadaardig weefsel werd bepaald door de Wilcoxon proef. Real-time RT-PCR-gegevens die werden beoordeeld met een gekoppelde tweezijdige t-test, raakte logarithmized tot ongeveer normaal verdeelde gegevens te verkrijgen. P-waarden. ≪ 0,05 werden beschouwd als statistisch significant

Resultaten

Lgr5-mRNA wordt differentieel tot expressie in lever en gastro-intestinale carcinomen

Lgr5 werd naar verluidt uitgedrukt in muizen stamcellen van de intestinale crypten [12] en is vaak overexpressie in colonkanker cellijnen [13]. Om de expressie in niet-neoplastische en neoplastische menselijke weefsels te onderzoeken, evalueerden we de transcriptionele expressie van Lgr5 in humane klinische monsters waarin een breed scala van hepato-gastrointestinale carcinomen. slokdarm [Barrett adenocarcinomen (9 patiënten) en plaveiselcelcarcinomen (: real-time RT-PCR-analyse werd uitgevoerd op een reeks van 105 patiënten die kwaadaardige en overeenkomstige niet-kwaadaardig weefsel, verkregen uit dezelfde patiënten van acht verschillende tumortypen uitgevoerd 7)], maag [darm (19) en diffuse type (21) maagcarcinomen], lever [HCC's (4), CC (6)], colon (19) en de endeldarm (20; Tabel 1)
<. p> Lgr5-mRNA significant verschillend tot expressie in adenocarcinomen van de slokdarm (p = 0,007), maag [intestinale type (p = 0,006) en diffuse type (p = 0,013)], lever [CCs (p = 0,022)], colon (p < 0,001) en rectum (p = 0,002) in vergelijking met het overeenkomende niet-neoplastisch weefsel. Er werd echter geen differentiële expressie in squameuze carcinomen van de slokdarm (p = 0,503) en HCC's vergeleken met de overeenkomstige niet-neoplastische weefsels (p = 0,545; Figuur 1).

Een polyklonaal anti-LGR5- antilichaam detecteert menselijke Lgr5 getransfecteerd in HEK293 en MKN45 cellen

om de histoanatomical verdeling van Lgr5 verder te verkennen in menselijke weefsels en zijn clinico-pathologische betekenis te onderzoeken, een Lgr5-specifiek antilichaam werd verhoogd, omdat de in de handel verkrijgbare antilichamen deed niet aan onze eisen (Figuur 2A). Om kruisreactiviteit van de nieuw gegenereerde antilichamen met de structureel vergelijkbare LGRs, LGR4 en LGR6 sluiten, voerden we een sequentie uitlijning met National Center for Biotechnology Information
aligneringswerktuig vooraf (gegevens niet getoond). Geen sequentie homologie werd gevonden met LGR4 of LGR6 in het gebied van de Lgr5 peptide we voor immunisatie. Voor de keuze van een zeer specifieke antilichaam tegen Lgr5 werd gekloneerd volledige lengte cDNA getransfecteerd in HEK293 EBNA-cellen en gebruikt als positieve doelgroep uitvoeren immunofluorescentie. De Lgr5 cDNA werd direct gelabeld met een myc-epitoop, die de evaluatie van de transfectie ingeschakeld met een anti-myc antilichaam. Middels immunofluorescentie, binding van het anti-myc antilichaam werd gevonden na incubatie met Lgr5 /HEK293-cellen, maar niet in lege-vector getransfecteerde cellen (vector /HEK293) getransfecteerde HEK293 cellen of in de negatieve controle Lgr5 /HEK293 cellen geïncubeerd met antilichaam verdunningsmiddel in plaats van het primaire antilichaam. Hetzelfde resultaat werd verkregen toen we het anti-Lgr5-antilichaam (figuur 3) gebruikt, tonen specifieke kenmerken van Lgr5.

De specificiteit van Lgr5-immunolabel werd verder gevalideerd met formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde MKN45 maag kankercellen. De cellen werden bereid en gekleurd op een wijze die de verwerking van klinische humane weefselmonsters parallel. Immunocytochemische analyse op paraffinecoupes onthulde een positieve kleuring van anti-Lgr5-antilichaam op MKN45 cellen stabiel getransfecteerd met cDNA Lgr5 (Lgr5 /MKN45). In plaats daarvan, lege-vector getransfecteerde MKN45 cellen (vector /MKN45), en de negatieve controle (weglaten van het primaire antilichaam) en het peptide controle (pre-incubatie van het antilichaam met een immuniserend blokkerende peptide) van Lgr5 /MKN45 cellen vertoonden geen binding van het antilichaam (Figuur S1).

Lgr5 eiwitten specifiek herkend door anti-Lgr5-antilichamen in humane getransfecteerde cellen MKN74

de menselijke maagkanker cellijnen MKN74, bekend bezitten een matige Lgr5-mRNA-expressie (gegevens niet getoond) en humane niet-neoplastische maag, vertoont zeer lage Lgr5 expressie (Figuur 1) werden gekozen om de reactiviteit en specificiteit van de anti-Lgr5 antilichaam karakteriseren op eiwitniveau.

In de westerse blotanalyse werd Lgr5-eiwit specifiek herkend door het monospecifieke anti-Lgr5-antilichaam bij een verdunning van 1:20,000. Identificeerde een band met een schijnbaar molecuulgewicht van 100 kDa in cellysaten MKN74 (figuur 4), die overeenkomt met de moleculaire massa berekend voor Lgr5 eiwit. Daarentegen werd geen band gedetecteerd in lysaten van humane niet-neoplastisch weefsel maag, die een kruisreactiviteit van anti-Lgr5 antilichaam met cellulaire eiwitten uitsluit. Overeenkomstig mRNA expressie data, sterkere expressie van Lgr5 eiwit werd waargenomen in MKN74 cellen stabiel getransfecteerd met cDNA Lgr5 tegenover MKN74 controlecellen die getransfecteerd waren met de lege vector. Lgr5 eiwitexpressie in humane niet-neoplastisch maagslijmvlies was dan de detectiegrens van western blotting en vertoont geen band. Weglating van de anti-Lgr5-antilichaam of voorafgaande incubatie van het antilichaam met een immuniserend peptide blokkering geeft geen eiwitbanden respectievelijk. Detectie van β-actine-eiwit (ongeveer 43 kDa; figuur 4) diende als een laad controle en bevestigde gelijkmatig geladen eiwit bedragen in alle rijstroken

Lgr5 wordt uitgedrukt in non-neoplastische en neoplastisch weefsel van de lever en gastro-intestinale. tract

de expressie en distributie van histoanatomical Lgr5 werd vervolgens onderzocht door immunohistochemie in een reeks van 127 weefselobjectglaasjes verkregen uit overeenkomstige niet-neoplastische en neoplastisch weefsel van de lever en maagdarmkanaal, omvattende de slokdarm (14 patiënten), maag (32), lever (24), pancreas (17), colon (20), en de endeldarm (20; Tabel 1). Uit deze cohort neoplastische en overeenkomstige niet-neoplastisch weefsel monsters van 105 patiënten werden onderzocht op het transcriptieniveau (zie hierboven).

Lgr5 expressie van het totale cohort positief was in 65 gevallen (51%) van niet-kwaadaardige weefsels en 103 gevallen (81%) van kankerweefsels. Lokalisatie van Lgr5 expressie werd waargenomen als voornamelijk cytoplasmatische, terwijl ook een sporadische membraan of kern membraan geaccentueerde expressie opgetreden. Een Lgr5-immunoreactiviteit werd in alle weefsels componenten, d.w.z. stromacellen, endotheelcellen, cellen in de niet-neoplastische epitheel en in kankercellen (figuur 5). Lgr5-immunoreactiviteit in stroma cellen werd waargenomen in 49 (39%) van alle niet-kwaadaardige weefsels en in 80 gevallen (63%) van kankerweefsels. Een endotheel immunoreactiviteit van Lgr5 werd waargenomen bij 42 gevallen (33%) van alle weefsels.

In de niet-kwaadaardige epitheel, Lgr5 werd gewoonlijk in enkele verspreide cellen vlakbij de basale membraan van het maagslijmvlies eenheid, alvleesklier leidingen, en de colorectale crypten. Lgr5 werd niet gevonden in het plaveiselepitheel van de slokdarm, intrahepatische galkanalen en hepatocyten (figuur 6). Voor alle weefsels behalve oesophageale weefsel van de gemiddelde waarde van IRS was significant hoger voor tumorweefsel ten opzichte van de overeenkomende niet-kwaadaardig weefsel bevestigt onze bevindingen op het transcriptionele niveau (tabel 1).

Lgr5 aanwezig in verspreide cellen van normale maagslijmvlies

het bestaan ​​van multipotente stamcellen in de maag muizen werd aangetoond door klonale markering studies. De definitieve identificatie van deze cellen niet tot dusver wegens het ontbreken van specifieke endogene markers [14]. Gebruik seriecoupes verkregen uit een huls resectiepreparaat, dat gewoonlijk wordt verkregen voor de behandeling van overgewicht en vertoonde geen histologische tekenen van maagkanker of chronische gastritis, zochten wij Lgr5 ^{+ epitheelcellen. Interessant verspreid Lgr5 + cellen gevonden in het slijmvlies halsgebied tussen de foveolae en klieren (Figuur 7).}

Lgr5 wordt tezamen tot expressie gebracht met andere potentiële maag stamcellen of progenitor celmarkers

stamcellen van niet-neoplastisch weefsel en CSC worden gewoonlijk geïdentificeerd en gevalideerd door de expressie van meer dan een stamcel marker [15]. Met behulp van immunohistochemie, we naast een analyse van de co-expressie van Lgr5 met andere vermeende CSC markers, dat wil zeggen ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 geselecteerd voorgaande studies geïdentificeerd ADAM17 als vermeende stamcel marker van de maag [8]. Immunokleuring (hetzij dubbele kleuring of kleuring van seriecoupes) werd uitgevoerd op een maagkanker specimen en over gezonde uninflammed maagslijmvlies verkregen door sleeve gastrectomie verricht. In het algemeen toonde slechts enkele verspreide cellen positieve immunokleuring voor een en /of andere putatieve stamcellen marker. Interessant is dat de niet-neoplastische maagslijmvlies herbergt cellen die elk ADAM17 ^{zijn + /Lgr5 + (goed voor ongeveer een derde van alle immunoreactieve cellen) en ADAM17 + /Lgr5 - (tweederde) en ADAM17 - /Lgr5 + (enkele verspreide cellen Figuur 2C-E)}

Musashi-1 (Msh-1) werd beschreven als een mogelijke stamcel marker in de muis darm. en menselijke maag [18], [22] en als CSC marker in tumoren [23]. In neoplastische en niet-neoplastische maagweefsel positief gekleurde cellen hoofdzakelijk uit Msh-1 ^{+ /Lgr5 - (ongeveer tweederde van immunoreactieve cellen), in mindere mate van Msh-1 + /Lgr5 + (een derde), en weinig Msh-1 - /Lgr5 + cellen (figuur 2F-H). Uiteindelijk het oppervlak marker van colorectale en maagkanker stamcellen CD44 [21], [24] toonde een vergelijkbare verdeling met Msh-1 (Figuur 2I, J). Tezamen zijn deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat onze anti-Lgr5-antilichaam detecteert cellen met stamcellen expressie patronen in het menselijk maagslijmvlies.}

De ruimtelijke verdeling van Lgr5 + cellen veranderingen tijdens tumorgenese

de sequentiële veranderingen in het maagslijmvlies dat de ontwikkeling van invasieve kanker voorafgaan staan ​​bekend als de 'precancereuze cascade', eerst beschreven in 1975, met normale maagslijmvlies wordt getransformeerd door chronische atrofische gastritis en ontwikkelt multifocale atrofie en intestinale metaplasie, gevolgd door het voorkomen van dysplasie en tenslotte invasief carcinoom [25]. Volgende testten we de hypothese dat de voornoemde histopathologische veranderingen van het maagslijmvlies zijn geassocieerd met een herverdeling van de Lgr5 ^{+ putatieve stamcellen. We onderzochten systematisch de histoanatomical verdeling van Lgr5 + cellen bij 100 patiënten met intestinale soort maagkanker. Whole mount weefsel secties werden gebruikt die niet-neoplastische, metaplastische en neoplastisch kankerweefsel ingesloten. Het is snel duidelijk dat de histoanatomical verdeling van Lgr5 + cellen gewijzigd (zie Figuur 7) in niet-neoplastische en niet-metaplasie maagslijmvlies, paar losse Lgr5 + cellen gevonden in het slijmvlies halsgebied (fig 7A, E). In de intestinale metaplasie, een licht verhoogd aantal Lgr5 + cellen werden gelokaliseerd op de bodem van de crypten metaplastisch (figuur 7B, F). Echter, in de darm soort maagkanker de lokalisatie en het aantal Lgr5 + cellen werd opvallend veranderd. Bij maagkanker, waren Lgr5 + cellen aanwezig op het luminale oppervlak (figuur 7C, G), in het tumorcentrum (tussen luminale oppervlak en invasiefront) en de invasiefront (Figuur 7D). Het meest interessant is de verdeling van Lgr5 + maagkanker cellen vertoonden kenmerkende patronen: de Lgr5 + cellen zich in samenhangende stukken een variabel aantal tumorcellen zich van < 10, 10-50 en zelfs > 50 tumorcellen, vaak vormen gradiënten afnemende intensiteit kleuring. De totale verdeling van deze Lgr5 + tumorcel flarden was ongelijk en niet homogeen. Gezamenlijk namen wij een toename van het aantal en de intensiteit van Lgr5 + cellen uit niet-neoplastische epitheel maagkanker ondersteunen onze real-time RT-PCR en immunohistochemie gegevens van aangepast (niet-neoplastische versus neoplastische) patiëntcasussen (zie Tafel 1). Onze bevindingen van de gewijzigde verspreidingspatroon van Lgr5 + cellen is in overeenstemming met die beschreven door Takeda et al. voor colorectale kanker [26].}

De expressie van Lgr5 intestinale Type maagkanker correleert met lokale tumorgroei en verspreiding knooppunten

Er wordt gepostuleerd dat CSC invloed prognose voor de patiënt door hun vermogen om tumoren te vormen cel kolonies, een onmisbare voorwaarde voor metastase en terugkeer van de ziekte. Om de betekenis van Lgr5 voor maagkanker verder te verkennen, gecorreleerd we de uitdrukking van Lgr5 in intestinale soort maagkanker met diverse clinico-pathologische kenmerken van de patiënt.

• PLoS ONE: verminderde niveaus van Active SMAD2 correleren met een slechte prognose bij maagkanker
• PLoS ONE: glyoxalase-I is een nieuwe Prognose Factor geassocieerd met maagkanker Progression