Ploche ONE: priestorovom rozložení LGR5 + buniek koreluje s rakovinou žalúdka Progression

abstraktné

V tejto štúdii sme testovali prevalenciu, histoanatomical distribúciu a nádoru biologický význam cieľového proteínu a bunkového markeru nádorových kmeňových LGR5 Wnt v tumory ľudského gastrointestinálneho traktu. Diferenciálnej expresie LGR5 bola študovaná na transkripcii (real-time PCR) a hladiny translačný (imunohistochémia) v malígnych a zodpovedajúce nenádorových tkanív 127 pacientov, ktorý zahŕňa šesť rôznych primárny nádor miesta, tj pažeráka, žalúdka, pečene, pankreasu, hrubého čreva a konečníka. Klinicko-patologický význam LGR5 expresie sa sledovala u 100 pacientov s karcinómom žalúdka (GC). Nenádorových tkanivo zvyčajne kryl len veľmi málo rozptýlené LGR5 ^{+ buniek. Zodpovedajúce karcinómy pažeráka, žalúdka, pečene, pankreasu, hrubého čreva a konečníka ukázal podstatne viac LGR5 + bunky, rovnako ako výrazne vyššie hladiny LGR5-mRNA v porovnaní so zodpovedajúcim non-neoplastické tkaniva. Dvojité farbenie experimenty odhalili koexpresi LGR5 s domnelými kmeňových buniek markerov CD44, Musashi-1 a ADAM17. Ďalej sme testovali hypotézu, že sekvenčné zmeny žalúdočnej karcinogenézy, tj chronickou atrofickou gastritídu, črevné metaplázia a invazívneho karcinómu, sú spojené s prerozdelenie LGR5 + buniek. Je zaujímavé, že priestorové rozloženie LGR5 zmenené: v non-neoplastických žalúdočnej sliznice, LGR5 + bunky boli nájdené predovšetkým v mukóznej oblasti krku; V črevnej metaplázia LGR5 + bunky boli lokalizované na krypty základni av GC LGR5 + bunky boli prítomné na luminální povrch, nádorové centrá a invázne fronte. Expresie LGR5 v nádore stredu a invázie pred GC významne koreluje s lokálnym rastu nádoru (T-kategórii) a uzlový rozprestretím (N-skupiny). Okrem toho, pacienti s LGR5 + GC mal kratší medián prežitia (28,0 ± 8,6 mesiacov) ako pacienti s LGR5 - GC (54,5 ± 6,3 mesiacov). Naše výsledky ukazujú, že je LGR5 rozdielne exprimované v gastrointestinálnych nádorov, a že priestorová distribúcia histoanatomical LGR5 + buniek, treba považovať, keď je ich biologický význam tumor požadovaný}

Citácia :. Simon E, Petko D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) priestorového rozloženia LGR5 ^{+ buniek koreluje s rakovinou žalúdka Progression. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486}

Strih: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Spojené štáty americké |

prijatá: 05.07.2011; Prijaté: 16. marca 2012; Uverejnené: 18.apríla 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Títo autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov: .. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

gastrointestinálne karcinómy sú jedny z najčastejších zhubných nádorov a sú najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu na celom svete [1], [2]. Dôvody pre chudobných prognózy sú zložité: väčšina karcinómov gastrointestinálneho traktu sú určil ako v pokročilých štádiách s výnimkou kuratívnu liečbu, nie sú k dispozícii žiadne spoľahlivé nádorové markery, ktoré môžu umožniť včasnú diagnózu alebo skríning vysokorizikových populáciách. liečebné možnosti sú obmedzené lokálne pokročilého a metastatického ochorenia, a značný počet nádorov vracajú napriek počiatočnej terapeutickej odpovede [3]. Predpokladaný vysvetlenie neefektívne terapia je prítomnosť nádorových kmeňových buniek (CSC). CSC hypotéza predpokladá, že nádor je konglomerát populácií heterogénnych buniek. Iba subpopulácie tohto konglomerátu zachováva schopnosť tvorby kolónií, a teda aj opakovanie a šírenie metastáz. CSCS sú odolnejšie voči chemoterapii, čo vedie k recidíve ochorenia, progresie ochorenia a úmrtia pacienta v konečnom dôsledku [4], [5]. Kým CSC-model je stále prijatý, identifikáciu a potvrdenie tzv kmeňových buniek markerov v natívnej ľudskej tkanive, je ťažké a do značnej miery chýba. V poslednej dobe, leucín bohaté na G-proteínom spojený receptor (GPCR) a Wnt cieľový gén LGR5
bol identifikovaný ako nový kmeňových buniek marker tenkého čreva, hrubého čreva a vo vlasových folikulov myší [6] , Expresie LGR5 v mnohých iných orgánoch naznačuje, že to môže predstavovať globálne marker dospelých kmeňových buniek. Avšak, len málo je známe o jeho expresie v pečene a tráviaceho traktu človeka.

V tejto štúdii sme sa zamerali vyplniť túto medzeru informácií a testovali hypotézu, že nádorové kmeňová bunka značka LGR5 má prognostický a nádor biologický význam.

materiály a metódy

Predmety

formalínu fixované a parafínu zaliate malígne a zodpovedajúce non-malígne tkanivo z 127 pacientov, ktorý obsahuje šesť anatomické lokality z pečene a gastrointestinálne traktu (tj pažeráka, žalúdka, pečene, pankreasu, hrubého čreva a konečníka) boli získané z archívu ústavov patológie Christian-Albrechts-Universität Kiel a fakultnej nemocnice Charité v Berlíne (obaja Nemecko). Všetci pacienti boli operovaní na oboch FN Šlezvicku-Holštajnsku (1997-2009) alebo Fakultnej nemocnice Charité v Berlíne (1995-2008; tabuľka 1). Nefixovaný, čerstvé mrazené tkanivo bolo k dispozícii 105 z týchto pacientov s ôsmimi rôznych typov nádorov, tj Barrettov adenokarcinómu (9 pacientov) a spinocelulárneho karcinómu (7), pažeráka, čriev (19) a difúzne (21) typ rakoviny žalúdka, adenokarcinómu hrubého čreva (19) a konečníka (20), hepatocelulárneho karcinómu (HCC, 4), a cholangiokarcinom (CC; 6). Tieto charakteristiky pacientov sú zhrnuté v tabuľke 1.

Nezávislá série 487 pacientov s karcinómom žalúdka boli získané z archívu Ústavu patológie Christian-Albrechts-University (tabuľka 2 a tabuľka 3). Títo pacienti podstúpili úplnú alebo čiastočnú gastrektómii pre adenokarcinóm žalúdka alebo žalúdočné oesophago-križovatky. Každý resekcia vzorka podstúpil histologické vyšetrenie vyškoleným chirurgických patológov. Doba úmrtia pacienta bola získaná zo Epidemiologické onkologického registra
štátu Schleswig-Holstein, Nemecko. Následná dáta pacientov stále nažive boli získané z nemocničných záznamov a kontaktovaním praktickí lekári.

Prehlásenie o Ethics

Všetky vzorky tkaniva boli získané ako súčasť diagnostického alebo terapeutického zákroku vykonávané po pacient dal písomný informovaný súhlas. Pacienti, ktoré ponúkajú vzorky pre štúdie boli pseudonymných a analyzované anonymne, takže žiadne osobitné súvisiace údaje sú obsiahnuté v databáze. Štúdia bola schválená miestnej etickou komisiou Fakultnej nemocnice v Kieli, Nemecko (ref. Číslo D 453/10).

Real-time reverznej transkriptázy PCR

Celková RNA bola izolované z kultivovaných buniek a tkanív kryokonzervovaného s využitím Ambion je Mirvana miRNA Isolation kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Nemecko) nasledovaný DNázy ošetrenie Turbo DNA-free sadou (Ambion). Kvalita RNA bola hodnotená v 1,5% agarózovom géli. Pre syntézu cDNA, 2 ug celkovej RNA bola reverzne transkribovaných s použitím Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko). Génovo špecifické primery boli syntetizované Biomers.net (Ulm, Nemecko) (tabuľka S1). Real-time reverznej transkriptázy PCR (real-time RT-PCR) bola vykonaná za použitia 480 LightCyler® Sondy Master (Roche) a LightCycler® 480 System (Roche). Porovnávacie hodnoty Ct boli normalizované na ktoré z troch génov domácnosti: Homo sapiens sukcinátdehydrogenáza komplexu, podjednotky A, flavoproteínov (Fil) (SDHA), Homo sapiens kalpain 2 (CAPN2) stroje a Cyclophilin C ( CYCC)
. Žiadne ovládacie prvky šablóny (nie cDNA v PCR) sa vykonávali pre každý gén pre detekciu nešpecifickej alebo genomické zosilnenie a primeru dimerizáciu. Všetky experimenty boli vykonané duplicitne.

Výroba a čistenie an anti-LGR5-protilátok

Polyklonálne antiséra boli vytvorené proti karboxyterminální chvost ľudskému receptoru LGR5. Králiky boli imunizované s tromi rôznymi peptidy totožnosti SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (nazvaný Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (tzv 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (tzv 12) Pineda-abservice (Berlín, Nemecko). Monospecifické IgG sa čistí rýchla proteínová kvapalinová chromatografia so systémom ÄKTAprime ™ (GE Healthcare, Uppsala, Švédsko) za použitia proteín A kolóny (GE Healthcare). Pri všetkých následných analýz, tj imunofluorescenčný, imunocytochémia, westernovým prenosom aj imunohistochemicky, monospecifické IgG frakcia bola afinitnej čistená proti imunizáciu peptidy zo strany Pineda-abservice. V dot blot analýzy a imunohistochemické vyšetrenie, monospecifické IgG anti-LGR5-11b protilátka zobrazená vysokou afinitou spolu s výrazným a špecifickým immunostaining. Preto je táto protilátka bola použitá v tejto štúdii. Reaktivita a špecificita monospecifické protilátky bol charakterizovaný Western Blot; imunofluorescencie a imunocytochemické testy.

Plasmid konštruovať

Expresný konštrukt pre LGR5 bol vytvorený amplifikáciou celú kódujúci sekvenciu ľudského LGR5
(NM_003667.2) pomocou PCR (tabuľka S1 ). Pre uľahčenie subklonování amplifikovaného fragmentu do expresného vektora pcDNA3.1 (-), dopredný primer obsahoval Nhel adaptér reštrikčné miesto a reverznej primer obsahoval miesto BamHI a značku c-myc pre overenie úspešné transfekciu. PCR fragmenty a pcDNA3.1 (-) expresné vektor boli štiepené oddelene s Nhel a BamHI pred ligácia s T4-ligázu (Roche). Plazmid bol overený štiepením Nhel a BamHI a DNA sekvencovanie za použitia ABI PRISM BigDye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, verzia 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Nemecko).

Bunková kultúra a transfekcia

rakovina žalúdka ľudská bunková línia bola získaná z MKN74 japonskej Health Science Research prostriedkov banky (Osaka, Japonsko), a MKN45 z nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (Braunschweig, Nemecko). HEK293 EBNA boli zakúpené od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Bunky boli pestované v médiu RPMI 1640 (MKN74, MKN45) alebo Dulbeccova modifikácia Eaglovho média (HEK293), doplnenom 10% (MKN74, HEK293) alebo 20% (MKN45) fetálne hovädzie sérum, 100 U /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycín (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Rakúsko). DNA transfekcia HEK293 EBNA, MKN74 a MKN45 buniek bolo vykonané za použitia Lipofectamine LTX činidla (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. V stručnosti, bunky boli kultivované v šiestich jamkami. Stabilná transfekcia MKN74 a MKN45 expresnými plazmidy bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [7]. Pre prechodné transfekciu buniek HEK293 1 ug plazmidmi DNA a 5 ul Lipofectamine LTX činidlo sa zriedi v 500 ul Dulbecco modifikovanom Eagle médiu bez séra, v danom poradí. Po inkubácii počas 30 minút pri teplote miestnosti bola zmes pridaná do buniek HEK293. Štyridsať osem hodín po transfekciu boli transfekované bunky zozbierané a RNA alebo proteíny boli izolované. Bunky transfekované vektorom pcDNA3.1 (-) samotných a netransfektované bunky slúžili ako negatívne kontroly

Imunofluorescenčný

Dvadsaťštyri hodín po naočkovaní na CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgicko) ,. bunky sa promyly fyziologickým roztokom pufrovaným fosforečnanom, pevné v 7: 3 acetone: metanol (20 minút, 20 ° C) a následne permeabilizovány 0,1% Triton-X (5 minút, teplota miestnosti). Sklíčka bola potom inkubovali s c-Myc myší monoklonálne protilátky (Clontech, Mountain View, CA, USA) cez noc pri teplote 5 ° C vo vlhkej komore, nasleduje anti-myšou Alexa Fluór 555 konjugované sekundárnej protilátky (Invitrogen). Pre detekciu úspešnú transfekciu LGR5, boli bunky inkubované s anti-LGR5-protilátka s následnou anti-králičie sekundárnou protilátkou konjugovanou s Alexa Fluór 488 (Invitrogen), každý po dobu jednej hodiny pri teplote miestnosti. Vynechanie primárnych protilátok na LGR5 transfekovány HEK293 EBNA slúžili ako negatívna kontrola. Montáž a kontrastným bolo vykonané Vectashield Hard-Set vrátane DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

imunocytochemie

Imunocytochemické farbenie bola vykonaná na formalínom fixované, paraffin- vložený MKN45 buniek karcinómu žalúdka. Pre tento účel boli bunky MKN45 zakotvené v malých agarosových guličiek, ako bolo opísané skôr [8]. Ďalšie spracovanie a imunologické značenie s anti-LGR5-protilátky (riedenie 1: 1000) bola vykonaná v súlade s imunohistochemické analýzy úsekov ľudských tkanív (pozri nižšie). Vynechanie primárnej protilátky na LGR5 transfekované bunky MKN45 slúžila ako negatívna kontrola, pričom špecificita anti-LGR5-protilátky bola potvrdená farbením inkubáciou protilátky s imunizačný peptid blokovanie.

Western blotting

Proteínové lyzáty boli získané inkubáciou ľudskej žalúdočnej tkanív a kultivovaných buniek žalúdočných s ProteoJET ™ cicavčích bunkových Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Nemecko) a inhibítora proteázy koktail (Complete bez EDTA, Roche). Vzorky proteínu boli denaturované v Laemmli pufra (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% dodecylsulfát sodný, 10% glycerol, 5% β-mercaptoetanolu a 0,01% Brómfenolová modrá) zahrievaním pri teplote 95 ° C počas desiatich minút a následne loaded o 4% na 16,5% SDS polyakrylamidovom géle a vizualizované farbením Coomassie blue. Po oddelení proteínov na sklenenej polyakrylamidovom gélu boli prenesené na nitrocelulózové membránu (Amersham, Freiburg, Nemecko), imunoblotu s anti-LGR5-protilátky (riedenie 1: 20,000) a anti-P-aktínu protilátky (1: 10,000; klonovať AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) s cieľom zabezpečiť rovnaké ložnej sumy. Membránovo viazaná HRP značené sekundárne protilátky (DakoCytomation, Glostrup, Denmark), boli detekované zvýšené chemiluminiscencie za použitia systému ECL (Amersham). Vynechanie primárnej protilátky slúžili ako negatívna kontrola, pričom špecificita anti-LGR5-protilátky bola potvrdená farbením inkubáciou protilátky s imunizačný peptid blokovanie.

Histológia

analýzy histologické, tkanivo vzorky boli fixované v 10% formalínu a neutralizované vložené do parafínu. Deparafinizovány rezy boli zafarbené pomocou hematoxylínu a eosínu (H &E). Karcinóm žalúdka bol klasifikovaný podľa klasifikácie Svetovej zdravotníckej organizácie [9]. Javisko pTNM bola stanovená v závislosti na 7. ^{ročník Medzinárodnej únie proti rakovine [10].}

Tissue micro array konštrukcie

formalínu fixované a vzorky parafínu zaliate tkaniva boli slúži na generovanie tkaniva mikro polia, ako bolo opísané skôr [11]. Štyri mikrometre časti výsledného nádorového tkaniva mikroarray bloku boli narezané na ďalšiu analýzu. Úspešný prenos nádorového tkaniva bola potvrdená mikroskopicky za použitia H &. E-zafarbené časti

Imunohistochémia

imunohistochémia boli použité formalínom fixovaných a parafínových sekcií. Imunologické bola vykonávaná s anti-LGR5-protilátky (riedenie 1: 1000), čo je monoklonálna protilátka proti CD44 (1: 200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, Veľká Británia) a komerčné polyklonálne protilátky namierené proti LGR5 (LGR5 ^{com , 1: 400; abca, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (riedenie 1:50, Sigma-Aldrich) a Musashi-1 (1: 500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Po 20 minút blokovanie s peroxidom vodíka bloku (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minút ošetrenie Ultra V bloku (Thermo Scientific) a inkubácie s primárnou protilátkou bola vykonaná vo vlhkej komore pri teplote miestnosti po dobu 30 minút. Sklíčka premytá medzi krokmi s Tris-vyrovnanom fyziologickom roztoku (TBS). Immunoreactions boli vizualizované s n-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japonsko) a DAB substrát (Linaris, Wertheim-Bettingen, Nemecko). Pri postupe s dvojitým farbením LGR5 s CD44, a ADAM17 Musashi-1, voľná väzbové miesta boli blokované s myšou-IgG a kontrolné králičie-IgG (abca) zriedený v riedidle protilátok (ZYTOMED Systems, Berlín, Nemecko) po DAB zaobchádzanie. Vzorky boli kontrastne hematoxylínom. Vynechanie primárnej protilátky slúžili ako negatívne kontroly. Nenádorových ľudský žalúdok (CD44) a mozgového tkaniva (LGR5 com, LGR5 a Musashi-1) slúžil ako pozitívne kontroly.}

Vyhodnotenie immunostaining

imunologické non-neoplastických epitelu a nádorové bunky sa hodnotila uplatnením imunoreaktivita bodovacieho systému (IZS). Stručne povedané, kategória A dokumentované intenzity imunobarvení ako 0 (bez imunologické), 1 (slabý), 2 (stredná), a 3 (silný). Kategória B dokumentované percento imunoreaktívnych buniek ako 0 (negatívne), 1 (rozptýlených pozitívnych buniek; ≤1%), 2 (2-10% pozitívnych buniek), 3 (11-50%), 4 (51 až 80%) a 5 (viac ako 80%). Pridanie kategórie A a B vyústila v IRS v rozmedzí od 0 do 8 pre každý jednotlivý prípad. Distribučné zmeny LGR5 ^{+ buniek v 100 celých prípojných častiach intestinálneho typu karcinómu žalúdka bola hodnotená nasledovne: počet imunoreaktívnych buniek bol zaradený do kategórie 0 (negatívne), 1 (menej ako 10 pozitívnych buniek), 2 (10 -50 pozitívne bunky) a 3 (> 50 pozitívnych buniek) zvlášť pre Luminale povrchu, nádorové centrá a invazívne fronte}

štatistickej analýzy

štatistické analýzy boli vykonané pomocou IBM SPSS Statistics 18. štatistická balíček (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Porovnanie medzi skupinami boli testované s použitím Fisherovho exaktného testu. Korelácia LGR5 prejavu v rámci jednej skupiny bola založená tau poradí úspešnosti korelácia Kendalla. Krivky prežitia boli vybavené metódy Kaplan-Meier a rozdiely v prežitie posudzovaných log rank testu. Význam korelácií LGR5 expresiu v primárnych nádorov a zodpovedajúcim non-malígne tkanive bola hodnotená Wilcoxonova testu. Real-time RT-PCR údaje, ktoré boli hodnotené pomocou párového obojstranným t-testom, dostal logarithmized získať približne normálne distribuovaných dát. P-hodnoty. ≪ 0,05 boli považované za štatisticky významné

Výsledky

LGR5-mRNA je rôzne vyjadrené v pečene gastrointestinálne karcinómy

LGR5 bol údajne vyjadrených v myších kmeňových buniek črevnej krypty [12] a bol často nadmerne exprimovaný u bunkových línií karcinómu hrubého čreva [13]. Vyšetriť jeho expresiu v non-neoplastické a neoplastické ľudskom tkanive, sme hodnotili transkripčný expresiu LGR5 v ľudských klinických vzoriek s širokej škály pečene a gastrointestinálne karcinómov. Real-time RT-PCR analýza bola vykonaná na sériu 105 pacientov obsahujúcich malígny a zodpovedajúce non-malígne tkaniva, získané od rovnakých pacientov, z ôsmich rôznych typov nádorov: pažerák [Barrettov adenokarcinómy (9 pacientov) a dlaždicových karcinómov ( 7)], žalúdka [črevnej (19) a difúzna typ (21) žalúdočné karcinómy], pečene [HCC (4), CC (6)], hrubého čreva (19) a konečníka (20; tabuľka 1)
<. p> LGR5-mRNA sa výrazne rozdielne exprimované v adenokarcinómu pažeráka (p = 0,007), žalúdka [typu črevnej (p = 0,006) a difúzneho typu (p = 0,013)], pečeň [CCS (p = 0,022)], hrubého čreva (p 0,001), ako aj konečník (p = 0,002) v porovnaní s krytej nenádorových tkanív. Avšak, žiadny rozdiel expresie bola nájdená v skvamóznych karcinómov pažeráka (p = 0,503) av porovnaní s HCC zodpovedajúcimi non-neoplastických tkanivách (p = 0,545; Obrázok 1).

Polyklonálne anti-LGR5- protilátka rozpozná ľudský LGR5 transfekována do HEK293 a MKN45 buniek

Ak chcete ďalej skúmať histoanatomical distribúcii LGR5 v ľudských tkanivách a skúmať jeho klinicko-patologický význam, protilátka LGR5 špecifická bol zvýšený, pretože komerčne dostupné protilátky urobil nesplní naše požiadavky (obrázok 2A). Vylúčiť krížovú reaktivitu novovytvorenej protilátky s najviac štruktúrne podobné LGRs, LGR4 a LGR6 sme vykonali porovnanie sekvencií s Národné centrum pre biotechnologické informácie
Alignment Tool vopred (dáta nie sú uvedené). Č sekvenčné homológie bolo nájdené LGR4 alebo LGR6 v oblasti peptidu LGR5 sme použili pre imunizáciu. Pre výber vysoko špecifické protilátky proti LGR5, klonované cDNA plnej dĺžky bola transfekována do HEK293 EBNA a používa sa ako vykonávajúci imunofluorescencia pozitívny cieľ. LGR5 cDNA bola priamo značené myc-epitopu, čo umožnilo vyhodnotenie transfekcia s tag protilátkou anti-myc. Pomocou imunofluorescencie, naviazanie anti-myc protilátky bolo zistené, po inkubácii s LGR5 /HEK293 buniek, ale nie v prázdnych vektorovej transfekciou buniek (vektor /HEK293), netransfekovanými HEK293 buniek, alebo v negatívnej kontrole LGR5 /HEK293 bunky boli inkubované s riedidlom protilátok namiesto primárnej protilátky. Rovnaký výsledok bol získaný, keď sme použili anti-LGR5-protilátka (obrázok 3), čo ukazuje, špecifické označovanie LGR5.

Špecifickosť LGR5-imunologické bola ďalej overená za použitia formalínom fixovaných a parafínových MKN45 žalúdočné rakovinové bunky. Bunky boli pripravené a farbené spôsobom, ktorý je paralelné spracovanie klinických vzoriek ľudských tkanív. Imunocytochemické analýzy na parafínové rezy odhalila pozitívne farbenie anti-LGR5-protilátka na MKN45 buniek stabilne transfekciou cDNA LGR5 (LGR5 /MKN45). Namiesto toho, prázdneho vektora transfekované MKN45 buniek (vektor /MKN45), rovnako ako negatívna kontrola (vynechanie primárnej protilátky) a kontrolné peptid (pre-inkubácie protilátky s jeho imunizačného blokovaciu peptid) z LGR5 /MKN45 buniek ukazuje žiadna väzba protilátky (obr S1).

LGR5 proteín sa špecificky anti-LGR5-protilátky u človeka zistený transfekované bunky MKN74

rakovina žalúdka u bunkových línií MKN74, známy vlastniť výraz mierny LGR5-mRNA (dáta nie sú uvedené) a ľudský nenádorových žalúdka, vykazuje veľmi nízku expresiu LGR5 (obrázok 1) boli vybrané na charakterizáciu reaktivity a špecifickosť anti-LGR5-protilátky na úrovni proteínu.

V analýzou western blot, LGR5 proteín bol rozpoznaný špecificky monospecifické anti-LGR5-protilátkou pri zriedení 1: 20,000. Sa identifikoval jeden pás sa zdanlivú molekulovou hmotnosťou 100 kDa v bunkových lyzátov MKN74 (obrázok 4), čo zodpovedá molekulovej hmotnosť vypočítaná pre LGR5 proteínu. Na rozdiel od toho žiadna skupina bola zistená v lyzáty ľudského nenádorových tkanív žalúdka, čo vylučuje priečny reaktivita anti-LGR5-protilátka s bunkovými proteínmi. V súlade s expresie mRNA dátami, silnejší expresia LGR5 proteínu bola pozorovaná v bunkách MKN74 stabilne transfekciou LGR5 cDNA, v porovnaní s kontrolnými MKN74 buniek transfekciou prázdnym vektorom. LGR5 expresie proteínov v ľudskom non-neoplastických žalúdočnú sliznicu bola mimo medze detekcie westernovým prenosom, pričom sa žiadny pás. Vynechanie anti-LGR5-protilátky alebo predchádzajúcej inkubácii protilátky s blokovaním jeho imunizačný peptid zobrazuje žiadne proteínových pásov, resp. Detekcia beta-aktínu proteínu (asi 43 kDa, obrázok 4) slúžila ako kontrola nanášania a potvrdiť rovnomerne vložený proteínové množstvo vo všetkých pruhoch

LGR5 je vyjadrená v non-neoplastické a neoplastické tkaniva z pečene a gastrointestinálne.
traktu

expresie a histoanatomical distribúcia LGR5 bol následne študovaná imunohistochemicky v sérii 127 tkanivových snímok získaných zo zodpovedajúcich nenádorových a neoplastickou tkanivo pečene a gastrointestinálneho traktu, ktorý zahŕňa pažeráka (14 pacientov), žalúdok (32), pečeň (24), pankreas (17), hrubého čreva (20), a konečníka (20; tabuľka 1). Z tejto kohorty neoplastických a zodpovedajúcich vzoriek nenádorových tkanív 105 pacientov bola tiež študovaná na úrovni transkripcie (pozri vyššie).

LGR5 vyjadrením celkovej kohorty bolo pozitívne v 65 prípadoch (51%) všetkých nemalígna tkanív a 103 prípadov (81%) všetkých rakovinových tkanív. Lokalizácia LGR5 expresie bol pozorovaný najmä cytoplazmatická, zatiaľ čo tiež došlo k ojedinelej membrána alebo membrána jadro zvýraznená výraz. LGR5-imunoreaktivita bola nájdená vo všetkých tkanivových zložiek, to znamená bunky strómy, endotelové bunky, bunky v nenádorových epitelu a v nádorových bunkách (obrázok 5). LGR5-imunoreaktivity v stromálnych buniek bola pozorovaná u 49 (39%) všetkých nemalígna tkanív a v 80 prípadoch (63%) všetkých rakovinových tkanív. Endoteliálny imunoreaktivita LGR5 bola pozorovaná v 42 prípadoch (33%) zo všetkých tkanív.

V nemalígna epitelu, LGR5 sa zvyčajne vyskytuje v niekoľkých rozptýlených bunkách blízko k bazálnej membráne žalúdočnej sliznice jednotky, pankreatické kanáliky a kolorektálny krypty. LGR5 nebol nájdený v dlaždicového epitelu pažeráka, intrahepatálna žlčovodov a hepatocyty (Obrázok 6). U všetkých typov tkanív na rozdiel od pažeráka tkaniva stredná hodnota IZS bol výrazne vyšší u nádorového tkaniva vzhľadom k krytej non-malígne tkaniva, čo potvrdzuje naše zistenia na úrovni transkripcie (tabuľka 1).

LGR5 je prítomný v roztrúsené bunky normálne žalúdočnú sliznicu

existencie multipotentních kmeňových buniek v myší žalúdku bola preukázaná klonálnej značenie štúdií. Definitívne identifikácie týchto buniek doteraz kvôli nedostupnosti konkrétnych endogénnych markerov [14] sa nepodarilo. Použitie sériových rezov získaných z resekcia rukáv vzorku, ktorá je zvyčajne získaných pre liečbu nadváhy a nevykazoval žiadnu histologické známky žalúdočné rakovina alebo chronickej gastritídy, hľadali sme LGR5 ^{+ epitelové bunky. Je zaujímavé, že rozptýlené LGR5 + bunky boli nájdené v hliene oblasti krku medzi foveolae a žliaz (obrázok 7).}

LGR5 je koexprimován s ďalšími potenciálnymi žalúdočných kmeňových buniek alebo progenitorov markery

Kmeňové bunky nenádorových tkanív a CSCS sú zvyčajne identifikované a validovať expresiou viac ako jedného markeru kmeňových buniek [15]. Pomocou imunohistochémia, Ďalej sme analyzovali koexpresi LGR5 s ďalšími predpokladané CSC markerov, tj ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 bol vybraný, pretože predchádzajúce štúdie zistili, ADAM17 ako domnelého kmeňových buniek marker žalúdka [8]. Imunologické (buď dvojité farbenie alebo farbenie sériových rezov) bola vykonaná na žalúdočné rakoviny vzorky a na zdravé uninflammed žalúdočnú sliznicu získaného objímky gastrektómia. Všeobecne možno povedať len niekoľko roztrúsených bunky vykazovali pozitívne imunologické pre jednu a /alebo druhú domnelého kmeňových buniek marker. Je zaujímavé, že nenádorových žalúdočnej sliznice skrýva bunky, ktoré sú každý ADAM17 ^{+ /LGR5 + (čo predstavuje približne jednu tretinu všetkých imunoreaktívnych buniek) a ADAM17 + /LGR5 - (dve tretiny) a ADAM17 - /LGR5 + (pár roztrúsených bunky, 2C-E)}

Musashi-1 (MSH-1) bol popisovaný ako domnelého kmeňových buniek marker v myšiam čreve. a ľudský žalúdok [18], [22] a ako marker CSC v nádoroch [23]. V nádorových a nenádorových žalúdočné tkanív pozitívnych zafarbených buniek, zložené prevažne z MSH-1 ^{+ /LGR5 - (približne dve tretiny všetkých imunoreaktívnych buniek), v menšej miere z MSH-1 + /LGR5 + (jedna tretina) a málo MSH-1 - /LGR5 + bunky (obr 2F-H). Nakoniec sa povrch markeru kolorektálneho karcinómu a žalúdočných kmeňových buniek CD44 [21], [24] odhalila distribúciu porovnateľné s MSH-1 (obr 2I, J). Súhrnne tieto výsledky podporujú hypotézu, že náš anti-LGR5-protilátka rozpoznáva bunky s expresiou kmeňových buniek vzorov v ľudskej žalúdočnej sliznice.}

Priestorovú rozloženie LGR5 + bunky zmeny v priebehu tumorogenézy

sekvenčné zmeny žalúdočnej sliznice, ktoré predchádzajú rozvoja invazívnej rakoviny sú známe ako "prekancerózne kaskády", prvýkrát popísaná v roku 1975, kedy je normálne žalúdočnej sliznice transformovanej chronickej atrofickej gastritídy a rozvíja multifokálne atrofiu a črevné metaplázia, nasleduje vzhľad dysplázia a nakoniec invazívneho karcinómu [25]. Ďalej sme testovali hypotézu, že vyššie uvedené histopatologické zmeny žalúdočnej sliznice sú spojené s prerozdelenie LGR5 ^{+ domnelých kmeňových buniek. Systematicky sme skúmali histoanatomical distribúciu LGR5 + buniek u 100 pacientov s črevnou typu rakoviny žalúdka. Celá montáž tkanivové rezy boli použité, ktoré uzavreté nenádorových, metaplastická a neoplastickou tkanivo rakoviny. To bolo zrejmé, že histoanatomical distribúcia LGR5 zmeniť + buniek (pozri obrázok 7): v non-neoplastických a non-metaplastického žalúdočnej sliznice, niekoľko roztrúsených LGR5 + bunky boli nájdené v mukóznej oblasti krku (obr 7A, E). V črevnej metaplázia, mierne zvýšený počet LGR5 + bunky boli lokalizované na dne metaplastického krýpt (obrázok 7B, F). Avšak pri type črevného karcinómu žalúdka lokalizácia a počtu LGR5 + buniek bola nápadne zmenené. V karcinómu žalúdka, LGR5 + bunky boli prítomné na luminální povrch (obrázok 7C, G), v stredu nádoru (medzi luminálním povrchom a invázne vpredu) a na invazívne vpredu (obrázok 7D). Veľmi zaujímavé je, distribúcia LGR5 + buniek karcinómu žalúdka ukázala charakteristické znaky: ZARIADENIE LGR5 + buniek došlo v súdržných škvrny rôzneho počtu nádorových buniek v rozmedzí od < 10, 10-50 a dokonca aj > 50 nádorové bunky, často tvorí gradienty znižovanie intenzity farbenia. Z celkového rozdelenie týchto LGR5 + buniek nádorových náplasťou bol nerovnomerný a nehomogénne. Kolektívne sme pozorovali nárast počtu a intenzity LGR5 + buniek nenádorových epitelu žalúdočnej rakoviny podporu našich Real-time RT-PCR a imunohistochémia dáta uzavreté (nenádorových proti neoplastickým) prípadov pacientov (pozri tabuľka 1). Naše zistenia zmenené distribúcia vzoru LGR5 + buniek je v súlade s tými, ktoré je opísané v Takeda et al. rakoviny hrubého čreva [26].}

Expresia LGR5 v intestinálneho typu karcinómu žalúdka koreluje s lokálnym rastu nádoru a šírenie uzlový

Predpokladá sa, že CSC vplyv prognózy pacientov na základe ich schopnosti tvoriť nádor bunkovej kolónie, nevyhnutným predpokladom pre šírenie metastáz a recidívy ochorenia. Ďalej preskúmať význam LGR5 na rakovinu žalúdka, sme koreloval expresiu LGR5 v črevnej typu rakovinou žalúdka s rôznymi charakteristikami pacienta klinicko-patologický.

• Ploche ONE: Znížená úroveň aktívnej Smad2 korelujú so zlou prognózou v žalúdočnej Cancer
• Ploche ONE: Glyoxalase-I je nová prognóza faktor spojený s rakovinou žalúdka Progression