Plos ONE: Prostorska porazdelitev LGR5 + celic sovpada s Rak želodca Progression

Povzetek

V tej študiji smo testirali razširjenosti, histoanatomical distribucijo in tumorjev biološki pomen NT ciljne beljakovin in rak matičnih celic marker LGR5 v tumorji gastrointestinalnega trakta ljudi. Diferencialna ekspresija LGR5 smo preučevali na transkripcijski (realnem času verižne reakcije s polimerazo) in ravni translatorno (imunohistokemija) v malignih in ustrezni nemalignih tkiv 127 bolnikov, ki obsega šest različnih primarne tumorske strani, tj požiralnika, želodca, jeter, trebušne slinavke, debelega črevesa in rektuma. Clinico-patološki pomen LGR5 izražanja so proučevali pri 100 bolnikih z želodčnega raka (GC). Non-tumorska tkiva običajno gojila le zelo malo raztreseni ^{+ celice LGR5. Ustrezne karcinomi iz požiralnika, želodca, jeter, trebušne slinavke, debelega črevesa in danke so pokazali bistveno več LGR5 + celic kot tudi znatno višje stopnje LGR5-mRNA v primerjavi z ustreznim ne-neoplastično tkiva. Dvojni barvanje poskusi pokazala soizražanjem LGR5 z domnevno označevalcev matičnih celic CD44, Musashi-1 in ADAM17. Nato smo testirali hipotezo, da so zaporedne spremembe želodca rakotvornost, to je kronično atrofični gastritis, intestinalno metaplazijo in invazivni karcinom, ki je povezana s prerazporeditvijo LGR5 + celic. Zanimivo je, da prostorska razporeditev LGR5 spremenilo: v ne-neoplastične želodčne sluznice, LGR5 + celice so bile ugotovljene predvsem v sluznici vratu; V intestinalno metaplazijo LGR5 + celice so bile lokalizirane na kripta bazo in GC LGR5 + celice so bile prisotne na luminalno površini, tumorski center in invazijo spredaj. Izraz LGR5 v tumor središče in invazijo pred GC močno povezana z lokalnim rastjo tumorja (T-kategorije) in vozla razpona (N-skupino). Poleg tega so imeli bolniki s LGR5 + GK krajšo mediano preživetje (28,0 ± 8,6 mesecev) kot pri bolnikih z LGR5 - GK (54,5 ± 6,3 meseca). Naši rezultati kažejo, da je LGR5 različno izražena v raka prebavil in da prostorska histoanatomical porazdelitev LGR5 + celice, da je treba upoštevati, ko se zahteva njihova tumor biološki pomen}

Navedba. Simon E, Petke D, Böger C Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) Prostorska porazdelitev LGR5 ^{+ celice povezana s želodca raka napredovanje. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486}

Urednik: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Združene države Amerike

Prejeto: 5. julij 2011; Sprejeto: 16. marec 2012; Objavljeno: 18. april 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ti avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi.. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

prebavil karcinomov so med najpogostejšimi malignih obolenj in so vodilni vzrok smrti zaradi raka na svetu [1], [2]. Razlogi za slabe napovedi so kompleksni: veliko raka prebavil, so diagnosticirali v poznejših fazah, razen kurativno zdravljenje, ni zanesljivih tumorskih markerjev, ki lahko omogočajo zgodnjo diagnozo, ali pregled prebivalstva z visokim tveganjem. Možnosti zdravljenja so omejeni na lokalno napredovalo in metastatsko boleznijo, in veliko število tumorjev ponovil kljub začetni terapevtski odziv [3]. Dozdevnega razlaga neučinkovito terapije je prisotnost raka matičnih celic (CSC). CSC hipoteza predpostavlja, da je tumor konglomerat populacij heterogenih celic. Le podskupina tega konglomerata ohranja sposobnosti tvorbe kolonij, in s tem ponavljanja in metastaze. FT so bolj odporne na kemoterapijo, ki vodi do tumorja ponovitve, napredovanje in smrti na koncu pacientov [4], [5]. Medtem ko je CSC model bolj priznava, identifikacija in potrditev tako imenovanih označevalcev matičnih celic v rodni človeško tkivo je težko in v veliki meri manjka. Pred kratkim je levcin bogati, G-protein pripojenega receptorja (GPCR) in NT ciljni gen LGR5
smo identificirali kot nova matičnih celic marker tankega črevesa, debelega črevesa in lasnih mešičkov miši [6] . Izražanje LGR5 v več drugih organov, kaže, da lahko predstavlja globalno marker odraslih izvornih celic. Vendar pa je malo znanega o svojem izrazu v hepatorenalnega prebavnem traktu ljudi.

V tej študiji smo želeli zapolniti to vrzel informacij in testirali hipotezo, da ima rak matičnih celic dvojno podajo LGR5 napovedni in tumor biološko pomen.

materiali in metode

Predmeti

formalin-fiksno in parafin vgrajeni maligne ustreza ne maligno tkivo od 127 bolnikov, ki obsega šest anatomske lokacije s jeter, prebavil trakt (tj požiralnika, želodca, jeter, trebušne slinavke, debelega črevesa in danke) so bili pridobljeni iz arhiva inštituti za patologijo krščanske-Albrechts-University Kiel in Charité University Hospital Berlin (oba Nemčija). Vsi bolniki so delovala na obeh University Hospital Schleswig-Holstein (1997-2009) ali Charité University Hospital Berlinu (1995-2008; tabela 1). Neposnetih, sveže zamrznjene tkivo je na voljo od 105 teh bolnikov z osmimi različnimi vrstami tumorjev, tj Barrettovega adenokarcinom (9 bolnikov) in karcinoma skvamoznih celic (7) požiralnika, črevesni (19) in razpršenih (21) tipa raka želodca, adenokarcinoma debelega črevesa (19) in danke (20), hepatocelularni karcinom (HCC; 4) in holangiokarcinom (CC; 6). Značilnosti bolnikov so povzeti v tabeli 1.

Neodvisna serija 487 bolnikov z rakom želodca je bila najdena iz arhiva Inštituta za patologijo krščansko-Albrechts-University (tabeli 2 in tabeli 3). Ti bolniki so opravili bodisi popolno ali delno želodca za adenokarcinoma želodca ali oesophago-želodca križišča. Vsak resekcijo vzorec so prestali histološki pregled pri usposobljenih kirurških patologi. Čas smrti bolnikov je bilo pridobljeno iz Epidemiološki podatki Registra raka
države Schleswig-Holstein, Nemčija. Podatki o spremljanju bolnikov še vedno živ so bili pridobljeni iz bolnišnične evidence in s kontaktiranjem splošnih zdravnikov.

Etika Izjava

Vse vzorce tkiva so bili pridobljeni v okviru diagnostičnega ali terapevtskega operacijo opravi po bolnik dali pisno soglasja. Bolniki, ki ponujajo vzorce za raziskavo so bili pseudonymized in analizirali anonimno, tako da ni v zvezi z individualni podatki so vsebovani v zbirki podatkov. Študija je bila odobrena s lokalnega odbora za etiko je v univerzitetni bolnišnici v Kielu v Nemčiji (ref. Številka D 453/10).

Real-time reverzne transkriptaze verižna reakcija s polimerazo

je Total RNA izolirali iz gojenih celic in cryoconserved tkiv uporabo Ambion je mirVana Mirna Izolacija kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Nemčija), ki mu sledi zdravljenje DNaze s Turbo DNA-prosti komplet (Ambion). Kakovost RNA je bila ocenjena na 1,5% agaroznem gelu. Za sintezo cDNK, 2 ug celotne RNA je bila reverzno prepisana uporabo Transcriptor prve verige cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemčija). Gene specifične primerji smo sintetizirali Biomers.net (Ulm, Nemčija) (tabela S1). Realnem času reverzne transkriptaze verižne reakcije s polimerazo (v realnem času RT-PCR) smo izvedli s pomočjo LightCyler® 480 sond Master (Roche) in LightCycler® 480 System (Roche). Primerjalni vrednosti Ct so normalizirajo, da tri oskrbniška genov: Homo sapiens sukcinat dehidrogenaze kompleks, podenota A, flavoprotein (Fp) (SDHA), Homo sapiens kalpainskega 2 (CAPN2)
in ciklofilin C ( CYCC)
. Brez kontrole predloge (ne cDNA v PCR) smo izvedli za vsak gen za ugotavljanje nespecifično ali genomske pomnoževanja in premaz, dimerizacijo. Vse eksperimente smo izvedli v dvojnikov.

Proizvodnja in čiščenje anti-LGR5-protiteles

poliklonskimi antiserumi bili ustvarjeni proti karboksi-terminalni repu LGR5 receptorja pri ljudeh. Kunci so bili cepljeni s tremi različnimi peptidi identitete SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (imenovano Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (imenovana 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (imenovan 12), ki ga je Pineda-abservice (Berlin, Nemčija). Monospecifičen IgG smo očistili s hitro proteinsko tekočinsko kromatografijo s sistemom ÄKTAprime ™ (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) z uporabo protein A-steber (GE Healthcare). Za vse nadaljnje preiskave, tj imunofluorescenčni, imunocitokemija, Western Blot in imunohistokemijo, je monospecifičen IgG frakcije afiniteto očistimo pred imunizacijo peptidov, ki jih je Pineda-abservice. V dot blot analiz in imunohistokemičnim preiskave je monospecifičen IgG anti-LGR5-11b protitelesa prikaže veliko afiniteto skupaj z močno in posebno imunskim barvanjem. Zato smo uporabili te protitelo vsej tej študiji. Reaktivnost in specifičnost monospecifičnim protiteles je bila značilna Western Blot; imunofluorescentni in imunocitokemijski testi.

plazmida gradnjo

Expression gradnjo za LGR5 je bil ustvarjen z okrepitvijo celotno kodira zaporedje človeškega LGR5
(NM_003667.2) s PCR (tabela S1 ). Za lažje subkloniranje namnoženega fragmenta v izraz vektor pcDNA3.1 na (-), naprej primer vseboval Nhel omejitev stran adapter in obratno primer vseboval mesto BamHI in c-myc oznako, da preveri uspešno transfekciji. PCR fragmentov in pcDNA3.1 (-) ekspresijski vektor smo razgradili ločeno z Nhel in BamHI pred vezavo s T4-ligazo (Roche). Plazmid je bila preverjena s prebavo z Nhel in BamHI in DNA sekvenciranja uporabo ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits, Version 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Nemčija).

celične kulture in transfekciji

človeško želodčni rak celično linijo MKN74 je bila pridobljena iz japonskega Health Science Research Resource Bank (Osaka, Japonska) in MKN45 iz nemške zbirke mikroorganizmov in celičnih kultur (Braunschweig, Nemčija). HEK293 EBNA celice so kupili Invitrogen (Carlsbad, CA, ZDA). Celice gojimo v RPMI 1640 medija (MKN74, MKN45) ali Dulbeccovem spremenjenimi Eagle medijem (HEK293) z dodatkom 10% (MKN74, HEK293) oziroma 20% (MKN45) fetalni goveji serum, 100 E /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Avstrija). DNA transfekcija HEK293 EBNA, MKN74 in MKN45 celic je bilo izvedeno z Lipofectamine LTX reagenta (Invitrogen), po navodilih proizvajalca. Na kratko smo celice gojimo v šestih vdolbinami. Stabilna transfekcija MKN74 in MKN45 z ekspresijskimi plazmidi smo izvedli kot je opisano predhodno [7]. Prehodni transfekciji s HEK293 celice smo 1 ug plazmidne DNA in 5 ul Lipofectamine LTX reagenta razredčimo v 500 ul Dulbeccovem Modified Eagle medij brez seruma, oz. Po inkubaciji 30 minut pri sobni temperaturi, zmes dodamo k HEK293 celice. Oseminštirideset ur po transfekciji smo transficirane celice poberemo in izoliramo RNA ali proteinov. Transfektiranih z vektorsko pcDNA3.1 (-) sam in netransficirane celice služil kot negativne kontrole

Imunofluorescenčni

Štiriindvajset ur po sejanju na CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgija). celice smo oprali s fosfatnim pufrom, določena v 7:3 acetone:methanol (20 minut, 20 ° C) in nato permeabiliziramo z 0,1% Triton-X (5 minutami, sobna temperatura). Ploščice smo potem inkubirali s c-myc miške monoklonsko protitelo (Clontech, Mountain View, CA, ZDA) preko noči pri + 5 ° C v vlažni komori, čemur sledi anti-miš Alexa Fluor 555 konjugiranega sekundarnega protitelesa (Invitrogen). Zazna uspešno transfekcijo LGR5 smo celice inkubirali z anti-LGR5-protitelesa, ki mu sledi anti-kunčjega sekundarnega protitelesa, konjugiranega s Alexa Fluor 488 (Invitrogen) vsak eno uro pri sobni temperaturi. Opustitev primarnih protiteles na LGR5 transfektirali HEK293 EBNA celice služil kot negativno kontrolo. Montaža in counterstaining je bilo storjeno z VECTASHIELD Hard-Set, vključno DAPI (Vector Laboratories, Inc., BURLINGAME, CA, ZDA).

imunocitokemija

imunocitokemijski obarvanje je bila izvedena na formalinom določen, paraffin- vgrajeni MKN45 želodčne rakave celice. Za ta namen so MKN45 celice vgrajene v majhnih agarozne kroglice kot je opisano predhodno [8]. Nadaljnja predelava in imunskim barvanjem z anti-LGR5-protitelesa (redčenje 1:1000) je bila opravljena po imunohistokemijske analize odsekov človeških tkiv (glej spodaj). Opustitev primarnega protitelesa na LGR5 transfektirali MKN45 celice služil kot negativno kontrolo, medtem ko je bila specifičnost obarvanje anti-LGR5 protiteles potrdili z inkubacijo protiteles z imunizacijska blokira peptid.

Western blot

Beljakovinski lizati so bili pridobljeni z inkubacijo človeškega želodca tkivo in kultivirani želodčnih celic z ProteoJET ™ sesalcev razpad celic Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Nemčija) in koktajl zaviralca proteaz (Complete EDTA-free, Roche). Vzorce proteinske smo denaturiranega v Laemmli pufru (60 mM Tris-HCI pH 6,8, 2% natrijevega dodecil sulfata, 10% glicerol, 5% β-merkaptoetanola in 0,01% bromfenol modra), s segrevanjem pri 95 ° C za deset minut in so bili nato naložen na 4% do 16,5% SDS poliakrilamidnem gelu in vizualizirali z barvanjem s Coomassie modro. Po ločitvi so proteini na neobarvano poliakrilamidnih gelih prenese na nitrocelulozno membrano (Amersham, Freiburg, Nemčija), immunoblotted z anti-LGR5-protitelesa (redčenje 1:20,000) in anti-P-aktina-protitelo (1:10,000; klon AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), da se zagotovi enako količino nakladanje. Membrano vezan HRP označena sekundarna protitelesa (DakoCytomation, Glostrup, Danska) so bile odkrite z okrepljenim kemiluminescence po sistemu ECL (Amersham). Opustitev primarnega protitelesa služil kot negativno kontrolo, medtem ko je bila specifičnost obarvanje anti-LGR5 protiteles potrdili z inkubacijo protiteles z imunizacijska blokira peptid.

Histologija

Za analizo histološki, tkivo vzorci so bili določeni v 10% nevtralizirana formalina in vdelali v parafin. Deparaffinized odseki smo obarvali z uporabo hematoksilinom in eozinom (H &E). Želodčni karcinom je bil razvrščen v skladu s klasifikacijo Svetovne zdravstvene organizacije [9]. Oder pTNM je bila določena v skladu s 7 ^{th izdaja Mednarodne zveze proti raku [10].}

Tissue micro matrika konstrukcije

formalin-fiksno in vzorce tkiva, parafinske vgrajeni so bili uporabljajo za ustvarjanje tkiva mikro zaporedja kot je opisano predhodno [11]. Štiri mikrometer odseki, ki izhaja tumor tkiva mikro diod bloku so se zmanjšale za nadaljnjo analizo. Uspešen prenos tumorskega tkiva je potrdila mikroskopsko, H &. E-obarvane dele

Imunohistokemija

Za imunohistokemijo, so bili uporabljeni formalina fiksno in parafinske vgrajeni odseki. Imunskim barvanjem je bila izvedena z anti-LGR5-protitelesa (redčenje 1:1000), ki je monoklonsko protitelo, usmerjeno proti CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, Velika Britanija) in poslovne poliklonska protitelesa usmerjena proti LGR5 (LGR5 ^{com , 1:400, Abcam, Inc., Cambridge, MA, ZDA), ADAM17 (redčenje 01:50, Sigma-Aldrich) in Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, ZDA). Po 20 minutah blokirajo z vodikovim peroksidom blok (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA), 5 minut zdravljenje z Ultra V bloku (Thermo znanstvenega) in inkubacijo s primarnim protitelesom bilo narejeno v vlažni komori pri sobni temperaturi 30 minut. Drsi speremo med stopnjama s Tris pufrom (TBS). Imunske reakcije smo prikazali z n-Histofine Enostavno Stain MAX PO sistema (Nichirei biološke znanosti, Tokio, Japonska) in DAB substrata (Linaris, Wertheim-Bettingen, Nemčija). Za dvojno obarvanje LGR5 s CD44, ADAM17 in Musashi-1, so bile proste zavezujoči mesta blokirana z miško, IgG in nadzor zajec-IgG (Abcam) razredčiti v razredčilom protiteles (ZYTOMED Systems, Berlin, Nemčija) po DAB zdravljenju. Osebki so jih nasprotno z hematoksilinom. Opustitev primarnega protitelesa služil kot negativne kontrole. Non-neoplastični človeški želodec (CD44) in možgansko tkivo (LGR5 com, LGR5 in Musashi-1) je služila kot pozitivne kontrole.}

Vrednotenje imunskim barvanjem

imunskim barvanjem ne-neoplastične epitela in tumorskih celic je dosegel z uporabo sistema radioinkorporacijo točkovanja (IRS). Na kratko, kategorija A dokumentirani intenzivnost imunskim barvanjem kot 0 (brez imunskim barvanjem), 1 (šibko), 2 (zmerno) in 3 (močan). Kategorija B dokumentirani odstotek imunoreaktivnih celice, 0 (negativna), 1 (razpršene pozitivnih celic; ≤1%), 2 (2-10% pozitivnih celic), 3 (11-50%), 4 (51-80%) in 5 (> 80%). Dodajanje kategorije A in B povzročilo IRS v območju od 0 do 8 za vsak posamezen primer. Distribucijskega spremembe LGR5 ^{+ celice v 100 celih oddelkov mount raka črevesne tipa želodca je dosegel takole: število imunoreaktivnih celic je bil kategoriziran kot 0 (negativni), 1 (< 10 pozitivne celice), 2 (10 -50 pozitivne celice) in 3 (> 50 pozitivne celice) ločeno za luminalno površine, tumorja center in invazijo fronti}

Statistični analize

Statistične analize so bile izvedene z uporabo PASW Statistics 18. statistični paket (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Primerjave med skupinami smo testirali z uporabo Fisherjev test. Korelacija LGR5 izražanja v eni skupini je bila ustanovljena z tau rang reda korelacije Kendall je. Krivulji preživetja so bili opremljeni z metodo Kaplan-Meier in razlik v preživetju s testom log ranga ocenjenih. Pomen korelacij LGR5 izražanja v primarnih tumorjev in ustrezno non-malignega tkiva je ocenil test Wilcoxonov. Podatki v realnem času RT-PCR, ki so bile ocenjene z seznanjeno dvostransko t-test, dobil logarithmized da dobimo približno normalno porazdeljene podatke. P-vrednosti. ≪ 0,05 je štela kot statistično značilne

Rezultati

LGR5-mRNA je različno izražena v jeter, prebavil karcinomov

LGR5 je po navedbah izraženih v mišje izvornih celicah črevesna grobnica [12] in je pogosto prekomerno v celičnih linijah črevesnega raka [13]. Da bi raziskali svoj izraz v ne-neoplastične in neoplastične človeškega tkiva, smo ocenili transkripcijski izražanje LGR5 v človeških kliničnih vzorcev, sestavljenih iz širokega spektra jeter, prebavil karcinomov. Real-time RT-PCR analiza je bila izvedena na seriji 105 bolnikov, ki vsebujejo maligne in ustrezno ne maligno tkivo, pridobljenega iz istih bolnikov, osem različnih vrst tumorjev: požiralnika [Barrett adenokarcinomov (9 bolnikov) in ploščatocelični karcinom celic ( 7)], želodec [črevesna (19) in razpršeno tipa (21), želodčni karcinomi], jetra [HCCs (4), katerih uvedba (6)], kolona (19) in danke (20, tabela 1)
<. p> LGR5-mRNA je bistveno različno izražena v adenokarcinomov na požiralniku (p = 0,007), želodčne [črevesnih tipa (p = 0,006) in razpršenega tipa (p = 0,013)], jetra [CCS (p = 0,022)], na debelem črevesu (p < 0,001), kot tudi rektuma (p = 0,002) v primerjavi z ujemajočo ne-neoplastično tkiva. Vendar ni bilo razlika izraz najdemo v ploščatocelični karcinom celic v požiralniku (p = 0,503) in HCCs primerjavi z ustreznimi ne-neoplastičnih tkiv (p = 0,545; slika 1).

A poliklonski anti-LGR5- protitelesa zazna človeško LGR5 transfekcirajo v HEK293 in MKN45 celic

za nadaljnje raziskovanje histoanatomical porazdelitev LGR5 v človeških tkiv in razišče njegovo klinično-patoloških pomen, se je pojavilo protitelo LGR5 specifična, saj si je na voljo na tržišču protitelesa ne ustreza našim zahtevam (Slika 2A). Če želite izključiti navzkrižna reaktivnost novo nastalih protiteles z najbolj zgradbi podobna LGRs, LGR4 in LGR6, smo izvedli zaporedno usklajevanje s National Center za biotehnologijo informacij
orodje za poravnavo vnaprej (podatki niso prikazani). No sekvenci bilo ugotovljeno z LGR4 ali LGR6 v območju LGR5 peptida smo uporabili za imunizacijo. Za izbiro zelo specifičnih protiteles proti LGR5, smo klonirali cDNA polne dolžine transfektirali v HEK293 EBNA celic in uporabimo kot pozitivno ciljni opravlja imunofluorescence. CDNA LGR5 bil neposredno označena s myc-epitop, kar je omogočilo oceno transfekciji z anti-myc tag protitelesa. Z uporabo imunofluorescence, vezavo anti-myc tag protitelesom je bilo ugotovljeno po inkubaciji z LGR5 /HEK293 celice, ne pa tudi v praznih prenašalci transfektirali celic (vektor /HEK293), netransficirane HEK293 celice ali v negativni kontroli LGR5 /HEK293 celice inkubiramo z razredčilom protiteles namesto primarnega protitelesa. Enak rezultat je bil pridobljen, ko smo uporabili anti-LGR5-protitelo (slika 3), kar dokazuje, posebno označevanje LGR5.

Specifičnost LGR5-immunolabelling bila potrjena tudi s pomočjo-formalinom fiksnih in parafina-vgrajeni MKN45 želodca rakave celice. Celice smo pripravili in obarvamo na način, ki poteka vzporedno obdelavo kliničnih primerkov človeških tkiv. Imunocitokemijski analiz o parafinske sekcije pokazala pozitivno barvanje anti-LGR5-protitelesa na MKN45 celice stabilno transfekciji s LGR5 cDNA (LGR5 /MKN45). Namesto prazne MKN45 celice, vektorskih transfektiramo (vektor /MKN45), kot negativna kontrola (opustitev primarnega protitelesa) in nadzor peptid (predinkubacijo protitelesa s svojo imunizirajoče blokirnega peptid) iz LGR5 /MKN45 celic pokazala no vezavo protitelesa (Slika S1).

LGR5 protein posebej zazna anti-LGR5-protitelesa v transfekciji humanih MKN74 celic

človeške želodčne rak celičnih linij MKN74, je znano, da posedovati zmerno LGR5-mRNA izraz (podatki niso prikazani) in človek ne-neoplastične želodec, kažejo zelo nizko LGR5 izraz (slika 1) so bili izbrani za označevanje reaktivnost in specifičnost proti LGR5-protitelesa na ravni beljakovin.

v zahodni analizi blot, je LGR5 protein priznana in sicer z monospecifičnim proti LGR5-protitelesa pri razredčitvi 1:20,000. Je opredeljen en trak z navidezno molekulsko maso 100 kDa v celičnih lizatov MKN74 (slika 4), ki se ujema z molekulsko maso izračunano za LGR5 proteina. V nasprotju s tem, ni bila zasedba odkrita v lizatov človeškega non-neoplastične želodčno tkivo, ki izključuje navzkrižno reaktivnost proti LGR5-protitelo z celičnih proteinov. V skladu s podatki mRNA izražanja, so opazili močnejši izraz LGR5 beljakovin v MKN74 celic stabilno transfekciji s LGR5 cDNA, v primerjavi z MKN74 kontrolnih celicah transfekciji s praznim vektorjem. LGR5 protein izraz v humani non-neoplastične želodčne sluznice je bila nad mejo detekcije Western blotting-om, ki nikakor niso band. Opustitev anti-LGR5-protiteles ali prejšnji inkubacijo protitelesa z njeno imunizacijska blokiranje Peptid Prikazuje ni proteinske trakove, oz. Odkrivanje beta-aktin beljakovine (približno 43 kDa; slika 4), služil kot kontrola nakladanje in potrdil enakomerno naložen količine beljakovin v vseh stezah

LGR5 je izražena v ne-neoplastične in tumorska tkiva od jeter, prebavil. trakt

izražanja in histoanatomical distribucijo LGR5 so nato preučevali z imunohistokemijo v seriji 127 tkivnih stekelc pridobljen iz ustreznih non-neoplastične in neoplastične tkivo hepatorenalnega gastrointestinalnega trakta, ki obsega požiralnik (14 bolnikov), želodcu (32), jetra (24), trebušne slinavke (17), kolona (20) in danke (20, tabela 1). Od tega kohorte neoplastični in ustreznimi ne-neoplastične vzorcev tkiva 105 bolnikov so preučevali tudi na transkripcijski ravni (glej zgoraj).

LGR5 izraz celotne kohorte je bil pozitiven v 65 primerih (51%) vseh non-malignih tkiva in 103 primerov (81%) vseh rakavih tkiv. Lokalizacija LGR5 izražanja so opazili predvsem cytoplasmatic, medtem ko je tudi prišlo do sporadična membrana ali jedro membrane poudarjeni izraz. LGR5-radioinkorporacijo je bilo ugotovljeno v vseh sestavnih delih tkiva, tj strome celic, endotelijskih celic, celic v ne-neoplastične epitela in v rakavih celic (slika 5). LGR5-radioinkorporacijo v strome celicah smo opazili pri 49 (39%) vseh nemaligne tkivih in v 80 primerih (63%) vseh rakavih tkiv. Endotelijska radioinkorporacijo od LGR5 opazili v 42 primerih (33%) vseh tkivih.

V non-malignega epitela, LGR5 je ponavadi v nekaj raztresenih celicah blizu bazalne membrane za želodčne sluznice enoto, trebušne vodi, in debelem grobnica. LGR5 ni bilo mogoče najti v skvamoznega epitelija požiralnika, intrahepatičnih žolčnih vodov in hepatociti (slika 6). Za vse vrste tkiv narazen iz požiralnika tkiva je bila srednja vrednost IRS bistveno višji za tumor tkiva glede na izravnane ne maligno tkivo, ki potrjuje naše ugotovitve na transkripcijski ravni (tabela 1).

LGR5 je prisotna v razpršene celice normalne želodčne sluznice

obstoj multipotentne matičnih celic v mišje želodca je bila dokazana s klonskih študij označevanja. Dokončna opredelitev teh celic ni doslej zaradi nerazpoložljivosti posebnih endogenih markerjev [14]. Uporaba serijske dele pridobiva iz rokav resekcijo vzorcu, ki se običajno pridobiva za zdravljenje prekomerne telesne teže in se niso histološki dokaz raka želodca ali kronični gastritis, smo iskali LGR5 ^{+ epitelijskih celic. Zanimivo je, da razpršene + celic LGR5 so našli v sluznice vratu med foveolae in žlez (Slika 7).}

LGR5 je hkrati izraženi z drugimi potencialnimi želodčnih označevalcev matičnih celic ali matičnih celic

Matične celice niso tumorska tkiva in CSCS so običajno opredeljeni in potrjeni z izraženimi več kot eno matičnih celic označevalec [15]. Uporaba imunohistokemično smo poleg analizirali soizražanjem LGR5 z drugimi domnevno CSC označevalcev, tj ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 bila izbrana, ker prejšnje študije označene ADAM17 kot domnevni označevalec izvornih celic želodca [8]. Imunskim barvanjem (bodisi dvojno obarvanje ali obarvanje serijskih oddelkov) je bila izvedena na želodčnega raka vzorcu in o zdravi uninflammed želodčne sluznice, pridobljen z rokavi želodca. Na splošno le nekaj razpršenih celice so pokazale pozitiven imunskim barvanjem za eno in /ali drugo domnevno izvornih celic marker. Zanimivo je, da ne-neoplastične želodčne sluznice skriva celice, ki so vsak ADAM17 ^{+ /LGR5 + (kar predstavlja približno tretjino vseh imunoreaktivnih celic) in ADAM17 + /LGR5 - (dve tretjini) in ADAM17 - /LGR5 + (nekaj raztresenih celice; 2C-E)}

Musashi-1 (MSH-1) je bil opisan kot domnevni označevalec matičnih celic v črevesju miške. in človeški želodec [18], [22] in kot CSC označevalec v tumorjih [23]. V neoplastične in ne-neoplastične želodca tkiva pozitivno obarvanih celic, sestavljeno predvsem iz MSH-1 ^{+ /LGR5 - (približno dve tretjini vseh imunoreaktivnih celic), v manjšem obsegu MSH-1 + /LGR5 + (ena tretjina), in malo MSH-1 - /LGR5 + celice (Slika 2F-H). Končno ploskev marker kolorektalnih in želodčnih rak matičnih celic CD44 [21], [24] pokazala porazdelitev primerljiv s MSH-1 (slika 2 I, J). Kolektivno, te ugotovitve podpirajo hipotezo, da je naša anti-LGR5-protitelo zazna celice z matičnimi celicami vzorcev izražanja v želodčni sluznici ljudi.}

Prostorska razporeditev LGR5 + celice spremembe med tumourigenesis

zaporedne spremembe želodčne sluznice, ki predhoden razvoj raka invazivne so znani kot "predrakavih kaskade", najprej opisan leta 1975, pri čemer je normalna sluznico želodca transformirana s kroničnim atrofičnega gastritisa in razvija multifokalne atrofijo in intestinalno metaplazijo, čemur sledi pojav displazije in končno invazivni karcinom [25]. Nato smo testirali hipotezo, da so prej omenjene histopatološke spremembe želodčne sluznice, povezane s prerazporeditvijo LGR5 ^{+ domnevnih matičnih celic. Sistematično smo raziskovali histoanatomical porazdelitev LGR5 + celic 100 bolnikov z rakom črevesno tipa želodca. Cela odseki mount tkiva so bili uporabljeni, ki zaprt non-neoplastični, metaplastic in virusne raka tkiva. To je bilo jasno razvidno, da je histoanatomical porazdelitev LGR5 + celice spremenili (glej sliko 7): v ne-neoplastične in non-metaplastic želodčne sluznice, nekaj raztresenih + celic LGR5 so našli v sluznice vratu (Slika 7A, E). V intestinalno metaplazijo, nekoliko povečano število LGR5 + celice lokalizirana na dnu metaplastic grobnicah (slika 7B, F). Vendar pa je v črevesni rak tipa želodca lokalizacija in število LGR5 + celic je presenetljivo spremenilo. V raka želodca, je bilo LGR5 + celice prisoten na luminalno površino (Slika 7C, G) v tumorju centru (med luminalno površino in invazijo spredaj) in invazijo spredaj (Slika 7D). Najbolj zanimivo je, da je porazdelitev LGR5 + želodčnih rakavih celic je pokazala značilne vzorce: The LGR5 + celic prišlo v kohezivnih obliži spremenljivo število tumorskih celic, ki segajo od < 10, 10-50 in celo > 50 tumorske celice, pogosto tvorijo gradientov zmanjšuje intenzivnosti obarvanja. Skupna porazdelitev teh LGR5 + obliži tumorskih celic je bil neenakomeren in nehomogen. Kolektivno, smo opazili povečanje števila in intenzivnosti LGR5 + celic iz tretjih neoplastične epitela z rakom želodca, ki podpirajo našo Real-time RT-PCR in podatke imunohistokemija z ujemanjem (non-neoplastični primerjavi neoplastični) primerih bolnikov (glej tabela 1). Naše ugotovitve spremenjenega distribucijski vzorec LGR5 + celic je v skladu s tistimi, ki jih Takeda et al. kolorektalnega raka [26].}

Izraz LGR5 pri raku črevesne tipa želodca povezana z lokalno rast tumorjev in vozla razpona

Domneva se, da je CSC vpliva prognozo bolnikov z njihovo sposobnostjo oblikovanja tumor celične kolonije, nujen predpogoj za metastaze in bolezni ponovitve. Da bi še dodatno raziskati pomen LGR5 za raka želodca, smo v korelaciji izražanje LGR5 v črevesni rak želodca tipa z različnimi klinično-patološke značilnosti bolnikov.

• Plos ONE: znižane ravni aktivnega SMAD2 korelaciji s slabo prognozo želodčnega raka
• Plos ONE: Glyoxalase-I je nova Prognoza faktorjev, povezanih z Rak želodca napredovanje