Plos ONE: Podocalyxin kot prognostičnih Marker želodčnega raka

Povzetek

Ozadje

Podocalyxin podobni 1 (PODXL) je celično adhezijo glikoprotein povezana z agresivnim tumorja fenotip in slabo prognozo v številnih oblikah raka. Cilj te raziskave je bil raziskati PODXL izraz v raka želodca z uporabo dveh različnih protiteles.

Metode

Z tumor-tkivnih mikromrež in imunohistokemijo smo ocenili PODXL izražanje v tumorskih vzorcev od 337 bolnikov ki so bili operirani za adenokarcinomom želodca v Univerzitetni bolnišnici v Helsinkih. Uporabili smo dva različna protitelesa:. HPA2110, ki je monoklonsko protitelo in-house monoklonsko protitelo, imenovano HES9, da razišče združenje PODXL izražanja z clinicopathologic spremenljivk in preživetje bolnikov

Rezultati

PODXL obarvanje bil pozitiven ga poliklonskega protitelesa v 153 (57,5%) primerih in monoklonskih protiteles pri 212 (76%). Poliklonsko ekspresijo protiteles je bil povezan s črevesno vrsto raka (p < 0,001). Monoklonsko protitelo obarvanje je bila povezana s starostjo nad 66 (p = 0,001), pri čemer raka na debelem črevesu (p < 0,001) in z majhno velikost tumorja (≤ 5 cm; p = 0,024). Oba protitelesa so povezani z visokimi S-faza frakcija (p = 0,022; p = 0,010) in indeks širjenje visoke tumorja (Ki-67; p = 0.003; p = 0,001). PODXL pozitivnost, ki poliklonskega protitelesa indicirana zmanjša želodca, raka specifične 5-letno preživetje za 24,0% (95% IZ 16,9-31,1), v primerjavi s 43,3% (95% IZ 33,7-52,9) za bolnike z PODXL negativnosti (p = 0,001 ). Rezultat je ostal pomembna multivariabilnega analizi. (HR = 3,17, 95% IZ 1,37-7,34, p = 0,007)

Zaključek

Pri raku želodca, PODXL izraz, ki ga poliklonskega HPA2110 protiteles je neodvisna označevalec slabo prognozo

Navedba. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Kokkola A, Fermér C, Nilsson o, et al. (2015) Podocalyxin kot prognostičnih Marker želodčnega raka. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10,1371 /journal.pone.0145079

Urednik: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

Prejeto: 15. septembra 2015; Sprejeto: 29. november 2015; Objavljeno: 16. december 2015

Copyright: © 2015 Laitinen et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. Ta študija je bila podprta s sredstvi iz Finska Läkaresällskapet, je Kurt och Doris Palander Foundation, Sigrid Jusélius Foundation, in medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB in Onson Consulting zagotovila podporo v obliki plač za avtorji CF in ON, vendar ni imel nobene dodatne vloge pri oblikovanju študije, zbiranje podatkov in analizo, odločitev za objavo, ali pripravo rokopisa.

nasprotujočimi si interesi:. avtorji so poročali, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

v zadnjih desetletjih se je incidenca raka želodca zmanjšala, zlasti v zahodnih državah, očitno zaradi na upada pojavnosti Helicobacter pylori
, k boljši higieni in manj gneče dnevno. Ker ima želodčni rak slabo prognozo, je še vedno globalno drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka [1]. Stopnja preživetja 5 let, kljub kurativno operacijo, je le okoli 10-30% [2]. Visoka umrljivost je predvsem zaradi pozne diagnoze.

UICC Tumor Node Metastasis (TNM) razvrstitev je daleč najbolj dosledno prognostičnega sistema razvrščanja danes. Vendar pa celo v istih tumorjih oder skupine, potek bolezni lahko razlikujejo. Ustvarjanje metode za natančnejšo oceno neoplazije agresivnosti bi bila vrednost pri ocenjevanju prognozo posameznih bolnikov z rakom želodca.

Podocalyxin podobni 1 (PODXL) je anti-lepilo transmembranski glikoprotein, ki spada v družino CD34 . Izraža se običajno s podocytes ledvic [3], krvni matičnih celic [4], vaskularne endothelia [5], in prsi epitelne celice [6].

Klinični pomen PODXL v napredovanju raka je bila raziskana v različne vrste karcinoma, najprej kot označevalec matičnih celic v modih [7]. Poznejši ugotovitev je, da tumorske celice specifične PODXL izraz povezano z bolj agresivnim fenotipom in neželenim izidom v nekaterih vrstah raka, na primer v dojki [6], prostate [8], jajčnikov [9], kolorektalnega [10- 12], urotelijskim mehurja [13], trebušne slinavke [14] in raka periampullary [15].

cilj te raziskave je bil raziskati PODXL izraz v raka želodca, da razkrije njeno morebitno vlogo pri agresivnosti in prognozo. Odločili smo se za uporabo dveh PODXL protitelesa, ki priznavajo različne epitope: monoklonsko v hiši HES9 protiteles in komercialno na voljo poliklonsko HPA2110 protiteles. Pred kratkim smo izvedeli, da sta ti dve protitelesa neodvisni označevalci slabo prognozo pri raku debelega črevesa in [12]. Oba protitelesa lahko prepozna dve skupini bolnikov z rakom debelega črevesa, tako med katerimi imajo slabo prognozo; kombinirana uporaba teh protiteles je pokazala skupino bolnikov s še slabšo prognozo [16].

Materiali in metode

Bolniki

Študija je zajela 337 zaporednih bolnikov, ki so bili operirani na histološko preverjeno želodčni adenokarcinom na oddelku za kirurgijo, Univerzitetni bolnišnici v Helsinkih, od leta 1983 do 1999. Diagnoza in uprizoritev v skladu s klasifikacijo UICC pod pogojem, 100 (29,7%), stopnja IA-IB, 41 (12,2%) fazo II, 96 (28,5%) stopnje IIIA, IIIB, in 100 (29,7%), stopnja IV bolniki. Limfna vozlišča metastaze pojavile pri 184 (55%) in oddaljenih zasevkov v 93 (28%) primerih. Srednja starost je bila 66 let (razpon 30-87) in 163 (48%) žensk in 174 (52%) moških. Popolna ali delna želodca z daljšo (D2-D2 +) limfadenektomijo je bila izvedena v 34 (10%) bolnikov, celotnega želodca z D1-limfadenektomijo pri 161 (48%), in vmesnega seštevka želodca z D1-limfadenektomijo pri 142 (42%). Skupno je bilo 143 (43%) bolnikov operirali s kurativno namenom, medtem ko je 176 (52%) doživela paliativno operacijo. Noben prejel novi dopolnilni zdravljenja, vendar 32 (9%) bolnikov je prejelo pooperativno zdravljenje adjuvans (28 kemoterapijo, 2 radioterapija, 2 pa oboje). Podatki o preživetju in vzrok smrti do novembra 2013 je prišel iz evidenc bolnikov je register prebivalstva center Finske in statistika Finska.

Raziskavo je odobrila Kirurški Odbor za etiko na Univerzitetne bolnišnice v Helsinkih (Dnro HUS 226 /E6 /06, razširitev TMK02 §66 2013/04/17) in nacionalni nadzorni organ za dobro počutje in zdravje je dal dovoljenje za uporabo vzorcev tkiva brez posameznega soglasja v retrospektivni študiji (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

vzorce tkiva

formalin-fiksno in kirurški vzorce tkiva, parafinske vgrajeni prišel iz arhiva oddelka za patologijo. Tkiva bolnikov so de-identificirati in analizirati anonimno. Histopathologically so bili opredeljeni reprezentativnih področja tumorskih vzorcev in se označi na haematoxylin- in eozinom obarvajo diapozitive. Tri jedra iz vsake tumorja bloku so bili vzorčeni s 0,6-mm Punchers in vgrajeni v novem parafinsko bloku z microarrayer polavtomatsko tkiva (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Od šestih tkiv nizov blokov, pripravljenih, vsak vsebuje 24-192 tumorskih vzorcev. Področja 4 um vsakega smo razrezali in pripravljena za imunohistokemijo.

Protitelesa

smo primerjali dva PODXL protiteles proti različnim epitopom. Poliklonska protitelesa (HPA2110, Atlas Protitelesa, Stockholm, Švedska) je postavljeno proti peptidu s aminokislinskih ostankov 278-415 iz PODXL in monoklonska interni HES9 protitelo [12] priznava aminokislinski ostanki 189-192 iz PODXL . Oba epitopi pojavljajo v zunajcelični delu PODXL molekule. Epitop zaporedje HPA2110 ujema tri beljakovin kodiranje PODXL spojene variante s 100% (PODXL 001, 005 in 201, humani protein Atlas). Četrti spoj različica ujema z 87% (PODXL 202). Epitop sekvence HES9 ustreza 100% vseh spojenih variant. Protitelesa so podrobno opisani [12,17,18] leta.

Imunohistokemija

Profili so bile določene za diapozitive in sušimo pri 12 do 24 ur pri 37 ° C, nato pa smo deparaffinized v ksilenu in rehidrirano skozi postopoma znižuje koncentracije etanola v destilirano vodo. Za pridobivanje antigenov so profili obdelani v predobdelave modulu (Lab Vision Corp., Fremont, CA, USA) v Tris-HCl pufru (pH 8,5) 20 minut pri 98 ° C. Oddelki so obarvane v Autostainer 480 (Lab Vision) s sistemom Dako REAL predstavljate zaznavanja, peroksidaze /DAB +, Rabbit /Mouse (Dako, Glostrup, Danska). Diapozitivi so zdravili 5 minut z 0,3% Dako REAL peroksidaze blokirno raztopino blokirati endogene peroksidaze. Pozneje smo stekelca inkubirali 1 uro s poliklonskimi (redčenje 1: 250 = 2,5 mg /ml) ali monoklonska protitelesa (redčenje 1: 500 = 5 mg /ml) pri sobni temperaturi. Kot pozitivno kontrolo za vsako barvanja seriji smo uporabili vzorce iz ledvičnega tkiva.

Točkovanje radioinkorporacijo

HPA2110 in HES9 immunopositivity je bila ocenjena v vseh razpoložljivih tumorskih jeder. Citoplazme PODXL in HES9 immunopositivity je dosegel kot 0 do 3, ki temelji na intenzivnosti rakave celice radioinkorporacijo, in najvišje število točk od treh jeder služil za nadaljnjo analizo. Negativna radioinkorporacijo je dosegel kot 0, difuzni šibke citoplazemske pozitivnosti kot 1, zmerno pozitivno ali focally močno pozitiven jakost 2, in homogeno močna jakost 3. Vsi vzorci so bili dosegel neodvisno slepo klinično stanje in izidu dveh raziskovalcev (AL in JH) podatkov. Osebki z neharmoničnega rezultati so bili ponovno oceniti, in rezultat konsenza služil za nadaljnjo analizo. Nam je uspelo obdelati in rezultat HPA2110 obarvanje v 266 in HES9 obarvane v 279 vzorcih.

Statistična analiza

zvez med HPA2110 in HES9 pozitivnosti in clinicopathologic spremenljivk so bile ocenjene s testom hi-kvadrat ali Fisherjev natančni preizkus. Korelacije med obema podocalyxin protiteles so ocenili s testom Spearmanu korelacije. preživetje bolezen specifična bila izračunana od datuma operacije do smrti zaradi raka želodca.

Preživetje krivulje so bili zgrajeni po metodi Kaplan-Meier, in v primerjavi s testom Logrank. Za univariablinega in multivariabilnega analizi preživetja, je imel sorazmeren vzorec nevarnost Cox je začel naslednji spremenljivki: starost, spol, stopnja, razred, klasifikacija Laurens, velikost tumorja, lokacija tumorja, PODXL izraz določi HPA2110 barvanjem in HES9 barvanjem, DNA ploidnostjo, S- faza del, Ki-67 izraz, in p53 izraz. Stage, razred, klasifikacija Laurens, velikost tumorja, DNA ploidija, S-faza del in izraz PODXL, HES9, Ki-67, in p53 so vnesena kot kategoričnih spremenljivk. DNK ploidija in S-faza frakcija je bila prej ocenjena s pretočno citometrijo in p53 in Ki-67 tkivo izraz z imunohistokemijo [19,20]. A p-vrednost < 0,05 štelo statistično značilne. Vse statistične analize so bile izvedene z IBM SPSS Statistics različice 20,0 za Mac (IBM Corporation, Armonka, NY, ZDA).

Rezultati

Imunohistokemija

citoplazme HPA2110 reaktivnost, ovrednotena v 266 primerih je bil negativen v 113 (42,5%), šibko pozitiven v 120 (45,1%), zmerno pozitivna v 29 (10,9%), in močno pozitiven v 4 (1,5%) primerih. Od 279 primerov uspešno, obarvanih za citoplazemske izražanja, ki ga HES9 je bilo 67 (24,0%) negativnih, 137 (49,1%), rahlo pozitiven, 54 (19,4%) zmerno pozitivna, in 21 (7,5%), zelo pozitiven. V končni fazi, šibka močno pozitivno HPA2110 in HES9 radioinkorporacijo (rezultati 1-3) je bil obravnavati kot pozitiven izražanja. Reprezentativni slike immunostainings so na sliki 1. Oba HPA2110 in HES9 obarvajo enakomerno po vsej citoplazmi, z jedrskimi ali mobilni membranskih immunopositivity opazen. Citoplazemski izraz podocalyxin ga dva različna protitelesa HPA2110 in HES9 korelacija (r _{s = 0,455, p < 0,001, Spearman je preizkus korelacije mesto).}

Združenje HPA2110 in HES-9 z clinicopathological spremenljivk in biomarkerjev

združenja HPA2110 in HES9 z clinicopathological spremenljivk in molekularnih biomarkerjev so bili naslednji: pozitivno (rezultati 1-3) HPA2110 obarvanje bili povezani s črevesno vrsto raka (p < 0,001), pozitivno HES9 obarvanje je bilo povezano z starost nad 66 (p = 0,001), z raka na debelem črevesu (p < 0,001), in z majhno (≤ 5 cm) velikost tumorja (p = 0,024). Tako HPA2110 in HES9 bile povezane z visokim S-fazo frakcije (SPF, p = 0.022; p = 0,010) in visok indeks širjenje tumorja (Ki-67, p = 0.003; p = 0,001) (tabeli 1 in 2).

Survival analize

Pozitivna HPA2110 izraz kaže na raka, posebno želodca 5-letno preživetje 24% (95% iZ 16,9-31,1), v primerjavi z bolniki z negativnim HPA2110 barvanjem s 5-letno preživetje 43% (95% iZ 33,7-52,9) (p = 0,001 test log-rank) (slika 2 in tabela 3). rak specifične želodčni 5-letno preživetje bolnikov z HES9-pozitivne tumorske obarva je bila 30% (95% IZ 23,1-36,1), in za tiste z negativno obarvanje, 40% (95% IZ 27,7-52,1; p = 0,130 log -rank test) (slika 2).

pri analizi podskupin je bil HPA2110 pomemben označevalec slabo prognozo v skupinah mlajših bolnikih (starih pod 66 let), (p = 0,006), in za moškega spola (p = 0,002), razširjen tip raka (p = 0,001) in fazi I bolnikov (p = 0,048) (slika 3 in tabela 3). V drugi podskupini študiral, HPA2110 ni služil kot prognostični označevalec

Izraz HPA2110 ostala pomembna multivariabilnega analizi. (HR = 3,17, 95% IZ 1,37-7,34; p = 0,007; preglednica 4). Drugi neodvisni napovedni dejavniki v multivariabilnega analize so oder, razred, in DNA ploidija.

Pogovor

Pokazali smo tu, da je bil rak specifični 5-letno preživetje bistveno boljši pri bolnikih želodca z rakom, ki imajo PODXL -negativno tumor. Pravzaprav je med fazo 1 bolnikov z PODXL-negativnimi tumorji, samo en bolnik je umrl zaradi raka. V multivariabilnega analizi, pozitiven PODXL izraz služil kot samostojna označevalec slabo prognozo. Pozitivna PODXL izraz tako s poliklonskega HPA2110 protiteles in monoklonskih protiteles HES9 je bila povezana z visokim zaščitnim faktorjem s pretočno citometrijo in Ki-67 barvanjem, oboje označevalcev visoke širjenja rakavih celic in s tem slabše prognoze.

Positive izraz PODXL obeh protiteles je bil povezan s črevesno vrste raka, ampak PODXL negativni tumor izkazalo, da je prognostični dvojno podajo v raka na debelem črevesu. Nasprotno pa je bil rak posebne 5-letno preživetje v podskupini razpršenega raka tipa bistveno slabši za bolnike z PODXL pozitivnih tumorja. Na splošno je bila difuzna rak tip povezana s slabšo prognozo kot ima vrsto črevesja [21].

Kolikor nam je znano, smo najprej prijaviti napovedno vrednost za PODXL raka želodca. To je razvidno iz več drugih vrstah raka, na primer raka dojke [6], prostate [8], jajčnikov [9], kolorektalnega [10-12], urotelijskim mehurja [13], trebušne [14] in rak periampullary [15] . Študija o kolorektalnega raka kažejo soglasju med primarnih tumorjev in ustreznih vozlišč metastaz limfnih v posameznih bolnikov in PODXL izraza tudi ne vpliva, ki ga neoadjuvantno radioterapijo. Te ugotovitve podpirajo klinično koristnost PODXL kot označevalec slabo prognozo [22]. Tu ni proučeval PODXL izraz v bezgavkah na raka želodca, in nobeden od bolnikov v tej kohorti prejeli preoperativno kemoterapijo, čeprav je trenutno dokaj rutinski. Ti učinki predoperativno kemoterapijo na PODXL izražanja v raka želodca je potrebno nadaljnje vrednotenje.

Uporabili smo dva protiteles je priznal PODXL, komercialno dostopno poliklonalno HPA2110 protiteles in-house monoklonsko protitelo HES9 [16]. Immunoexpression ga HES9 monoklonsko protitelo bila močnejša kot v poliklonskega protitelesa. Oba protitelesa obarvajo enakomerno skozi citoplazmo in ne obarvajo jedra niti celične membrane. Raznolikost v barvanja intenzivnosti in distribucijo je premajhno pri uporabi poliklonsko protitelo, zaradi česar je sedaj veliko težje. V bistvu PODXL je transmembranski molekula, zato je presenetljivo, da ga ni najti na celičnih membran v želodcu rakavih celic, ki jih bodisi protitelesa. Pomen citoplazme, non-membranska, izraz PODXL, njene vloge in funkcije, potrebujejo nadaljnje vrednotenje.

Te različne protitelesa smo uporabili prepoznati neenake dele molekule PODXL, verjetno pojasnjuje, zakaj je njihovo izražanje v nekaterih izmed vzorci razlikujejo in rezultati niso bili enaki. Kaprio sod. [16], ki se uporablja ta ista protitelesa v kolorektalnega raka, in našel zanimivo razliko med vzorci barvanja. Poliklonski pozitivnost protiteles je membranska [9,10], vendar pa je monoklonsko protitelo pozitivnost razvidno predvsem v citoplazmi. V kolorektalnega raka, močna pozitivnost tako z monoklonskih in poliklonskega protitelesa pokazala podskupino bolnikov s še slabše preživetje. Nismo našli takšne korelacije v vzorcih raka želodca. Na splošno je bilo pozitivnost pri bolnikih z rakom želodca nižja kot pri bolnikih z rakom debelega črevesa. V kolorektalnega raka je bilo okoli 94% primerov pozitivna PODXL teh dveh protiteles, medtem ko je v želodčnem pozitivnosti raka pojavil v 76% primerov pri monoklonsko protitelo in v 58% z poliklonskega protitelesa. Pogostost PODXL pozitivnosti pri raku želodca je blizu tistemu za raka dojke in jajčnikov (40% in 67%) [6,9].

PODXL je transmembranski glikoprotein. Dokazano je, da MUCINS, ki so prav tako glikoproteini, igrajo vlogo pri epitelnih do mezenhimskega prehoda (EMT) [23,24]. Vloga PODXL pri raku ni znan, vendar pa je mogoče predvidevati, da lahko PODXL imajo tudi vlogo pri EMT. EMT lahko pojasni, zakaj imajo bolniki z visokim izražanja PODXL slabše preživetje.

Moč te študije je velika kohorte bolnika z rakom želodca in dolgo spremljanju z zanesljivo kliničnega spremljanja časa in podatkov o preživetju. S tehniko TMA le majhne površine tumorja ovrednotili glede na odsekih celotnega tkiva. V debelega črevesa in danke, Larsson et al. [22] ugotovljeno, da uporaba celih odsekov dovoljena identifikacijo večjega števila tumorjev kot PODXL pozitivni kot niti TMA analizo. Ker PODXL izraz je raznolika, lahko uporaba tehnike TMA vodi k podcenjevanju pozitivnih primerov. Točkovanje tako monoklonskih protiteles in izražanja poliklonalni protiteles je pri nekaterih osebkov težkih; primeri z le nekaj rakavih celic in tiste, pri katerih je bila vrednost rakavih celic nedoločljivo so bili tako izključeni iz analize. To deloma pojasnjuje veliko število izključenih primerov. Po drugi strani pa TMA tehnika omogoča analizo velikih skupin bolnikov z metodo homogeno barvanja.

Na koncu PODXL imunskim barvanjem služi kot samostojna označevalec slabo prognozo raka želodca. To je, da naše znanje, prvo poročilo o prognostično vrednost PODXL izražanja raka želodca. Nadaljnje študije bi morala potrditi te povezave in reševanje mehanizme, s katerimi PODXL vpliva na razvoj in obnašanje raka želodca.

Priznanja

Zahvaljujemo Päivi Peltokangas in Elina Aspiala za odlično tehnično pomoč.

• Vrste raka na želodcu
• Plos ONE: DBGC: Database človeške želodčne raka