PLoS ONE: Overekspression og biologiske funktion af Ubiquitin-Specifik Protease 42 i Gastric Cancer

Abstrakt

Ubiquitin-specifik protease 42 (USP42) er medlem af afubiquitinerende enzymer (DUBs). Ændringerne af DUBs er impliceret i patogenesen af ​​en lang række tumorer. Men der er få undersøgelser om ekspressionen og biologiske funktion af USP42 i gastrisk cancer (GC). Her, ekspressionsniveauerne af USP42 var signifikant højere i GC væv end i ikke-tumor-væv. USP42 ekspression blev signifikant korreleret med tumorstørrelse, TNM stadie, lymfeknudemetastase og samlet overlevelse af patienter med GC. Desuden USP42 tavshed i to GC cellelinjer, AGS og MKN-45, især hæmmet celleproliferation, men stimulerede G1 fase anholdelse. Proteinerne fremmer cellecyklusprogression (cyclin D1, Cyclin E1 og PCNA) blev nedreguleret i USP42 undertrykt celler. Endvidere inhibering af USP42 i GC-celler nedsat celleinvasion via påvirke ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP'er) og epitel-mesenchymale overgang (EMT) regulatorer. Afslutningsvis kunne USP42 overekspression være en potentiel prognostisk markør for GC, regulerer overlevelse og invasive egenskaber af GC, og kan repræsentere en ny terapeutisk molekylær mål for denne tumor

Henvisning:. Hou K, Zhu Z, Wang Y, Zhang C, Yu S, Zhu Q, et al. (2016) Overekspression og biologiske funktion Ubiquitin-Specifik Protease 42 i Gastric Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10,1371 /journal.pone.0152997

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: December 29, 2015; Accepteret: 22 marts 2016; Udgivet: Marts 31, 2016

Copyright: © 2016 Hou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af videnskabelig forskning projekt af Shanghai Municipal Kommissionen for sundhed og familieplanlægning (20124321)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

mavekræft (GC) er den femte mest almindelige kræftform [1] og den tredje hyppigste årsag til kræft død [2]. I øjeblikket kendte betydende risikofaktorer for GC omfatter Helicobacter pylori (H. pylori) infektion, levende miljø, kost, genetiske og immune faktorer, og kroniske mave sygdomme [3]. Prognosen blandt patienter med GC er generelt ringe, fordi tumoren ofte har metastaseret og de fleste patienter er ældre (median alder er over 70 år) på det tidspunkt den er diagnosticeret. Den 5-årige overlevelsesrate for GC er rapporteret at være mindre end 25% [4]. Det er af stor klinisk betydning at identificere følsomme diagnostiske og prognostiske markører for GC, undersøge molekylære mekanismer i GC udvikling, og udforske nye terapi mål af denne sygdom.

Ubiquitin-specifik protease 42 (USP42) er en afubiquitinerende enzym (DUB), der er bredt udtrykt i forskellige humane væv [5]. Ubiquitinering, en reversibel posttranslationel modifikation, er involveret i flere cellulære processer, såsom cellecyklus, DNA-reparation og apoptose [6, 7]. Stigende bevis har vist, at ændret DUB funktion er impliceret i patogenesen af ​​en lang række tumorer [8]. Overekspression af USP9X, USP9Y, USP10 og USP25 blev afsløret i brystcancer ved todimensional polyacrylamidgelelektroforese og proteomics analyse [9]. Enkelte undersøgelser har vist, at USP22 overekspression fremmet kræft progression og dårlig prognose for gliom, bugspytkirtelkræft, livmoderhalskræft og lungekræft [10-13]. USP42 har tidligere vist sig at omarrangeres i akut myeloid leukæmi [14]. Men så vidt vi ved, ingen undersøgelse er blevet udført på ekspressionsmønsteret og biologiske funktioner af USP42 i GC.

I den foreliggende undersøgelse, USP42 mRNA-niveauer i GC væv blev fundet at være bemærkelsesværdigt højere til niveauer i kontroller . Yderligere kliniske karakteristika analyse viste, at ekspressionsniveauet af USP42 var forbundet med overordnet overlevelse på GC patienter. Vi anvendte derefter RNA-interferens (RNAi) teknologi til at banke ned udtryk for USP42 i to GC cellelinier (AGS og MKN-45 celler), og undersøgte spredning, cellecyklus og invasive kapacitet i begge cellelinier. Vores data tyder på, at USP42 er en potent onkogen i GC, give os med en fremtidig mål for GC terapi.

Materialer og metoder

Vævsprøver

I alt 90 GC patienter, der gennemgår kirurgi ved Institut for Almen kirurgi, blev Folkets Hospital, Pudong New District (Shanghai, Kina) fra februar 2007 og juni 2009 indskrevet i denne undersøgelse. Den mediane alder af patienterne var 56 år (spændvidde: 34-68 år). Alle patienter fik skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af uafhængige etiske komité af Shanghai Pudong District Folkets Hospital (Shanghai, Kina). Tumor vævsprøver blev opnået fra alle GC patienter. I mellemtiden, 42 matchede ikke-tumorform prøver placeret > 3 cm fra tumoren blev indsamlet. Alle kirurgiske prøver blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart efter kirurgisk resektion, og opbevares ved -80 ° C indtil RNA ekstraktion.

Cellelinjer

De cellelinier fra humant mavekræft, herunder AGS, SGC-7901, blev BGC-823, MKN-28 og MKN-45 opnået fra Institut for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO _2.

Silencing af USP42 af små interfererende RNA (siRNA)

siRNA specifikt for humant USP42 (5'-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 ') blev udvalgt. En ikke-specifik scramble siRNA-sekvens (sinc) blev anvendt som negativ kontrol. De siRNA'er blev transient transficeret ind AGS eller MKN-45 celler under anvendelse lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Assays blev udført 48 timer efter transfektion.

Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Revers transkription blev udført med tilfældige hexamere primere og en SuperScript revers transkriptase-kit (Invitrogen). Det resulterende cDNA blev anvendt som template til realtids-PCR udføres med en standard SYBR Green PCR-kittet (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) på ABI7300 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) thermocycler. GAPDH blev anvendt som kontrol af input RNA-niveauet. Alle reaktioner blev udført ved anvendelse af følgende cyklusparametre, 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 45 s. At verificere specifikt produkt amplifikation blev produkterne derefter underkastet dissociationskurve analyse. Genekspressionen blev beregnet under anvendelse af Δ Ct-metoden. Alle data repræsenterer gennemsnittet af tre gentagelser. Sekvenserne af specifikke primere var som følger: USP42 mRNA fremadrettet, 5'-ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 ', og USP42 mRNA-revers, 5'ACGCAGATTGGAACAGAG-3'; GAPDH mRNA fremadrettet, 5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ', og GAPDH mRNA omvendt, 5'CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'.

Antistoffer og Western blotting

Antistoffer mod CyclinD1, E-cadherin, β catenin, Snail1 og GAPDH blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antistoffer mod USP42, CyclinE1, PCNA, og MMP-9 var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-MMP-2 var fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer var fra Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kina). Salg

Celler blev vasket tre gange med PBS og derefter lyseret i forvejen afkølet radioimmunudfældning (RIPA) assaybuffer på is i 10 min. Efter fjernelse af cellerester ved centrifugering (12.000 g, 10 min), proteinkoncentration på supernatanter blev målt ved BCA-proteinassay-kit (Thermo Fisher Scientific). Efter kogning i 5 minutter i prøvepuffer blev lige så stor mængde af proteiner af forskellige grupper separeret ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Millipore, Bredford, USA). Efter blokering med 5% skummetmælk, blev membranerne inkuberet med de primære antistoffer ved 4 ° C natten over under omrøring, efterfulgt af inkubation med tilsvarende sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur med omrøring. Reaktivt protein blev derefter detekteret under anvendelse af ECL chemiluminescens systemet (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Celleproliferation assayet ved CCK-8

CCK-8 assay blev udført ved standardmetoder i skåle med 96 brønde. Kort fortalt, 3 × 10 ^{3-celler blev podet per brønd. Ved angivne tidspunkt blev CCK-8-opløsning (10 pi i 100 pi RPMI-1640-medium) til hver brønd og inkuberet i 1 time. Absorbansen ved 450 nm blev detekteret ved hjælp af en mikropladelæser.}

In vivo tumor bærende nøgne mus model

Dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Animal Care og brug Udvalg af Shanghai Pudong District Folkets Hospital (Shanghai, Kina). Tolv BALB /c nøgne mus i alderen 4-5 uger gamle (SLAC Animal, Shanghai, Kina) blev opretholdt under specifikke patogenfrie betingelser under anvendelse af en laminar luftstrøm rack og havde kontinuerlig fri adgang til steriliseret mad og autoklaveres vand. Eksperimenter blev startet efter 1 uges akklimatisering. AGS celler (2 x 10 ^{6) blev subkutant injiceret i den højre flanke af nøgne mus for at etablere xenotransplantat tumorbærende model. Ti dage efter subkutan injektion blev musene tilfældigt inddelt i to grupper (n = 6 /gruppe) og IV injiceret med USP42 siRNA eller sinc holdige formuleringer to gange om ugen. Den korteste og længste diameter af tumoren blev målt med passere ved 4 dages mellemrum, og tumor volumen (mm 3) blev beregnet ved hjælp af følgende standard formel: (den korteste diameter) 2 × (den længste diameter ) × 0,5. 36 dage efter tumor placering blev musene aflivet ved cervikal dislokation, og tumorerne blev udvundet. De våde vægte af hver tumor blev undersøgt. Under forsøget blev alle musene overvåget hver dag. Nr mus døde før den eksperimentelle endpoint.}

Cellecyklusanalyse

Celler blev trypsinbehandlet, vasket to gange i PBS og fikseret natten over ved 4 ° C i iskold 70% ethanol. Cellerne blev derefter vasket to gange i PBS og inkuberet i propidiumiodid (PI) farvning buffer (5 pg /ml PI og 0,25 mg /ml RNase, Sigma, St. Louis, MO, USA) ved stuetemperatur i 30 min. Celler blev derefter analyseret ved anvendelse af en anvendelse af et FACScan flow-cytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Procentdelen af ​​celler i G0 /G1, S og G2 /M fase blev bestemt ved PI farvning.

Cell invasion analyser

For at måle cellens invasive potentiale af celler, blev Transwell analyser udført ved hjælp en Matrigelcoatede Boyden kammer (BD Biosciences). Celler blev serum-udsultet natten over, høstet og resuspenderet i serum-frit medium. Celler (1 x 10 ^{5) blev derefter tilsat til det øvre kammer. Medium indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Efter at cellerne var inkuberet ved 37 ° C i 24 timer blev cellerne på den øvre overflade af membranen fuldstændigt fjernes med vatpind. De vandrende celler fastgjort til den nedre overflade blev fikseret i 4% paraformaldehyd og farves med 0,5% krystalviolet. Antallet af migrerede celler på den nedre overflade af membranen blev talt under et mikroskop i fem områder på 100 ×.}

Bioinformatik analyse

mavekræft datasæt blev hentet fra NCBI Gene Expression Omnibus database (Adgang ID: GSE26253) og The Cancer Genome Atlas (TCGA). For yderligere at undersøge de biologiske veje involveret i gastrisk kræft patogenese gennem USP42 vej, Gene sæt berigelse analyse (GSEA) blev udført ved hjælp af den offentligt tilgængelige software fra de overordnede Institut ved MIT (http://www.broad.mit.edu/gsea/software /software_index.html) som tidligere beskrevet [15]. For hvert gen sæt, GSEA definerer en berigelse score (ES), hvilket afspejler sammenhængen mellem genet sæt og prøven.

Statistisk analyse

Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført ved hjælp af MedCalc ( Mariakerke, Belgien). Det statistiske Package for Social Sciences (SPSS) version 17,0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til den anden statistisk analyse. Resultater af eksperimenter er udtrykt som middelværdi ± SD. Students t-test blev anvendt til at sammenligne værdierne af test- og kontrolprøver. Chi-square test blev anvendt til at identificere forskelle mellem kategoriske variable. Statistisk signifikante forskelle blev defineret som havende en P
. ≪ 0,05

Resultater

Angivelse af USP42 i mavekræft

At udforske udtryk for USP42 i GC, udførte vi real-time PCR-analyse på GC (n = 90) og noncancerous vævsprøver (n = 42). Den relative ekspression af USP42 mRNA sammenlignet med GAPDH blev beregnet ved anvendelse △ Ct-metoden. Det er klart, USP42 mRNA-ekspression var højere i GC væv end i noncancerous væv (Fig 1A). For yderligere at verificere dette fund, vi re-analyseret microarray data fra TCGA uafhængige GC datasæt. Fig 1B viste indlysende overekspression af USP42 i humane GC væv i forhold til normale væv.

Brug af middelværdien af ​​2 ^{-ΔCt (0.550) som en cut-off mellem lavt niveau og højt niveau USP42 mRNA-ekspression, blev 90 patienter klassificeret i lave (< 0,550) og høje USP42 udtryk undergrupper (≥0.550). Som vist i tabel 1 blev USP42 signifikant associeret med tumorstørrelse ( P
= 0,0328), TNM stadie ( P
= 0,0059) og lymfeknudemetastaser ( P
= 0,0184). Men der var ingen signifikant sammenhæng mellem UP42 udtryk og andre patientkarakteristika, herunder patienternes køn og alder ved diagnose og tumor placering. Kaplan-Meier overlevelse analyse afslørede, at den samlede overlevelse var signifikant kortere hos patienter med højere USP42 ekspression end hos patienter med lavere USP42 ekspression (Fig 1C, P < 0,05), der blev yderligere bekræftet ved overlevelse analyse på ArrayExpress datasæt (Access id : GSE26253, fig 1D)}

USP42 siRNA undertrykt USP42 ekspression

Sammenligning af forskellige gastriske cancercellelinier vist, at ekspressionsniveauet af USP42 protein i AGS og MKN-45-celler er højere end det. af SGC-7901, BGC-823 og MKN-28-celler (fig 2A). Derfor AGS og MKN-45-celler blev valgt til efterfølgende eksperimenter. At udforske funktioner USP42 på GC, vi banke skudt ned USP42 udtryk i GC cellelinier ved siRNA transfektion. Som vist i fig 2B, siRNA specifikt for USP42 markant undertrykt USP42 ekspression i AGS og MKN-45-celler med en suppression ratio på 60,4% og 74,4%, henholdsvis. Vi analyserede derefter, om undertrykkelse af USP42 udtryk ville ændre væksten i GC celler. Som vist i fig 2C, var der en signifikant nedgang i vækst i USP42 undertrykt celler sammenlignet med de sinc-transficerede celler.

USP42 siRNA undertrykte tumorvækst i nøgne mus Salg

For at bestemme virkningen af ​​USP42 siRNA på tumorigenicitet in vivo, var lig antal AGS celler injiceret subkutant i nøgne mus og USP42-siRNA var IV injiceret efter tumordannelse. Tumor vækst i mus injiceret med USP42-siRNA var signifikant langsommere end for mus injiceret med kontrol siRNA (Fig 3A). Mængden og vægten af ​​USP42-siRNA tumorer var mindre end 25%, at af kontrol tumorer (Fig 3B). Yderligere sammenlignet med kontrol tumorer, USP42 og PCNA blev signifikant reduceret i tumorer med USP42-siRNA injektion (fig 3C).

Induceret G0 /G1 fasen anholdelse i USP42-undertrykte cancerceller

Til finde ud af, hvordan højere USP42 udtryk påvirket GC celleproliferation, vi udførte Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) om TCGA datasæt ved at analysere forholdet mellem USP42 udtryk og gener i Kyoto encyklopædi af gener og genomer (Kegg) cellecyklus pathway. Interessant, fandt vi, at højere USP42 udtryk var positivt korreleret med Kegg cellecyklus vej hos GC patienter baseret på TCGA datasæt (Fig 4A). Vi analyserede derefter cellecyklus distribution af GC celler med USP42 knockdown. Undertrykkelse USP42 udtryk reducerede S fasen cellepopulationen og førte til G1 anholdelse i AGS og MKN-45-celler (Fig 4B). For yderligere at undersøge cellulære mekanisme bag USP42-induceret celleproliferation blev proteinniveauer af cellecyklusproteiner vurderes. USP42 knockdown reducerede signifikant ekspression af cyclin D1, Cyclin E1 og PCNA (Fig 4C). Således afslørede, disse resultater, at et fald i niveauet af USP42 ekspression inhiberes cyclin D1, Cyclin E1 og PCNA-ekspression i GC-celler, som kan inducere G0 /G1 fasen, markant nedgang i antallet af S-fase celler og inhiberer celleproliferation.

lav invasive potentiale USP42-undertrykte kræftceller

GSEA anførte også, at USP42 udtryk var positivt korreleret med metastaser (fig 5A). At verificere disse resultater i et in vitro assay undersøgte vi invasive potentiale af USP42 undertrykt celler under anvendelse af et in vitro Matrigel invasion assay (Fig 5B). De USP42-undertrykte celler udviste signifikant mindre invasiv potentiale end sinc-transficerede celler ( P
< 0,01)., Hvilket antyder, at høj ekspression af USP42 forbedret tumorindtrængen

Nedbrydning af den ekstracellulære matrix gennem matrixmetalloproteinaser (MMP'er), er en kritisk proces under celleinvasion [16]. Som vist i fig 5C, nedregulering af USP42 nedreguleret ekspression af MMP-2 og MMP-9.

Endvidere protein niveauer af epitel-mesenchymal overgang (EMT) pathway regulatorer, som er tæt knyttet til metastase af tumorceller, blev analyseret ved Western blot (fig 5D). Transfektion af USP42 siRNA væsentligt reduceret ekspressionsniveauerne af β-catenin, Twist og Snail1, samtidig øge E-cadherin.

Diskussion

Flere medlemmer af DUB familien er kendt for at bidrage til carcinogenese, herunder USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] og USP22 [10-12, 21], mens andre DUBs er nedreguleret i humane kræftformer, herunder USP10 [22] og BAP1 [23]. Men lidt om udtrykket mønster og biologiske funktioner USP42, en DUB for p53 [24] og histon H2B [25], i humane kræftformer. I vores undersøgelse viste vi for første gang, at GC væv udtrykker høje niveauer af USP42 mRNA sammenlignet med tilsvarende ikke-tumor-væv. Desuden blev USP42 ekspression forbundet med tumorstørrelse, TNM stadie, lymfeknudemetastase og samlet overlevelse af GC patienter (Fig 1). Vores resultater gav værdifulde oplysninger for den kliniske resultat forudsigelse af patienter med GC.

Vi formodede, at USP42 kan virke som et onkogen faktor under GC udvikling. Vi anvendte derefter RNAi-teknologi, som er meget udbredt i kræftforskning eller kræftbehandling, at vælte USP42 udtryk i to GC cellelinier (figur 2B). Sænkning USP42 ekspression effektivt formindsket cancercelleproliferation in vitro (fig 2C) og in vivo
(figur 3). GSEA data viste sammenslutningen af ​​cellecyklus vej med USP42 udtryk (figur 4A). Vi anvendte derefter et celle-cyklus-analyse ved FACS (Fig 4B) og ekspression analyse af cyclin D1, cyclin E og PCNA ved Western blot (Fig 4C). Vores data viste, at USP42 siRNA havde en hæmmende virkning på GC cellevækst via fremkalde G0 /G1 anholdelse.

GC er en af ​​de mest almindelige kræftformer og fortsatte med at være et alvorligt problem for folkesundheden i verden. Høj forekomst af metastaser er stadig en af ​​de vigtigste årsager til den dårlige overlevelse GC patienter [4]. GSEA på TCGA datasæt afslørede sammenslutning af metastaser vej med USP42 udtryk i GC (Fig 5A). Yderligere in vitro invasion assay påpegede, at USP42 knockdown faldt den invasive evne immortaliserede GC cellelinier (fig 5B). Således er vores data viste, at forhøjet ekspression af USP42 i GC kan fremme tumormetastase og er forbundet med det kliniske resultat af GC patienter. Dernæst forsøgte vi at udforske de underliggende mekanismer ved at vurdere ekspressionen af ​​MMP'er og EMT regulatorer i USP42-undertrykte cancerceller. MMP-2 [26] og MMP-9 [27] vides at mediere nedbrydningen af ​​den ekstracellulære matrix og er relateret med lymfeknude-metastase af GC. EMT er involveret i komplekse patogenesen af ​​tumorer [28]. Her, silencing af USP42 inducerede ekspressionen af ​​den vigtigste faktor af EMT (E-cadherin), men faldt ekspressionen af ​​MMP'er og tre kendte induktorer af EMT (β-catenin, Twist og Snail1) (Fig 5C og 5D). Disse opdagelser foreslog rolle USP42 som en invasion promotor gen via påvirker ekspressionen af ​​MMP'er og EMT regulatorer, selv om yderligere undersøgelser er nødvendige for at klarlægge de præcise mekanismer.

Sammenfattende nærværende undersøgelse viste, at USP42 udtryk var steg betydeligt i GC væv. Den forøgede USP42 ekspression kan være vigtigt for tumorudvikling og metastase af GC, og kan tjene som en prognostisk markør for denne sygdom. Vores in vitro resultater viste, at lukke munden af ​​USP42 hæmmede celledeling via fremkalde G0 /G1 anholdelse og undertrykt celle invasion via MMP'er og EMT regulatorer. Således kan USP42 være en roman terapeutisk molekylær mål for GC.

Tak

Denne undersøgelse blev støttet af videnskabelig forskning projekt af Shanghai Municipal Kommissionen for sundhed og familieplanlægning (20.124.321).

• PLoS ONE: beskyttende rolle af Helicobacter pylori infektion i Prognose for Gastric Cancer: Beviser fra 2454 patienter med gastrisk Cancer
• PLoS ONE: Cirkulerende MicroRNA-26a i plasma og dens potentiale diagnostisk værdi i Gastric Cancer