PLoS ONE: overexpressie en biologische functie van ubichitinespecifieke Protease 42 bij maagkanker

Abstract

ubichitinespecifieke protease 42 (USP42) is een lid van ubiquitinerings enzymen (Dubs). De veranderingen van Kopieën zijn betrokken bij de pathogenese van diverse tumoren. Er zijn echter weinig studies over de expressie en biologische functie van USP42 bij maagkanker (GC). Hier, de expressieniveaus van USP42 waren GC weefsels significant hoger dan in niet-tumor weefsels. USP42 expressie was significant gecorreleerd met tumorgrootte TNM, lymfeklier en totale overleving van patiënten met GC. Bovendien USP42 zwijgen in twee GC cellijnen, AGS en MKN-45, met name remden celproliferatie, maar gestimuleerd G1 fase-arrest. De eiwitten bevorderen van voortgang van de celcyclus (Cycline D1, E1 en Cycline PCNA) werden down-gereguleerd in-USP42 onderdrukte cellen. Bovendien, remming van USP42 in GC cellen aangetast cel invasie via die de expressie van matrix metalloproteinases (MMP) en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) toezichthouders. Concluderend kan USP42 overexpressie potentiële prognostische marker voor GC zijn, regelen de overleving en invasieve eigenschappen van GC, en kan een nieuw therapeutisch doelwit vormen voor deze tumor

Citation. Hou K, Zhu Z, Wang Y, Zhang C, Yu S, Q Zhu, et al. (2016) overexpressie en biologische functie van ubichitinespecifieke Protease 42 bij maagkanker. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10.1371 /journal.pone.0152997

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, de Republiek Korea

Ontvangen: 29 december 2015; Aanvaard: 22 maart 2016; Gepubliceerd: 31 maart 2016

Copyright: © 2016 Hou et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. Alle relevante gegevens binnen het papier

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door wetenschappelijk onderzoek van Shanghai Gemeentelijke Commissie voor Gezondheid en Family Planning (20124321)

Competing belangen. de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Introductie

Maagkanker (GC) is de vijfde meest voorkomende vorm van kanker [1] en de derde belangrijke doodsoorzaak kanker [2]. Momenteel bekende belangrijkste risicofactoren voor GC omvatten Helicobacter pylori (H. pylori) infectie, leefomgeving, voeding, genetische en immuun factoren, en chronische maag ziekten [3]. De prognose bij patiënten met GC het algemeen slecht, omdat de tumor vaak is uitgezaaid en de meeste patiënten zijn ouderen (gemiddelde leeftijd 70 jaar) en de tijd die is gediagnosticeerd. De 5-jaars overlevingskans voor GC wordt gemeld minder dan 25% te zijn [4]. Het is van groot klinisch belang om gevoelige diagnostische en prognostische merkers van GC identificeren onderzoeken moleculaire mechanismen van GC ontwikkeling en nieuwe doelwitten therapie van deze ziekte.

ubichitinespecifieke protease 42 (USP42) is een enzym ubiquitinerings (DUB) die op grote schaal tot expressie wordt gebracht in verschillende humane weefsels [5]. Ubiquitinatie, omkeerbare post-translationele modificatie, is betrokken bij verschillende cellulaire processen zoals celcyclus, DNA-reparatie en apoptose [6, 7]. Toenemend bewijs heeft aangetoond dat veranderde DUB functie is betrokken bij de pathogenese van een groot aantal tumoren [8]. Overexpressie van USP9X, USP9Y, USP10 en USP25 werd onthuld in borstkanker door tweedimensionale polyacrylamidegelelektroforese en proteomics analyse [9]. Een aantal studies hebben aangetoond dat USP22 overexpressie bevorderde de progressie van kanker en een slechte prognose van glioom, pancreaskanker, baarmoederhalskanker en longkanker [10-13]. USP42 is eerder gevonden worden herschikt bij acute myeloïde leukemie [14]. Echter, voor zover wij weten, geen onderzoek werd uitgevoerd op het expressiepatroon en biologische functies van USP42 in GC.

In de onderhavige studie, USP42 mRNA niveaus in GC weefsels bleken aanzienlijk hoger te zijn bij controles niveaus . Verdere klinische kenmerken analyse toonde aan dat expressie van USP42 werd geassocieerd met overleving van patiënten GC. We vervolgens toegepast RNA-interferentie (RNAi) technologie voor het neerslaan van de expressie van USP42 in twee GC cellijnen (AGS en MKN-45 cellen), en onderzochten de proliferatie, celcyclus en invasieve capaciteit in beide cellijnen. Onze gegevens suggereren dat USP42 is een krachtige oncogen in GC, bood ons een toekomstig doelwit voor GC therapie.

Materialen en methoden

weefselmonsters

Een totaal van 90 GC patiënten die een chirurgische ingreep op de afdeling Algemene Heelkunde, People's Hospital, Pudong New District (Shanghai, China) tussen februari 2007 en juni 2009 werden geïncludeerd in deze studie. De mediane leeftijd van de patiënten was 56 jaar (bereik: 34-68 jaar). Alle patiënten kregen schriftelijke informed consent. De studie werd goedgekeurd door de onafhankelijke ethische commissie van Shanghai Pudong District People's Hospital (Shanghai, China). Tumor weefselmonsters werden verkregen uit alle GC patiënten. Ondertussen, 42 gekoppeld non-tumor samples gelegen > 3 cm van de tumor werden verzameld. Chirurgische monsters werden bevroren in vloeibare stikstof onmiddellijk na chirurgische resectie, en opgeslagen bij -80 ° C tot RNA-extractie.

Cellijnen

De cellijnen afgeleid van menselijke maagkanker, waaronder AGS, SGC-7901, BGC-823, MKN-28 en MKN-45 werden verkregen van het Instituut voor Biochemie en Celbiologie, de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Alle cellijnen werden in RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO ₂

Silencing van USP42 door kleine interfererende RNA (siRNA)

siRNA specifiek voor humaan USP42 (5'-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 ') werden geselecteerd. Een niet-specifieke scramble siRNA sequentie (sinc) werd gebruikt als negatieve controle. De siRNA's werden tijdelijk getransfecteerd in AGS of MKN-45 cellen met behulp lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Testen werden uitgevoerd 48 uur na transfectie.

Real-time PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp TRIzol Reagent (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. Reverse transcriptiereactie werd uitgevoerd met willekeurige hexameer primers en SuperScript reverse transcriptase kit (Invitrogen). Het verkregen cDNA werd als matrijs voor real-time PCR uitgevoerd met een standaard SYBR Green PCR kit (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) op ABI7300 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) thermal cycler. GAPDH werd als controle van het ingangssignaal RNA niveau. Alle reacties werden uitgevoerd overeenkomstig de volgende cyclusparameters, 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 45 s. Specifieke amplificatie product te verifiëren, werden de producten vervolgens aan dissociatiecurve analyse. Genexpressie werd berekend met de Δ Ct methode. Alle gegevens stellen het gemiddelde van drie herhalingen. De sequenties van de primers waren als volgt: USP42 mRNA voorwaarts, 5'- ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 'en USP42 mRNA-reverse, 5'ACGCAGATTGGAACAGAG-3'; GAPDH mRNA naar voren, 5'CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ', en GAPDH mRNA te keren, 5'CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'.

Antilichamen en Western blotting

Antistoffen tegen CyclinD1, E-cadherine, β catenine, Snail1 en GAPDH werden gekocht bij Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antilichamen tegen USP42, CyclinE1, PCNA en MMP-9 waren afkomstig Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-MMP-2 werd uit Epitomics (Burlingame, CA, USA). Mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen waren afkomstig Beyotime Biotechnology (Shanghai, China).

De cellen werden driemaal gewassen met PBS en vervolgens gelyseerd in voorgekoelde radio-immunoprecipitatie (RIPA) assaybuffer op ijs gedurende 10 min. Na verwijdering van celresten door centrifugeren (12.000 g, 10 min), eiwitconcentratie van de supernatanten werd gemeten door BCA eiwit assay kit (Thermo Fisher Scientific). Na koken gedurende 5 min in monsterbuffer, werden gelijke hoeveelheid eiwitten van verschillende groepen gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht op een nitrocellulose membraan (Millipore, Bredford, USA). Na het blokkeren met 5% magere melk werden de membranen geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 ° C gedurende de nacht onder roeren, gevolgd door incubatie met overeenkomstige secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder roeren. Reactief proteïne werd vervolgens gedetecteerd met behulp ECL chemoluminescentie systeem (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

celproliferatie assay door CCK-8

De CCK-8 assay werd uitgevoerd volgens standaardwerkwijzen in 96-putjes. In het kort, 3 x 10 ^{3 cellen werden per well. Bij bepaalde tijdstip werd CCK-8-oplossing (10 pl in 100 pl RPMI-1640 medium) aan elk putje toegevoegd en geïncubeerd gedurende 1 uur. De absorptie bij 450 nm werd gedetecteerd met behulp van een microplaat reader.}

In vivo tumor dragende muizen naakt model

Animal experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Care en gebruik Comite van Shanghai Pudong District People's Hospital (Shanghai, China). Twaalf BALB /c naakt muizen 4-5 weken oud leeftijd (SLAC Dier, Shanghai, China) werden onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden met behulp van een laminaire luchtstroom rack onderhouden en had voortdurende vrije toegang tot voedsel en gesteriliseerde geautoclaveerd water. Experimenten werden gestart na 1 week van acclimatisatie. AGS cellen (2 x 10 ^{6) werden subcutaan geïnjecteerd in de rechterflank van naakt muizen xenograft tumor dragende model op. Tien dagen na subcutane injectie, werden de muizen willekeurig verdeeld in twee groepen (n = 6 /groep) en IV geïnjecteerd met USP42 siRNA of sinc formuleringen tweemaal per week. De kortste en langste diameter van de tumor werden met calipers op 4 dagen, en tumorvolume (mm 3) werd berekend met de volgende standaardformule: (de kortste diameter) 2 × (de langste diameter ) × 0,5. 36 dagen na tumor plaatsing werden de muizen gedood door cervicale dislocatie en de tumoren werden gewonnen. De natte gewicht van elke tumor werden onderzocht. Tijdens de experimentele procedure werden alle muizen dagelijks gecontroleerd. Geen muizen stierven vóór de experimentele eindpunt.}

celcyclusanalyse

De cellen werden getrypsiniseerd, tweemaal gewassen in PBS en gedurende de nacht gefixeerd bij 4 ° C in ijskoud 70% ethanol. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen in PBS en geïncubeerd in propidiumjodide (PI) kleuring buffer (5 ug /ml PI en 0,25 mg /ml RNase, Sigma, St. Louis, MO, USA) bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Cellen werden vervolgens geanalyseerd met een gebruik van een FACScan stroming cytometrie (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). De percentages van cellen in G0 /G1, S en G2 /M-fase werden bepaald door PI kleuring.

Mobiele invasie assays

Om de cel invasieve potentieel van de cellen te meten, werden Transwell testen gedaan met behulp van a-Matrigel gecoate Boyden kamer (BD Biosciences). Cellen werden serum-uitgehongerd nacht, geoogst, en opnieuw gesuspendeerd in serumvrij medium. Cellen (1 x 10 ^{5) werden vervolgens aan de bovenste kamer toegevoegd. Medium dat 10% FBS werd aan de Tweede Kamer toegevoegd. Nadat de cellen bij 37 ° C gedurende 24 uur werden geïncubeerd, werden de cellen op het bovenste oppervlak van het membraan volledig verwijderd met wattenstaafjes. De migrerende cellen bevestigd aan het onderoppervlak werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gekleurd met 0,5% kristalviolet. Het aantal gemigreerde cellen op het onderoppervlak van het membraan werd geteld onder een microscoop in vijf velden 100 x.}

Bioinformatica analyse

Maagkanker datasets werden gedownload van de NCBI Gene Expression Omnibus databank (Access ID: GSE26253) en The Cancer Genome Atlas (TCGA). Om verder te onderzoeken van de biologische processen die betrokken zijn bij maagkanker pathogenese door middel van USP42 route, Gene ingesteld verrijking analyse (GSEA) werd uitgevoerd met behulp van de algemeen beschikbare software van het Broad Institute aan het MIT (http://www.broad.mit.edu/gsea/software /software_index.html) zoals eerder beschreven [15]. Voor elk gen set, GSEA definieert een verrijking score (ES), die de correlatie tussen het gen set en het monster weerspiegelt.

Statistische analyse

Kaplan-Meier survival analyse werd uitgevoerd met behulp van MedCalc ( Mariakerke, België). Het Statistisch Package for Social Sciences (SPSS) versie 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) werd gebruikt voor de andere statistische analyse. Resultaten van experimenten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Student's t test werd gebruikt om waarden van de test- en controlemonsters vergelijken. Chi-kwadraat test werd gebruikt om de verschillen tussen categorische variabelen identificeren. Statistisch significante verschillen werden gedefinieerd als het hebben van een P
. ≪ 0.05
de expressie van USP42

Resultaten

Expressie van USP42 bij maagkanker

Om te verkennen GC, voerden wij real-time PCR-analyse van GC (n = 90) en goedaardige weefselmonsters (n = 42). De relatieve expressie van USP42 mRNA ten opzichte van GAPDH werden berekend met behulp van de △ Ct methode. Duidelijk, was USP42 mRNA expressie hoger GC weefsels dan in goedaardig weefsel (Figuur 1A). Om deze bevinding verder te verifiëren, we opnieuw geanalyseerd microarray gegevens uit TCGA onafhankelijke GC dataset. Figuur 1B toonde duidelijk overexpressie van USP42 in menselijke weefsels GC ten opzichte van normale weefsels.

Met behulp van de gemiddelde waarde van 2 ^{-ΔCt (0,550) als een cut-off tussen laag- en hoog niveau USP42 mRNA expressie, werden 90 patiënten ingedeeld in laag (< 0,550) en hoge USP42 expressie subgroepen (≥0.550). Zoals getoond in tabel 1, werd USP42 significant geassocieerd met tumorgrootte ( P
= 0,0328), TNM ( P
= 0,0059) en lymfeknoop metastase ( P
= 0,0184). Er was echter geen significant verband tussen UP42 meningsuiting en andere kenmerken van de patiënt, met inbegrip van geslacht en leeftijd van patiënten bij diagnose en tumor locatie. Kaplan-Meier analyse toonde aan dat de totale overleving was significant korter bij patiënten met een hoger USP42 expressie dan bij patiënten met een lagere USP42 expressie (Figuur 1C, P < 0,05), dat verder werd bevestigd door overlevingsanalyse op ArrayExpress dataset (Access id : GSE26253, figuur 1D)}

USP42 USP42 siRNA onderdrukte expressie

Vergelijking van verschillende maagkanker cellijnen aangetoond dat het expressieniveau van USP42 eiwit in AGS en MKN-45 cellen hoger. SGC-7901, BGC-823 en MKN-28 cellen (figuur 2A). Daarom AGS en MKN-45 cellen werden gekozen voor verdere experimenten. Om de functies van USP42 op GC verkennen, kloppen we downed USP42 expressie in GC cellijnen door siRNA transfectie. Zoals getoond in figuur 2B, siRNA specifiek voor USP42 USP42 aanzienlijk onderdrukte expressie in AGS en MKN-45 cellen met een onderdrukking verhouding van 60,4% en 74,4%, respectievelijk. Vervolgens hebben we onderzocht of onderdrukking van USP42 expressie de groei van GC cellen zou veranderen. Zoals getoond in figuur 2C, was er een significante daling van de groeisnelheid van USP42 onderdrukte cellen vergeleken met de sinc-getransfecteerde cellen.

USP42 siRNA onderdrukt tumorgroei in naakt muizen

Bepalen het effect van USP42 siRNA op tumorvorming in vivo, werd gelijk aantal AGS cellen subcutaan geïnjecteerd in naakt muizen en USP42-siRNA was IV geïnjecteerd na tumorvorming. De tumor groei van muizen geïnjecteerd met USP42-siRNA was significant lager dan die van muizen geïnjecteerd met controle siRNA (figuur 3A). De omvang en het gewicht van USP42-siRNA tumoren minder dan 25% van dat van controletumoren (figuur 3B). Verder, in vergelijking met controle tumoren, USP42 en PCNA werden aanzienlijk gedaald in tumoren met USP42-siRNA injectie (figuur 3C).

Induced G0 /G1-fase arrestatie in USP42 onderdrukte kankercellen

Om erachter te komen hoe hoger USP42 expressie beïnvloed proliferatie GC cel, voerden we Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) op TCGA dataset door het analyseren van de relatie van USP42 expressie en genen in Kyoto encyclopedie van genen en genomen (KEGG) celcyclus pathway. Interessant, vonden we dat hogere USP42 expressie was positief gecorreleerd met de KEGG celcyclus route bij patiënten op basis van GC TCGA dataset (Figuur 4A). We vervolgens geanalyseerd celcyclus verdeling van GC cellen met USP42 knockdown. Het onderdrukken van USP42 uitdrukking bracht in de S-fase celpopulatie en heeft geleid tot G1 arrestatie in AGS en MKN-45-cellen (figuur 4B). Het cellulaire mechanisme dat USP42 geïnduceerde celproliferatie verder te onderzoeken, werden de eiwitniveaus van celcyclus eiwitten geëvalueerd. USP42 knockdown verminderde significant de expressie van Cycline D1, E1 en Cycline PCNA (figuur 4C). Aldus zijn deze resultaten bleek dat een afname in het niveau van USP42 expressie geremd Cycline D1, cycline E1 en PCNA expressie in GC cellen die G0 /G1 fase-arrest induceren, kan een aanzienlijke vermindering van het aantal S-fase cellen en remt celproliferatie.

Lage invasieve potentieel van USP42 onderdrukte kankercellen

GSEA ook aangegeven dat USP42 expressie positief is gecorreleerd met metastase (figuur 5A). Deze bevindingen in een in vitro assay te verifiëren, onderzochten we de invasieve potentieel van de USP42 onderdrukte cellen onder toepassing van een in vitro Matrigel invasie assay (figuur 5B). Het USP42 onderdrukte cellen vertoonden significant minder invasief potentieel dan de sinc-getransfecteerde cellen ( P
< 0,01). Dit suggereert dat hoge expressie van USP42 verhoogde tumor invasieve

Afbraak van de extracellulaire matrix door middel van matrix metalloproteïnasen (MMPs), een kritisch proces tijdens celinvasie [16]. Zoals getoond in figuur 5C, silencing van USP42 downgereguleerd de expressie van MMP-2 en MMP-9.

Verder is de eiwitniveaus van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) route regulatoren, die nauw verwant aan metastase van tumorcellen, werden geanalyseerd door Western blot (figuur 5D). Transfectie van siRNA USP42 significant de expressie van β-catenine, Twist en Snail1, terwijl het verhogen van E-cadherine.

Discussie

Verschillende leden van de familie DUB is gekend dat ze kanker, waaronder USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] en USP22 [10-12, 21], terwijl andere Dubs zijn down-gereguleerd in menselijke kankers, waaronder USP10 [22] en BAP1 [23]. Er is echter weinig bekend over het expressiepatroon en biologische functies van USP42, een KOPIE van p53 [24] en histon H2B [25], in menselijke kankers. In onze studie toonden we voor de eerste keer dat GC weefsels tot expressie hoge USP42 mRNA in vergelijking met overeenkomstige niet-tumor weefsels. Bovendien werd USP42 expressie geassocieerd met tumorgrootte TNM, lymfeklier en totale overleving van GC patiënten (Figuur 1). Onze bevindingen waardevolle informatie voor de klinische uitkomst voorspelling van patiënten met GC.

We vermoeden dat USP42 als een oncogene factor kan optreden tijdens de GC ontwikkeling. Vervolgens toegepaste RNAi technologie, die wijd in kankeronderzoek of kankertherapie te slopen USP42 expressie in twee GC cellijnen (figuur 2B). Het verlagen van USP42 uitdrukking effectief verminderde groei van kankercellen in vitro (figuur 2C) en In vivo
(Figuur 3). GSEA gegevens bleek de associatie van de celcyclus pathway met USP42 expressie (figuur 4A). Vervolgens hebben we toegepast een cel-cyclus analyse door middel van FACS (Figuur 4B) en expressie analyse van Cycline D1, Cycline E en PCNA door western blot (figuur 4C). Onze gegevens blijkt dat USP42 siRNA een remmend effect op GC celgroei hadden via induceren G0 /G1 arrest.

GC is een van de meest voorkomende kankers en bleef een belangrijke doodsoorzaak in de wereld. Hoge incidentie van metastase is nog steeds een van de belangrijkste oorzaken van de slechte overleving van patiënten GC [4]. GSEA op TCGA dataset bleek de associatie van metastase traject met USP42 expressie in GC (figuur 5A). Verder, in vitro invasie test wees erop dat USP42 knock-down daalde het invasieve vermogen van onsterfelijk GC cellijnen (figuur 5B). Aldus onze gegevens blijkt dat verhoogde expressie van USP42 in GC tumormetastase kunnen bevorderen en wordt geassocieerd met het klinische verloop van GC patiënten. Vervolgens hebben we geprobeerd om de onderliggende mechanismen te verkennen door het evalueren van de expressie van MMP's en EMT toezichthouders in USP42 onderdrukte kankercellen. MMP-2 [26] en MMP-9 [27] is bekend dat de afbraak van de extracellulaire matrix mediëren en zijn geassocieerd met lymfeknoop metastase van GC. EMT is betrokken bij complexe pathogenese van tumoren [28]. Hier silencing van USP42 induceerde de expressie van de belangrijkste factor EMT (E-cadherine), maar daalde de expressie van MMP's en drie bekende inductoren van EMT (β-catenine, Twist en Snail1) (Figuur 5C en 5D). Deze ontdekkingen stelde de rol van USP42 als een invasie promotor gen via invloed zijn op de expressie van MMP's en EMT toezichthouders, hoewel verdere studies zijn nodig om de exacte mechanismen te verduidelijken.

Kortom, de huidige studie aangetoond dat USP42 expressie was significant verhoogd in weefsels GC. De verhoogde expressie USP42 kan belangrijk voor tumorprogressie en metastase van GC, en kan als een prognostische marker voor deze ziekte dienen. Onze in vitro bevindingen bleek dat zwijgen van USP42 remden celproliferatie via inducerende G0 /G1 arrestatie en onderdrukte cel invasie via MMP's en EMT toezichthouders. Zo kan USP42 een nieuwe therapeutische moleculaire doelwit voor GC zijn.

Dankwoord

Deze studie werd ondersteund door wetenschappelijk onderzoek van Shanghai Gemeentelijke Commissie voor Gezondheid en Family Planning (20.124.321).

• PLoS ONE: beschermende rol van Helicobacter pylori infectie in Prognose van maagkanker: Bewijs uit 2454 Patiënten met een Gastric Cancer
• PLoS ONE: De doorgeven MicroRNA-26a in plasma en de potentiële diagnostische waarde in de maag Cancer