PLoS ONE: Сверхэкспрессия и биологическая функция Ubiquitin Специфические протеиназы 42 в рака желудка

Абстрактный
<р> Ubiquitin специфические протеазы 42 (USP42) является членом deubiquitinating ферментов (дублирует). Изменения из Dubs участвуют в патогенезе широкого спектра опухолей. Тем не менее, есть несколько исследований по экспрессии и биологической функции USP42 в рак желудка (GC). При этом уровни экспрессии USP42 были в дс тканях значительно выше, чем в неопухолевых тканях. Выражение USP42 значимо коррелировали с размером опухоли, стадии TNM, метастазов в лимфатических узлах и общей выживаемости пациентов с GC. Кроме того, USP42 глушителей в двух клеточных линиях GC, AGS и MKN-45, в частности, пролиферации клеток тормозится, но стимулировало G1 арест фазы. Белки, способствующие прогрессию клеточного цикла (циклин D1, циклин E1 и PCNA) были вниз регулируется в USP42 подавленным клеток. Кроме того, ингибирование USP42 в GC клетках нарушается вторжением клеток посредством влияния на экспрессию матричных металлопротеиназ (ММР) и эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) регуляторов. В заключение, USP42 избыточная экспрессия может быть потенциальным прогностическим маркером для GC, регулируют выживание и инвазивные свойства GC, и может представлять собой новый терапевтический молекулярную мишень для этой опухоли
<р> Образец цитирования:. Hou K, Чжу Z, Ван Y, Чжан С, Ю С, Чжу Q, и др. (2016 г.) Гиперэкспрессия и биологическая функция Ubiquitin-специфичной протеазы 42 в рака желудка. PLoS ONE 11 (3): e0152997. DOI: 10.1371 /journal.pone.0152997
<р> Редактор: Юнг Weon Ли, Сеульский национальный университет, Республика Корея
<р> Поступило: 29 декабря 2015 года; Принято: 22 марта 2016; Опубликовано: 31 марта 2016
<р> Copyright: © 2016 Hou и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. Все соответствующие данные находятся в работе
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано научно-исследовательский проект Шанхайской муниципальной комиссии по вопросам здравоохранения и планирования семьи (20124321)
<р> Конкурирующие интересы:. авторы не заявили, что нет существуют конкурирующие интересы.

Введение
<р> рак желудка (GC) является пятым самым распространенным видом рака [1] и третьей ведущей причиной смерти от рака [2]. В настоящее время известны основные факторы риска включают в себя GC Helicobacter Pylori (H.) инфекции, среды обитания, питание, генетические и иммунные факторы, а также хронические заболевания желудка [3]. Прогноз у больных с GC, как правило, бедны, потому что опухоль часто метастазы и большинство пациентов пожилого возраста (средний возраст старше 70 лет) в то время она диагностируется. Уровень 5-летней выживаемости для GC, как сообщается, менее чем на 25% [4]. Это имеет большое клиническое значение для выявления чувствительных диагностических и прогностических маркеров GC, исследовать молекулярные механизмы развития GC, а также изучить новые цели терапии этого заболевания.
<Р> Ubiquitin специфические протеазы 42 (USP42) представляет собой фермент deubiquitinating (DUB), который широко экспрессируется в различных тканях человека [5]. Убиквитинирование, реверсивный пост-трансляционной модификации, участвует в нескольких клеточных процессах, таких как клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза [6, 7]. Растущие доказательства показали, что измененная функция DUB участвует в патогенезе широкого спектра опухолей [8]. Сверхэкспрессия USP9X, USP9Y, USP10 и USP25 было выявлено при раке молочной железы с помощью двухмерного полиакриламидного гель-электрофореза и протеомики анализа [9]. Несколько исследований показали, что избыточная экспрессия USP22 способствует прогрессии рака и плохой прогноз развития глиомы, рак поджелудочной железы, рак шейки матки и рак легких [10-13]. USP42 Ранее было установлено, что переставить в острой миелоидной лейкемии [14]. Однако, насколько нам известно, ни одно расследование не было выполнено по образцу экспрессии и биологических функций USP42 в GC.
<Р> В настоящем исследовании, уровни USP42 мРНК в тканях GC оказались значительно выше, до уровня в контрольной группе , Дальнейший анализ клинических характеристик показал, что уровень экспрессии USP42 было связано с общей выживаемости пациентов GC. Затем применяется технология РНК-интерференции (RNAi), чтобы сбить экспрессию USP42 в двух клеточных линиях GC (AGS и MKN-45 клеток), и исследовали пролиферацию, клеточный цикл и инвазивный потенциал в обеих клеточных линиях. Наши данные свидетельствуют о том, что USP42 является мощным онкоген в GC, предоставляя нам с будущей мишенью для GC терапии.

Материалы и методы

Образцы тканей
<р> В общей сложности 90 GC пациентов, перенесших операцию на кафедре общей хирургии, Народная больница, Pudong New District (Шанхай, Китай) в период с февраля 2007 года по июнь 2009 года были включены в данное исследование. Средний возраст пациентов составил 56 лет (диапазон: 34-68 лет). Все пациенты получали письменное информированное согласие. Исследование было одобрено независимым этическим комитетом Shanghai Pudong районного народной больницы (Шанхай, Китай). Образцы опухолевой ткани были получены от всех больных ГХ. В то же время, 42 соответствует неопухолевой образцов, расположенных &GТ; 3 см от опухоли были собраны. Все хирургические образцы замораживали в жидком азоте сразу после хирургической резекции, и хранили при -80 ° C до экстракции РНК.

Клеточные линии
<р> клеточные линии, полученные из рака желудка человека, в том числе AGS, SGC-7901, КУП-823, MKN-28 и MKN-45 были получены из Института биохимии и клеточной биологии китайской академии наук (Шанхай, Китай). Все клеточные линии поддерживали в среде RPMI 1640 (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотиками при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO <суб> 2

были выбраны Сайленсинг USP42 с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК)

миРНК для конкретного человека USP42 (5'-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 '). Неспецифический последовательность скремблирования миРНК (Sinc) использовали в качестве отрицательного контроля. В миРНК были трансфицированы в АГС или клетках MKN-45 с использованием lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Анализы проводили через 48 ч после трансфекции.

ПЦР в реальном времени
<р> Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Реакцию обратной транскрипции проводили со случайными гексамере праймеры и транскриптазы комплектом SuperScript перевернутое (Invitrogen). Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени выполняется с помощью стандартного SYBR Green ПЦР-комплект (Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США) на ABI7300 (фирмы Applied Biosystems, Foster City, CA, США) термоциклеру. GAPDH, использовали в качестве контроля уровня входного РНК. Все реакции были проведены с использованием следующих параметров параметры, например, при 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с, 60 ° С в течение 45 с. Чтобы проверить конкретный продукт амплификации, продукты были затем подвергнуты анализу кривой диссоциации. Экспрессия гена рассчитывали с использованием метода Δ Ct. Все данные представляют собой среднее из трех повторах. Последовательности праймеров, специфичных были следующими: мРНК USP42 вперед, 5'- ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 ', и USP42 мРНК-обратное, 5'- ACGCAGATTGGAACAGAG-3'; GAPDH мРНК вперед, 5'- CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ', и мРНК GAPDH реверс, 5'- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'.

Антитела и Вестерн-блоттинга
<р> Антитела против CyclinD1, Е-кадгерин, β -catenin, Snail1 и GAPDH были приобретены у Cell Signaling Technology (Danvers, Массачусетс, США). Антитела против USP42, CyclinE1, PCNA и MMP-9 были из Abcam (Кембридж, штат Массачусетс, США). Анти-MMP-2 был из Epitomics (Burlingame, CA, USA). Конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела из Beyotime биотехнологии (Shanghai, China).
<Р> Клетки промывали три раза ПБС, а затем лизируют в предварительно охлажденную радиоиммуноосажден (Ripa) буфера для анализа на льду в течение 10 мин. После удаления остатков клеток путем центрифугирования (12,000g, 10 мин), концентрация белка в супернатантах измеряли с помощью ВСА анализа белков комплекта (компанией Thermo Fisher Scientific). После кипячения в течение 5 мин в буфере образца, равное количество белков различных групп разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, Брэдфорд, США). После блокирования с помощью 5% обезжиренного молока, мембраны инкубировали с первичными антителами, при 4 ° С в течение ночи при перемешивании с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Реактивный белок затем детектировали с использованием ECL системы хемилюминесценции (Bio-Rad, Richmond, CA, США).

анализа клеточной пролиферации с помощью CCK-8
<р> ССК-8 Анализ проводили с помощью стандартных методов в 96-луночных планшетах. Вкратце, 3 × 10 3 клетки высевали на лунку. В указанный момент времени, ССК-8 раствор (10 мкл в 100 мкл среды RPMI-1640) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч. Поглощение при 450 нм определяли с помощью микропланшет-ридера.

В естественных условиях, несущих опухоль обнаженной модели мышей
были утверждены <р> Эксперименты на животных и выполняется в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных комитета в Shanghai Pudong района Народная больница (Шанхай, Китай). Двенадцать BALB /C голых мышей в возрасте 4-5 недель (SLAC животных, Шанхай, Китай) были сохранены под конкретного патогена условиях, используя стойку ламинарного потока воздуха и имел постоянный свободный доступ к стерилизованной пищи и автоклавного воды. Эксперименты были начаты после 1 недели акклиматизации. AGS клетки (2 × 10 6) подкожно вводили в правый бок голых мышей установить модели ксенотрансплантата-опухоленосителей. Через десять дней после того, как подкожной инъекции мышей были случайным образом разделены на две группы (n = 6 /группа) и IV вводили USP42 миРНК или Sinc составы, содержащие два раза в неделю. Самый короткий и самый длинный диаметр опухоли измеряли с суппортами на 4-дневными интервалами, а объем опухоли (мм 3) была рассчитана с использованием следующей стандартной формуле: (короткий диаметр) 2 × (самый длинный диаметр ) × 0,5. 36 дней после размещения опухоли мышей забивали путем цервикальной дислокации и опухоли были восстановлены. Рассматривались Сырой вес каждой опухоли. В ходе экспериментальной процедуры, у всех мышей контролировали ежедневно. Нет мышей не умер до экспериментальной точки.

клеточного цикла анализа
<р> Клетки обрабатывали трипсином, промывали дважды в PBS и фиксировали в течение ночи при 4 ° С в охлажденном льдом 70% этанола. Затем клетки дважды промывали в PBS, и инкубировали в пропидийиодидом (PI) окрашивающего буфера (5 мкг /мл PI и 0,25 мг /мл РНКазы, Sigma, St. Louis, MO, USA) при комнатной температуре в течение 30 мин. Клетки затем анализировали с использованием с использованием FACScan проточной цитометрии (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Процент клеток в G0 /G1, S и G2 /M фазы определяли PI окрашивания.

инвазии клеток анализы
<р> Для измерения клеток инвазивный потенциал клеток, анализы Transwell были сделаны с использованием Матригель покрытием Бойден камеры (BD Biosciences). Клетки с недостатком сыворотки в течение ночи, собирали и ресуспендировали в среде без сыворотки. Клетки (1 × 10 5) затем добавляли в верхнюю камеру. Среду, содержащую 10% FBS добавляли в нижнюю камеру. После того, как клетки инкубировали при 37 ° С в течение 24 ч, клетки на верхней поверхности мембраны были полностью удалены с помощью ватные палочки. Клетки-мигранты, прикрепленные к нижней поверхности фиксировали в 4% параформальдегидом и окрашивают 0,5% кристаллическим фиолетовым. Количество мигрировавших клеток на нижней поверхности мембраны подсчитывали под микроскопом в пяти областях при 100 ×.

биоинформатики анализ
<р> Желудочный наборы данных рака были загружены с NCBI Gene Expression Omnibus базы данных (Access ID: GSE26253) и Атлас генома рака (TCGA). Для дальнейшего изучения биологических путей, вовлеченных в патогенез рака желудка через USP42 пути, набор генов Обогащение анализ (GSEA) проводилось с использованием общедоступного программного обеспечения из Broad Institute в Массачусетском технологическом институте (http://www.broad.mit.edu/gsea/~~HEAD=pobj программное обеспечение /software_index.html), как описано ранее [15]. Для каждого набора генов, GSEA определяет счет обогащения (ES), которая отражает корреляцию между множеством генов и образцом.

Статистический анализ
<р> анализ выживаемости Каплана-Мейера проводилось с использованием MedCalc ( Mariakerke, Бельгия). Статистический пакет для социальных наук (SPSS) версии 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс) был использован для другого статистического анализа. Результаты экспериментов представлены как среднее ± стандартное отклонение. критерий Стьюдента использовался для сравнения значений тестовых и контрольных образцов. Хи-квадрат тест использовали для выявления различий между категориальными переменными. Статистически значимые различия были определены как имеющие P
&лт; 0.05.

Результаты

Выражение USP42 в желудочном
рака <р> Чтобы исследовать экспрессию USP42 в GC, мы провели анализ в реальном времени ПЦР на GC (п = 90) и образцы тканей доброкачественное (п = 42). Относительную экспрессию мРНК USP42 по сравнению с GAPDH были рассчитаны с использованием метода △ Ct. Очевидно, что экспрессия USP42 мРНК в GC тканях выше, чем в нераковых тканях (рис 1А). Для дополнительной проверки этот вывод, мы повторно проанализировали данные микрочипов из TCGA независимого GC данных. Фиг.1В показали явную избыточную экспрессию USP42 в тканях человека GC по сравнению с нормальными тканями.
<Р> Используя среднее значение 2 ^{-ΔCt (0,550), как отсечка между низкого уровня и высокого уровня USP42 экспрессия мРНК, 90 пациентов были разделены на низких (< 0,550) и высоких подгрупп экспрессии USP42 (≥0.550). Как показано в таблице 1, USP42 был в значительной степени связано с размером опухоли ( P
= 0,0328), TNM стадии ( P
= 0,0059) и метастазов в лимфатических узлах ( P
= 0,0184). Тем не менее, не было никакой значимой связи между экспрессией UP42 и других характеристик пациента, включая пол и возраст больных на момент постановки диагноза и локализации опухоли. Kaplan-Meier анализ выживаемости показал, что общая продолжительность жизни была значительно короче у пациентов с более высоким выражением USP42, чем у пациентов с более низким уровнем экспрессии USP42 (рис 1C, P < 0,05), что было дополнительно подтверждено с помощью анализа выживаемости по ArrayExpress набора данных (ID доступа : GSE26253, рис 1D)}

USP42 миРНК подавлено Expression USP42
<р> Сравнение различных желудочных линий раковых клеток показали, что уровень экспрессии белка USP42 в AGS и клетках MKN-45 выше, чем это. ГЭК-7901, BGC-823 и MKN-28 клеток (рис 2А). Таким образом, АГС и клетки MKN-45 были выбраны для последующих экспериментов. Для того, чтобы исследовать функции USP42 на GC, мы постучать сбитого экспрессию USP42 в GC клеточных линиях по миРНК трансфекции. Как показано на фиг.2В, siРНК, специфичную для USP42 в значительной степени подавлено экспрессию USP42 в AGS и клетках MKN-45 с коэффициентом подавления 60,4% и 74,4%, соответственно. Затем мы проанализировали ли подавление экспрессии USP42 изменит скорость роста клеток GC. Как показано на рис 2С, наблюдалось значительное снижение темпов роста USP42 подавленным клеток по сравнению с синк-трансфецированных клеток.

USP42 миРНК подавляется рост опухоли у голых мышей

Для того, чтобы определить, эффект USP42 миРНК на туморогенности в естественных условиях, равное число клеток AGS вводили подкожно голым мышам и USP42-миРНК был IV вводят после образования опухоли. Скорость роста опухоли у мышей, которым вводили USP42-миРНК была значительно медленнее, чем у мышей, которым вводили контрольной миРНК (Фиг.3А). Объем и масса опухолей USP42-миРНК была менее 25%, что опухоли контрольной группы (рис 3б). Кроме того, по сравнению с контрольными опухолями, USP42 и PCNA значительно уменьшились в опухолях с USP42-миРНК инъекции (рис 3C).

Индуцированные G0 /G1 фазы арест в USP42-подавленными раковых клеток
<р> К выяснить, как высокий уровень экспрессии USP42 пострадавших пролиферацию клеток GC, мы провели набор генов Обогащение анализ (GSEA) на TCGA наборе данных на основе анализа соотношения экспрессии генов и USP42 в Киото энциклопедии генов и геномов (KEGG) клеточного цикла пути. Интересно, что мы обнаружили, что выражение выше USP42 положительно коррелировал с пути клеточного цикла KEGG у больных ГХ на основе TCGA набора данных (рис 4A). Затем мы проанализировали распределение клеточного цикла GC клеток с USP42 нокдаун. Подавляя выражение USP42 сократило популяцию S фазы клеточного и привело к G1 ареста в AGS и MKN-45 клеток (рис 4б). Для дальнейшего изучения клеточный механизм, лежащий в основе USP42-индуцированной пролиферации клеток, были оценены уровни белка белков клеточного цикла. USP42 нокдаун значительно снижала экспрессию циклина D1, циклин E1 и PCNA (фиг.4С). Таким образом, эти результаты показали, что снижение уровня экспрессии USP42 ингибируется циклин D1, циклин E1 и экспрессии PCNA в GC клетки, которые могут индуцировать G0 /G1 арест фаз, значительно уменьшить число фазовых клеток S и ингибируют пролиферацию клеток.

Малоинвазивные потенциал USP42-подавленные раковые клетки
<р> GSEA также показали, что экспрессия USP42 положительно коррелирует с метастазами (рис 5А). Чтобы проверить эти данные в анализе в пробирке, мы исследовали инвазивный потенциал USP42 подавленным клеток, используя в пробирке Matrigel вторжения анализа (рис 5б). В USP42 подавленные клетки показали значительно менее инвазивный потенциал, чем Sinc-трансфицированных клеток ( P
&л; 0,01)., Предполагая, что высокий уровень экспрессии USP42 расширение опухоли инвазивность
<р> Деградация внеклеточного матрикса через матричных металлопротеиназ (ММР), является критическим процессом во время вторжения клеток [16]. Как показано на фиг.5С, глушение USP42 подавляются экспрессию ММР-2 и ММР-9.
<Р> Кроме того, уровни белка эпителиальных-мезенхимальных перехода (EMT) регуляторы пути, что тесно связаны с метастазирования опухолевые клетки, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (фиг 5D). Трансфекция USP42 миРНК значительно снижены уровни экспрессии бета-катенина, Twist и Snail1, при увеличении Е-кадгерина.

Обсуждение
<р> Несколько членов семьи DUB, как известно, способствуют канцерогенеза, в том числе USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] и USP22 [10-12, 21], в то время как другие DUBs являются понижающей регуляции в злокачественных опухолях человека, в том числе USP10 [22] и BAP1 [23]. Тем не менее, мало известно о паттерна экспрессии и биологических функций USP42, даб для р53 [24] и гистона H2B [25], в злокачественных опухолях человека. В нашем исследовании мы показали впервые, что GC ткани экспрессируют высокие уровни мРНК USP42 по сравнению с соответствующими неопухолевой ткани. Кроме того, выражение USP42 было связано с размером опухоли, TNM стадии, метастазов в лимфатических узлах и общей выживаемости пациентов GC (рис 1). Наши результаты предоставили ценную информацию для клинического прогнозирования исхода больных с GC.
<Р> Мы предположили, что USP42 может выступать в качестве онкогенного фактора в процессе разработки ГХ. Затем применяется технология RNAi, которая широко используется в исследованиях рака или терапии рака, чтобы сбить экспрессию USP42 в двух GC клеточных линий (рис 2В). Снижение экспрессии USP42 эффективное уменьшение пролиферации раковых клеток в пробирке (рис 2С) и В естественных условиях
(рис 3). Данные GSEA выявили ассоциацию пути клеточного цикла с выражением USP42 (рис 4а). Затем мы применили анализ клеточного цикла с помощью FACS (рис 4б) и анализа экспрессии циклина D1, циклин Е и PCNA с помощью Вестерн-блоттинга (рис 4С). Наши данные показали, что USP42 миРНК оказывали ингибирующее действие на рост GC клеток с помощью индукции G0 /G1 арест.
<Р> GC является одним из наиболее распространенных видов рака и по-прежнему является серьезной проблемой общественного здравоохранения в мире. Высокий уровень заболеваемости метастазирования еще одна из основных причин плохой выживаемости пациентов с GC [4]. GSEA на TCGA набора данных выявил ассоциацию метастаз пути с выражением USP42 в GC (рис 5А). Кроме того, в пробирке вторжения анализ указывал, что USP42 нокдаун уменьшил инвазивный способность иммортализованных линий клеток (GC рис 5б). Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия USP42 в GC может способствовать метастазирование опухолей и связан с клиническим исходом больных ГЦ. Далее мы попытались изучить основные механизмы путем оценки экспрессии ММР и регуляторов ЕМТ в USP42-подавленными раковых клеток. ММР-2 [26] и ММР-9 [27], как известно, опосредуют деградацию внеклеточного матрикса и связаны с метастазов в лимфатических узлах ГХ. ЕМТ участвует в сложном патогенезе опухолей [28]. Здесь глушение USP42 индуцирует экспрессию основного фактора EMT (E-кадгерина), но уменьшил экспрессию ММР и три известных индукторов EMT (бета-катенина, Twist и Snail1) (рис 5C и 5D). Эти открытия предложили роль USP42 как ген инвазии промотора через влияя на экспрессию ММР и регуляторов ЕМТ, хотя необходимы дальнейшие исследования для выяснения точных механизмов.
<Р> Таким образом, данное исследование показало, что экспрессия USP42 было значительно увеличилось в GC тканях. Повышенная экспрессия USP42 может иметь важное значение для развития опухоли и метастаза GC, и может служить в качестве прогностического маркера для этого заболевания. Наши результаты в пробирке показали, что глушение USP42 ингибирует пролиферацию клеток с помощью индукции G0 /G1 арест и подавлено вторжение клеток с помощью ММР и регуляторов ЕМТ. Таким образом, USP42 может быть новым терапевтическим молекулярной мишенью для GC.

Выражение признательности
<р> Это исследование было поддержано научно-исследовательский проект Шанхайской муниципальной комиссии по вопросам здравоохранения и планирования семьи (20124321).

• PLoS ONE: Защитная роль пилори инфекции Helicobacter в прогнозе рака желудка: данные из 2454 больных с желудочной Cancer
• PLoS ONE: Циркулирующие микроРНК-26а в плазме и его потенциальное диагностическое значение в желудочном Cancer