PLoS ONE: Cirkulerende MicroRNA-26a i plasma og dens potentiale diagnostisk værdi i Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

I de seneste årtier har en del undersøgelser gav mulighed for de cirkulerende microRNA (miRNA) som invasive biomarkører for kræft diagnose. Formålet med vores undersøgelse var at påvise de niveauer af cirkulerende miRNA i væv og plasma af mavekræft (GC) patienter og evaluere deres diagnostiske værdi.

Metoder

Vævsprøver blev indsamlet fra 85 GC patienter. Plasma prøver blev indsamlet fra 285 GC patienter og 285 matchede kontroller. Differentielt udtrykte miRNA blev filtreret med af Agilent Humant miRNA Microarray og TaqMan lav densitet array (TLDA) med puljede prøver, efterfulgt af kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) validering. Receiver opererer karakteristiske (ROC) kurver blev struktureret til at evaluere den diagnostiske nøjagtighed miRNA. Den plasmaniveau af miR-26a i GC patienter af forskellige kliniske stadier blev sammenlignet.

Resultater

Fire miRNA (miR-26a, miR-142-3p, miR-148a, og miR- 195) afslørede tilfældigvis reducerede niveauer i væv og plasma af GC patienter sammenlignet med kontroller, og ROC-kurver blev konstrueret for at vise, at mIR-26a havde en højeste areal under ROC-kurven (AUC) af 0,882. Endvidere blev MIR-26a stabilt påvist i plasma hos GC patienter med forskellige kliniske karakteristika.

Konklusion

Plasma MIR-26a kan tilvejebringe en hidtil ukendt og stabil markør af gastrisk cancer.

Henvisning: Qiu X, Zhang J, Shi W, Liu S, Kang M, Chu H, et al. (2016) cirkulerende MicroRNA-26a i plasma og dens potentiale diagnostisk værdi i Gastric Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0151345. doi: 10,1371 /journal.pone.0151345

Redaktør: Zheng Li, Peking Union Medical College Hospital, KINA

Modtaget: 29 oktober, 2015; Accepteret: 8. februar 2016 Udgivet: 24 marts 2016

Copyright: © 2016 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Natural Science Foundation of China (81230068, 81373091, 81302502, 81302490, og 81473049), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2012842 og BK20130641), Key Program for Basic Research i Jiangsu Provincial Department of Education (12KJA330002), Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina (20130092120063), Jiangsu Provincial uddannelsesprogrammer for Innovation og Entrepreneurship for bachelorstuderende (201412682004Y ), Jiangsu Provincial Videnskab og Teknologi Innovation Team, og Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (Folkesundhed og forebyggende medicin)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme i verden. Selv om den samlede forekomst er faldet i de seneste år, er det den fjerde mest almindelige malignitet (989,000 tilfælde) og den næststørste årsag til kræft dødsfald (738.000 dødsfald) på verdensplan [1]. Mere end 70% af tilfældene forekommer i udviklingslande [2]. Især patienter fremskreden fase stadig demonstrere ekstremt fattige overlevelsesrater [3] .Til dato, er diagnosen GC baseret på de kliniske symptomer, og der er nogle test teknikker anvendt såsom endoskopi, og barium måltid undersøgelse. Men alle disse fremgangsmåder har vist nogle defekter på detektion af GC. Derudover er der nogle serum tumormarkører for eksempel carcinoembryonisk antigen (CEA), kulhydrat antigen 19-9 (CA19-9) og kulhydrat-antigen 72-4 (CA72-4), og der er nogle begrænsninger sensitivitet og specificitet for GC screening [4]. Derfor vi være mere opmærksomme på at opdage nye, pålidelige og invasive biomarkører for GC.

MikroRNA'er (miRNA) er en klasse af korte (20 ~ 25 nukleotider), kodende enkeltstrengede RNA [5]. Det er en udbredt opfattelse, at miRNA kan deltage i regulering af genekspression, hvilket giver anledning til mRNA silencing som target spaltning, translationel inhibering, og mRNA henfald [6]. Akkumulerende beviser har vist, at miRNA var involveret i adskillige patofysiologiske processer og føre til grundlæggende ændringer i flere sygdomme. Zhang et al
. fundet, at MIR-26a induceret endotel apoptose og indikerede en terapeutisk potentiale MIR-26a for aterosklerose associeret med apoptotisk celledød [7]. Leonov et al
. beskrevet hæmning af miR-132 resulterede i høj AGO2
udtryk, som var involveret i angiogenese og inflammation under primær endotelcelleaktivering [8]. Talrige undersøgelser har indikeret, at de miRNA spiller uundværlige roller på tumorigenese, der handler enten som onkogener eller tumorsuppressorgener [9]. Flere miRNA har rapporteret at være relateret til kræft af miRNA udtryk profiler [10-12]. Desværre vævsprøverne er vanskeligt at erhverve. Afsløring miRNA i væv er ikke realistisk i klinisk anvendelse.

Desuden har stigende beviser vist, at cirkulerende miRNA er resistente over for RNase fordøjelse og stabilt påvises i plasma og serum med lethed af målinger [13-14]. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at tilstedeværelsen af ​​miRNA i blod og udtrykket i forbindelse med cancer, herunder storcellet B-celle lymfom, kolorektal cancer, blærecancer og brystcancer [15-18]. Disse undersøgelser tilsammen danne grundlag for cirkulerende miRNA optræder som nye biomarkører for kræftscreening.

Mange undersøgelser viser ekspressionsniveauet af miRNA i plasma er ikke helt i overensstemmelse med det i tumor. miR-378 faldt betydeligt i GC væv og flere cellelinjer [19], men miR-378 var meningsfuldt opreguleret i GC patienternes serum [20]. Som det samme som MIR-486, kan MIR-486 fungere som et tumor-suppressor miRNA i gastrisk tumor [21], som blev overudtrykt i GC patienternes serum [22]. På nuværende, kan flere serum /plasma miRNA skelne fra GC patienter med kontrollerne, men ikke desto mindre kan ikke repræsentere miRNA udtryk i væv. Hvis vi kan finde ud af miRNA både udtrykkes forskelligt i mavekræft væv og plasma, bør den have mere klinisk betydning.

For at efterprøve, om miRNA differentielt udtrykt både i væv og plasma, vi brugte to mikroarrays til skærmen miRNA . I de to validering etaper, fire kandidatlande miRNA var signifikant nedreguleret i tumorvæv og plasma prøver ved QRT-PCR. Vores undersøgelse viste, at miR-26a blev signifikant reduceret stabilt i plasma af gastrisk kræftpatienter og kunne skelne gastrisk kræftpatienter fra kontroller, med god følsomhed og specificitet. Det var forudsagt til at være en lovende cirkulerende biomarkør for mavekræft i rutinemæssig klinisk diagnose.

Materialer og metoder

Undersøgelse design og emner

Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Nanjing Medical University, og hver deltager forudsat den underskrevne skriftligt informeret samtykke. Alle emner blev rekrutteret på Yixin Cancer Hospital, Nantong Tumor Hospital, Huai-An First Folkets Hospital og The Second Affiliated Hospital i Nanjing Medical University siden marts 2006 til maj 2013 Jiangsu-provinsen, Kina.

Tumoren væv og de normale væv (placeret > 5 cm fra tumoren) blev opnået fra 55 GC patienter, der gennemgår kirurgi og snap-frosset i flydende nitrogen. Plasmaprøverne blev indsamlet fra 285 GC patienter, og 285 køns- og alder-matchede plasma fra raske individer blev indsamlet som kontrollerne. Alle patienter blev bevist histologisk diagnose af GC ved første diagnosticering, og ingen af ​​dem havde fået terapeutiske procedurer, for eksempel kemoterapi eller strålebehandling. Vi klassificeret tumor etape i overensstemmelse med tumor-node-metastaser (TNM) iscenesættelse system Union for International Cancer Control (UICC). De kliniske karakteristika for undersøgelsens deltagere er vist i tabel 1.

En etapevis undersøgelse blev designet til at identificere plasma miRNA som biomarkører for GC patienter (Fig 1). I opdagelsen fase, blev differentielt udtrykte miRNA vurderet i de parrede vævsprøver fra 5 GC patienter (S1 tabel) ved Agilent Menneskelig miRNA Microarray (V12.0, Agilent Technology, CA, USA). Plasmaprøver fra 5 GC patienter (S2 tabel), hvis køn, alder kliniske tilstande matchet med vævsprøverne og 5 raske kontroller blev underkastet TLDA (V2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) for at identificere de differentielt udtrykte miRNA . I uddannelsen fase, blev markant ændret miRNA først evalueret af QRT-PCR i 50 parrede væv prøver og 80 GC serumprøver og 80 matchede kontroller. Efterfølgende blev differentielt udtrykte miRNA mellem væv og serum undersøges yderligere i yderligere 400 deltagere, som omfattede 200 GC patienter og 200 kontroller.

RNA isolation fra plasma og væv

Blodprøver i separate vakuum Terningerne blev centrifugeret ved 3.000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Vi indsamlede supernatanten og opbevaret ved -80 ° C. Før du starter isolation procedure, vi tilføjet en slutkoncentration på 10 ^{-4 pmol /ul syntetisk C
. elegans
MIR-39 (cel-MIR-39) (Takara, Japan) til hver prøve, med henblik på at styre den biologiske variabilitet. RNA blev ekstraheret fra 100 pi plasma under anvendelse af QIAGEN miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Den totale RNA fra væv blev isoleret ved anvendelse af TRIZOL-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).}

Microarrays og QRT-PCR

Profilering blev udført under anvendelse Agilent Humant miRNA Microarray (V12.0 , Agilent Technology, CA, USA) og TaqMan lav massefylde array (V2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). For det totale RNA isolering fra væv, blev QRT-PCR udført under anvendelse af SYBR (R) PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara Bio). En detaljeret beskrivelse af de eksperimentelle protokoller er deponeret i S1 data.

statistiske analyser

De parrede vævsprøver blev sammenlignet ved hjælp af en Wilcoxon rank sum test. Ikke-parametriske Mann-Whitney U test blev udført for at bestemme betydningen i plasma miRNA niveauer mellem kræft gruppe og sunde gruppe. Modtager-operatør karakteristiske (ROC) kurver og arealet af de ROC kurver (AUC) blev opnået for at vurdere GC afsløring potentiale miRNA. Statistiske analyser var to-sidet test, og P
< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS softwareversion 16,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Discovery af kandidat biomarkører ved mikroarrays

Vi brugte to microarray platforme for miRNA til at analysere og sammenligne de miRNA ekspressionsmønstre fra to forskellige tilstande. TLDA analyse blev gennemført for at bekræfte kandidat miRNA ekspressionsniveauerne. blev påvist i alt 142 miRNA i plasma. 65 af de samlede miRNA blev forøget og 77 blev nedsat i GC patienter sammenlignet med kontroller

For at identificere kandidat miRNA, udtryk for miRNA mellem patienter og kontroller var nødvendige for at korrespondere med to kriterier: (1). Udtrykket deregulering i tumorvæv var konsistent med TLDA resultat [23]; og (2) plasma miRNA niveauer bevise ≥ 2-fold forskel mellem patienter og kontroller. I sidste ende, fire nedreguleret plasma miRNA (dvs. miR-26a, miR-142-3p, miR-148a og miR-195) blev valgt som kandidater til knytnæve-trins validering af (tabel 2).

Bekræftelse af miRNA ved QRT-PCR

for det første blev resultaterne af microarrays analyser bekræftet ved hjælp af de parrede væv, GC plasma og matchede kontroller for disse fire miRNA ved QRT-PCR. Vores resultater viste, at tendensen af ​​resultaterne af QRT-PCR var i lighed med mikroarrays analyser, enten i væv eller i plasma. Plottet viste, at ekspressionsniveauerne af fire miRNA var statistisk signifikante i GC væv ( P
= 0,001, P
= 0,002, P
< 0,001 og P
= 0,003 for miR-26a, miR-142-3p, miR-148a og miR-195, henholdsvis figur 2A-2D). I mellemtiden, vi udførte QRT-PCR at kontrollere udtryk for miRNA blev nedreguleret i en anden uafhængig sæt af 80 GC plasmaprøver og 80 raske kontrolpersoner. Udtrykkene af fire miRNA i GC plasma blev faldet betydeligt i forhold til dem i kontrol (alle P
< 0,001, Fig 2E-2H). De udtryk niveauer af de fire miRNA i plasma var konsekvent faldet, sammenligne med vævsprøver.

Storstilet validering af plasma microRNA i GC patienter

For at validere stabilitet plasma udtryk af miRNA, udførte vi QRT-PCR i stor skala på 200 GC plasmaprøver og 200 matchede cancer-fri kontrol. Accordant med resultaterne af uddannelsen fase, ekspressionsniveauerne af fire miRNA viste signifikant nedregulering i plasma af GC-patienter (alle P
< 0,001, figur 3), hvilket antyder, at disse fire miRNA i plasma kan fungere som kandidatlandene biomarkører for diagnose af GC.

Evaluering af den diagnostiske potentiale miRNA til GC

for at vurdere effektiviteten af ​​over fire miRNA som diagnostiske markører for GC detektion, vi udførte ROC-kurve analyse på hver miRNA. Figur 4 viste, at ROC kurver af fire ansøgerlande miRNA viste plasma miRNA var af værdi til at skelne GC patienter fra normale kontroller. Cutoff-værdien af ​​0,651 var lig med følsomhed + specificitet-1, som var maksimal for MIR-26a (relative ekspression normaliseret ved celle-39). For miR-26a, følsomheden var 83,6%, og specificiteten var 81,5% med en AUC på 0,882 (95% CI = 0,847-0,916) (Fig 4A). Ved cut-off værdi på 0,585 for miR-142-3p, følsomheden var 74,4%, og specificiteten var 84,1% med en AUC på 0,839 (95% CI = 0,800-0,879) (fig 4B). De AUC var 0,842 (95% CI = 0,803-0,882) og 0,765 (95% CI = 0,717 til 0,812) for miR-148a og miR-195, hhv. Følsomheden og specificiteten var 75,4% og 83,1% for MIR-148a, 69,2% og 75,4% for MIR-195, (fig 4C og 4D). Kombinationen ROC kurve analyse gav AUC værdi på 0,872 (95% CI = 0,836-0,908) (Fig 4E).

For at verificere diagnosen værdi værten miRNA til GC kombineret vi nogen af ​​plasma miRNA og udført de ROC kurver som vist i S1 og S2 fig. Disse data viste, at miR-26a, som viste den største evne til at skelne GC patienter fra kontrol, kunne fungere som en egnet biomarkør til detektering GC.

Diskussion

På trods af et betydeligt fald i GC dødelighed i det seneste årti, er dødeligheden stadig højere end mange andre almindelige maligniteter [24]. I de senere år har tumor biomarkører for eksempel CEA, CA19-9, CA74-2 med den begrænsede følsomhed og specificitet har været meget anvendt til diagnose, overvågning og prognosticering af GC [4]. Alt i alt er der stor betydning for diagnose af GC for at lede efter mere specifikke og følsomme biomarkører.

Tissue miRNA som de biomarkører for diagnose og prognose blev først foreslået. Bandres et al
. afslørede, at miR-451 blev nedreguleret i primær gastrisk og kolorektale tumorer, og nedregulering af miR-451 var forbundet med lav DFS og lav samlet overlevelse [25]. Xiao et al
. identificeret MIR-106a som et dramatisk opreguleret miRNA i GC [26]. De fandt også, at ekspressionen af ​​MIR-106a var signifikant relateret til tumor stadium, lymfe, fjernmetastase og invasion. Ikke desto mindre har mange typer af kræftpatienter ikke kunnet blive opereret i klinisk praksis, når de er diagnosticeret. Afhængigheden af ​​kirurgiske sektion og invasiv procedure for vævsprøve samling stærkt begrænset anvendelsen af ​​miRNA i væv af kræft diagnose [27]. Den diagnostiske kvalitet af disse metoder er utilfredsstillende.

Emerging beviser også indebærer, at cirkulerende miRNA er relateret til kræft [28-30]. Den nylige undersøgelse rapporterede, at miRNA var påviselige i plasma og stabile ved stuetemperatur og /eller multiple frysning-optøning processer [31]. Talrige rapporter havde oplyst, at nytten af ​​cirkulerende miRNA som nye invasive biomarkører for kræftformer, såsom kolorektal cancer [32], brystkræft [33-34] og renalcellecarcinom [35].

I vores undersøgelse, vi metodisk screenet miRNA profil i de parrede væv og i plasma fra GC patienter og raske kontrolpersoner. Plasma opnået fra 5 tilfælde og 5 kontroller blev blandet sammen til dannelse af to poolede prøver og blev anvendt til TLDA. Denne metode til at samle prøver er en meget anvendt teknik, der har vist sig at være pålidelige til profilering [36-38]. Sammenligning TLDA analyse og resultatet af væv microarray blev fire miRNA (miR-26a, miR-142-3p, miR-148a og miR-195) reduceret i GC valgt.

Efterfølgende vi identificeret fire ansøgerlande miRNA ved QRT-PCR i to etaper, og fandt ekspressionsniveauerne af fire miRNA faldt i plasmaet af GC patienter, der var i overensstemmelse med udtrykkene i væv. ROC-kurve, også kendt som følsomhed kurve, er bredt anerkendt som en evaluering metode til diagnostisk test. Det er også en integreret indikator, der afspejler følsomheden og specificiteten af ​​kontinuerlige variabler. I den aktuelle undersøgelse, ROC-analyse viste, at kombinationen af ​​fire miRNA ikke var mere effektiv end MIR-26a individuelt. MIR-26a alene kunne opnå en god diagnostisk effektivitet i skelne GC patienter fra raske kontrolpersoner med et AUC på 0,882 (følsomhed = 83,6% og specificitet = 81,5%). En tidligere undersøgelse fra Schneider et al
. vises serum niveauer af CEA, CA19-9 og CA72-4 i GC belyst en følsomhed på 45,5% for CA19-9, 23,8% for CEA og 60,7% for CA72-4 [39]. Disse var langt mindre end følsomheden af ​​MIR-26a. Endvidere ekspressionsniveauet af MIR-26a i plasma var signifikant lavere i GC patienter, og viste ikke nogen betydning med progressionen af ​​GC (S3 Fig). Derfor miR-26a havde et stort potentiale som et diagnostisk plasma biomarkør for GC.

I de seneste årtier, har de tidligere undersøgelser ikke bekræfte, at om miRNA udtryk for plasma eller serum kunne repræsentere niveauet af væv. I forhold til disse undersøgelser, vores undersøgelse havde egen funktion på grund af årsager som følger. Først valgte vi de miRNA som udtrykte differentielt både i væv og plasma, ved at sammenligne resultaterne af to mikroarrays. Dette resulterede i en bedre mulighed for at identificere mulige diagnostiske markører. Endvidere fandt vi, at MIR-26a-ekspression betydeligt reduceret i GC patienter og holdes stabil i plasma (S3 Fig).

Resultaterne viste, at plasma ekspression af MIR-26a var signifikant lavere i GC patienter sammenlignet med de raske kontroller ( P
< 0,05), som viste stabilitet i GC patienter med forskellig klinisk status. Nedreguleringen af ​​plasma MIR-26a ekspression kan indikere sandsynligheden for diagnosticering GC. Derfor kan MIR-26a være en bedste valg til at tjene som potentielle biomarkør for GC. Deng et al
. viste, at miR-26a niveauer i GC væv blev mere bemærkelsesværdigt faldt end i ikke-tumorvæv ved QRT-PCR [40]. De viste også, at miR-26a hæmmede tumorvækst og metastase dels ved at målrette FGF9
in vivo. Disse bestod med vores resultater. Disse resultater bekræftede, at miRNA-26a i plasma kunne være en potentiel diagnostisk markør for GC.

Men begrænsningerne i vores undersøgelse er, at prøverne for vævet microarray og for TLDA ikke var fra de samme patienter, og vores stikprøvestørrelser for mikroarrayene var relativt lille. Yderligere analyse af microarrays for de samme patienter og bekræftelsen forstørret prøve kræves anvendt som en ny screeningsværktøj til GC i rutinemæssig klinisk anvendelse. Derudover har vi ikke vælger den up-regulerede miRNA grund af det faktum, at der ikke var de up-regulerede miRNA hvis fold ændringer var ≥ 2. Vi valgte kandidat miRNA som voldsomt blev udtrykt i plasma for at sikre, af sandsynligheden for undersøgelsen i klinisk praksis.

konklusioner

sammenfattende vores undersøgelse afslørede fire ned-regulerede miRNA, miR-148a, miR-142-3p, miR-26a, og miR-195, i GC patienter. Vigtigere, øgedes plasma ekspression af MIR-26a betydeligt reduceret og stabile i patienter med gastrisk cancer. Som et resultat, kan miR-26a give en non-invasiv og stabil biomarkør for mavekræft diagnose og screening.

Støtte Information
S1 data. Eksperimentelle protokoller Microarrays og QRT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s001
(DOC)
S1 Fig. ROC-kurve analyse af kombinationen af ​​to miRNA blandt de fire kandidat miRNA.
Kombinationen af ​​MIR-26a og MIR-142-3p (A), kombinationen af ​​MIR-26a og MIR-148a (B), kombinationen af mIR-26a og mIR-195 (C), og kombinationen af ​​mIR-142-3p og mIR-148a (D), kombinationen af ​​mIR-142-3p og mIR-195 (E) og kombinationen af ​​miR- 148a og miR-195 (F) gav de største AUC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s002
(DOC)
S2 fig. ROC-kurve analyse af kombinationen af ​​tre miRNA blandt de fire kandidat miRNA.
Kombinationen af ​​MIR-26a, MIR-142-3p og MIR-148a (A), kombinationen af ​​MIR-26a, MIR-142-3p og mIR-195 (B), kombinationen af ​​mIR-26a, mIR-148a og mIR-195 (C) og kombinationen af ​​mIR-142-3p, mIR-148a og mIR-195 (D) gav de største AUC'er.
doi: 10,1371 /journal.pone.0151345.s003
(DOCX)
S3 fig. . plasmaniveau af miR-26a i mavecancerpatienter forskellige niveauer af den kliniske status
Kassegrafer viste plasmaniveauerne af miR-26a i 200 raske kontrolpersoner og 200 gastric kræftpatienter på forskellige kliniske status
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s004 Hotel (DOCX)
S1 Table. Kliniske karakteristika af væv fag screening af Agilent Menneskelig miRNA Microarray
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s005
(DOC)
S2 Table. Kliniske kendetegn for plasma fag screening af TLDA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s006
(DOC)

Tak

Vi er dybt taknemmelige for deltagelse af alle fag, der bidrager til denne forskning.

• PLoS ONE: Overekspression og biologiske funktion af Ubiquitin-Specifik Protease 42 i Gastric Cancer
• PLoS ONE: associering mellem tandtab og Gastric Cancer: En meta-analyse af Observational Studies