Абстрактный
Фон
В последние десятилетия, много исследований предоставил возможность из циркулирующие микроРНК (миРНК) в качестве неинвазивных биомаркеров для диагностики рака. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы обнаружить уровни циркулирующих микроРНК в тканях и плазме рака желудка (GC) пациентов и оценить их диагностическое значение.
Результаты
<р> Четыре микроРНК (микроРНК-26а, микроРНК-142-3p, микроРНК-148а и зер- 195) показал, по совпадению сниженные уровни в плазме и ткани у больных ГЦ по сравнению с контролем, и кривые ROC были построены, чтобы продемонстрировать, что микроРНК-26а имел самую высокую площадь под кривой (AUC) в 0,882. Кроме того, микроРНК-26а стабильно обнаружен в плазме GC больных с различными клиническими характеристиками.
Введение Многие исследования показывают уровень экспрессии микроРНК в плазме крови не полностью соответствует, что в опухоли. микроРНК-378 значительно снизилась в GC ткани и нескольких клеточных линий [19], но микроРНК-378 были значительно повышающей регуляции в сыворотке крови GC пациентов [20]. Как же, как микроРНК-486, микроРНК-486 может функционировать как опухолевого супрессора микроРНК в желудочном опухоли [21], которые были сверхэкспрессируется в сыворотке крови больных GC [22]. В настоящее время несколько сыворотки /плазмы микроРНК может отличить от больных ГХ с контрольной группой, тем не менее, это не может представлять выражение микроРНК в тканях. Если мы сможем выяснить, как микроРНК дифференцированно выражены в желудочном раковой ткани и плазме, он должен иметь больше клиническое значение. Дизайн исследования и предметы профилирование осуществляли с использованием Agilent Human микроРНК Microarray (v12.0 Компания Agilent Technology, CA, USA) и TaqMan массив низкой плотности (V2.0; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Для получения полной РНК из тканей изолирующей, Qrt-ПЦР проводили с использованием SYBR (R) PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara Bio). Подробное описание экспериментальных протоколов осаждается в S1 данных. Открытие биомаркеров кандидатов от микрочипов Для того, чтобы определить кандидатов микроРНК, экспрессия микроРНК между пациентами и контрольными были необходимы, чтобы соответствовать двум критериям:. (1) выражение дерегулирование в опухолевой ткани согласуется с TLDA исходом [23]; и (2) уровни микроРНК в плазме доказывает ≥ 2-кратное различие между пациентами и контрольной группы. В конце концов, четыре вниз регулируется плазмы микроРНК (т.е. микроРНК-26а, микроРНК-142-3p, микроРНК-148а и микроРНК-195) были отобраны в качестве кандидатов для проверки достоверности кулака стадии (таблица 2). Оценка диагностического потенциала микроРНК для GC Для того, чтобы оценить эффективность выше четырех микроРНК в качестве диагностических маркеров для обнаружения GC, мы провели кривую ROC анализ по каждому микроРНК. Рис 4 показал, что кривые ROC четырех кандидатов микроРНК продемонстрировали плазменные микроРНК имели значение для того чтобы отличить пациентов GC от нормального контроля. Величина отсечки 0.651 была равна чувствительности + специфичности-1, которая была максимальной для MIR-26а (относительном выражении, нормированная клетки-39). Для MIR-26а, чувствительность составляла 83,6%, а специфичность 81,5% с АУК 0,882 (95% CI = 0.847-0.916) (рис 4а). При отсечения значения 0,585 для MIR-142-3p, чувствительность составляла 74,4%, а специфичность 84,1% с АУК 0,839 (95% CI = 0.800-0.879) (рис 4б). В ППК были 0,842 (95% ДИ = 0.803-0.882) и 0,765 (95% ДИ = 0.717-0.812) для MIR-148а и MIR-195, соответственно. Чувствительность и специфичность составили 75,4% и 83,1% для MIR-148а, 69,2% и 75,4% для MIR-195, соответственно (рис 4C и 4D). Сочетание ROC анализ кривой дала АУК значение 0,872 (95% CI = 0.836-0.908) (рис 4Е). Выводы Таким образом, наше исследование показало, четыре вниз регулируется микроРНК, микроРНК-148а, микроРНК-142-3p, микроРНК-26а и микроРНК-195, в GC пациентов. Что еще более важно, выражение плазма MIR-26а была значительно снижена и стабильным у больных раком желудка. В результате микроРНК-26а может обеспечить неинвазивный и стабильной биомаркера диагностики рака желудка и скрининга. Выражение признательности
<р> рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний в мире. Хотя общая заболеваемость снизилась в последние годы, он является четвертым наиболее распространенным злокачественным (989,000 случаев), а второй ведущей причиной рака, связанных смерти (738,000 смертей) во всем мире [1]. Более 70% случаев происходит в развивающихся странах [2]. В частности, у пациентов в прогрессирующей стадии по-прежнему демонстрируют чрезвычайно бедные показатели выживаемости [3] дату .to, диагноз GC основан на клинических симптомах, и есть некоторые методы испытаний применяются такие, как эндоскопии и бариевой обследование. Тем не менее, все эти подходы показали некоторые дефекты при обнаружении GC. Кроме того, есть некоторые опухолевые маркеры сыворотки, например карциноэмбриональному антигена (СЕА), антигена 19-9 (CA19-9) и углеводного антигена 72-4 (CA72-4), и есть некоторые ограничения чувствительности и специфичности для GC скрининга [4]. Таким образом, мы обращаем больше внимания на обнаружении роман, надежные и неинвазивных биомаркеров GC.
<Р> MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс коротких (20 ~ 25 нуклеотидов), некодирующих одноцепочечной РНК [5]. Широко распространено мнение, что микроРНК могут участвовать в регуляции экспрессии генов, что приводит к мРНК глушителей, такие как мишени расщепления, трансляционной ингибирования, и мРНК распада [6]. Накопленные данные показали, что микроРНК были вовлечены в несколько патофизиологических процессов и приводят к фундаментальным изменениям в отношении многих заболеваний. Чжан и др
. обнаружили, что микроРНК-26а индуцированной эндотелиальной апоптозу и показали терапевтический потенциал MIR-26a при лечении атеросклероза, связанного с апоптотической гибели клеток [7]. Леонов и др
. описано ингибирование микроРНК-132 привело к высокой AGO2
выражение, которое участвует в ангиогенеза и воспаления при первичной активации эндотелиальных клеток [8]. Многочисленные исследования показали, что микроРНК играют необходимые роли на онкогенеза, действуя либо в качестве онкогенов или генов-супрессоров опухолей [9]. Несколько микроРНК сообщили, связаны с раком выражением микроРНК профилей [10-12]. К сожалению, образцы ткани трудно получить. Обнаружение микроРНК в тканях не является реалистичным в клиническом применении
. <Р> Кроме того, все больше доказательств показал, что циркулирующие микроРНК устойчивы к РНКазы пищеварения и стабильно обнаруживается в плазме и сыворотке крови с легкостью измерений [13-14]. Предыдущие исследования подтвердили, что наличие микроРНК в крови и выражение, связанное с раком, в том числе большой B-клеточной лимфомы, колоректальный рак, рак мочевого пузыря и рак молочной железы [15-18]. Эти исследования в совокупности обеспечивают основу для циркулирующих микроРНК, действующей в качестве новых биомаркеров для скрининга рака.
<Р> Для того, чтобы установить, является ли дифференцированно выражены микроРНК как в ткани и плазме, мы использовали два микрочипов к экрану микроРНК , В два этапа проверки, четыре кандидатов микроРНК были значительно понижающей регуляции в тканях опухоли и образцах плазмы с помощью QRT-PCR. Наше исследование показало, что микроРНК-26а значительно снизилась стабильно в плазме у больных раком желудка и может отличить больных раком желудка с контролем, с хорошей чувствительностью и специфичностью. Было предсказано, чтобы быть многообещающим циркулирующей биомаркеров рака желудка в рутинной клинической диагностике.
Материалы и методы
<р> Это исследование было санкционировано институциональный обзор совет Нанкин медицинского университета, и каждый участник предоставил подписанное письменное информированное согласие. Все пациенты были набраны в больнице Yixin рака, Наньтун больницы Опухоли, Хуай-An Первая народная больница и Второй филиал больницы Нанкин медицинского университета с марта 2006 года по май 2013 года в провинции Цзянсу, Китай.
<Р> Опухоль тканей и нормальные ткани (расположенные &к раствору 5 см от опухоли) были получены из 55 пациентов, перенесших операцию GC и быстро замораживали в жидком азоте. Образцы плазмы собирали из 285 пациентов, GC, и 285 пола и возраста соответствует плазмы от здоровых людей, были собраны в качестве контрольной группы. Все пациенты были доказаны диагноз гистологически ГК при первоначальном диагнозе, и никто из них не получил терапевтические процедуры, например, химиотерапия или лучевая терапия. Мы классифицировали стадии опухоли в соответствии с системой промежуточной опухолью узел-метастаз (TNM) Союза по международному контролю рака (UICC). Клинические характеристики участников исследования представлены в таблице 1.
<р> исследования Многоступенчатая был разработан для определения плазменных микроРНК в качестве биомаркеров для пациентов GC (рис 1). На стадии открытия дифференцированно выраженные микроРНК были оценены в парных образцах тканей из 5 пациентов GC (S1 таблица) по Agilent Human микроРНК Microarray (v12.0, Agilent Technology, CA, США). Образцы плазмы от 5 GC пациентов (S2 таблицу), чей пол, возраст клинические состояния совпасть с образцами тканей и 5 здоровых лиц были подвергнуты TLDA (V2.0; Applied Biosystems, Foster города, Калифорния, США), чтобы определить дифференциально выраженные микроРНК , На этапе обучения, значительно измененные микроРНК были впервые оценены QRT-PCR в 50 парных образцах тканей и 80-GC образцов сыворотки и 80 контрольных группах. Впоследствии дифференцированно выраженные микроРНК между ткани и сыворотки были дополнительно рассмотрены в дополнительных 400 участников, среди которых были 200 пациентов GC и 200 управления.
Выделение РНК из плазмы и тканей
<р> Образцы крови в отдельные вакуумные кубики центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Мы собирали супернатант и хранили их при температуре -80 ° С. Перед началом процедуры выделения, мы добавили конечной концентрации 10 -4 пмоль /мкл синтетического C
. Элеганс
микроРНК-39 (CEL-микроРНК-39) (Takara, Japan) для каждого образца для того, чтобы контролировать биологическую изменчивость. РНК экстрагировали из 100 мкл плазмы с использованием набора QIAGEN miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, США). Общую РНК из тканей выделяли с использованием тризол реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Microarrays и QRT-PCR
Статистический анализ
<р> Спаренные образцы тканей сравнивались с использованием теста суммы рангов Уилкоксона. Непараметрический критерий Манна-Уитни U было проведено с целью определения значимости в плазме уровней микроРНК между группой рака и здоровой группы. Приемник-оператор характеристика (ROC) кривых и площади под кривыми ROC (ППК) были получены для оценки потенциала обнаружения GC микроРНК. Статистические анализы были двухсторонняя тест, и P
&л; 0,05 рассматривалось как статистически значимое. Все статистические анализы проводились с версией программного обеспечения SPSS 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США).
Результаты
<р> Использовалась два микрочипов платформы для микроРНК, чтобы проанализировать и сравнить паттерны экспрессии микроРНК из двух различных условий. Анализ TLDA был завершен, чтобы подтвердить кандидата микроРНК уровни экспрессии. В общей сложности 142 микроРНК были обнаружены в плазме. 65 из общего количества микроРНК были увеличены, и 77 были снижены у пациентов GC по сравнению с контрольной группой
Подтверждение микроРНК по QRT-PCR
<р> Во-первых, результаты микрочипов анализа были подтверждены с использованием спаренных тканей, плазмы GC и совпавшие элементы управления для этих четырех микроРНК с помощью QRT-PCR. Наши результаты показали, что тенденция результатов QRT-PCR была похожа на микрочипов анализы, либо в тканях или в плазме. Сюжет показал, что уровни экспрессии четырех микроРНК были статистически значимыми в тканях GC ( P
= 0,001, P
= 0,002, P
&л; 0,001 и P
= 0,003 для MIR-26а, MIR-142-3p, MIR-148а и микроРНК-195, соответственно, рис 2А-2D). В то же время, мы провели QRT-PCR для проверки выражения микроРНК были вниз регулируется в другом независимом множестве 80 GC образцов плазмы и 80 здоровых людей. Выражения четырех микроРНК в плазме GC значительно снизились по сравнению с теми, в контрольной группе (все P
&л; 0,001, рис 2E-2H). Уровни выражения четырех микроРНК в плазме были последовательно уменьшились, по сравнению с образцами тканей.
Масштабная проверка плазменных микроРНК в GC больных
<р> Для подтверждения устойчивости плазмы выражения микроРНК, мы провели QRT-PCR в большом масштабе 200 образцов плазмы GC и 200 подобранных без рака управления. Созвучно с результатами этапа обучения, уровни экспрессии четырех микроРНК показали значительное понижающее регулирование в плазме больных GC (все P
&л; 0,001, рис 3), предполагая, что эти четыре микроРНК в плазме может служат в качестве кандидата биомаркеров для диагностики GC.
<Р> Чтобы проверить значение диагностики хоста микроРНК для GC, мы объединили любой из плазмы микроРНК и выполнены кривые ROC, как показано на S1 и S2 фиг. Эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК-26а, которые показали наибольшую способность дифференцировать пациентов GC от контроля, могут выступать в качестве подходящего биомаркеров для обнаружения GC.
Обсуждение
<р> Несмотря на значительное снижение в GC смертности в последнее десятилетие уровень смертности все еще выше, чем у многих других распространенных злокачественных новообразований [24]. В последние годы, опухолевые биомаркеры, например CEA, CA19-9, CA74-2 с ограниченной чувствительности и специфичности широко используются для диагностики, мониторинга и прогнозирования GC [4]. В общем, есть большое значение для диагностики GC, чтобы искать более специфических и чувствительных биомаркеров.
<Р> впервые были предложены ткани микроРНК в качестве биомаркеров диагностики и прогнозирования. Bandres и др
. показали, что микроРНК-451 был вниз регулируется в первичной язвы желудка и колоректального опухолей, а также вниз регулирование MIR-451 было связано с низкой ДФС и низкой общей выживаемости [25]. Сяо и др
. определены микроРНК-106а, как резко повышающей регуляции миРНК в GC [26]. Они также обнаружили, что экспрессия микроРНК-106а в значительной степени связано со стадией опухоли, лимфатической, отдаленных метастазов и инвазии. Тем не менее, многие виды онкологических больных не смогли пройти операцию в клинической практике, когда они диагностированы. Зависимость от хирургической секции и инвазивные процедуры для сбора образцов ткани сильно ограничивает применение микроРНК в ткани диагностики рака [27]. Диагностическое качество этих методов является неудовлетворительным.
<Р> Новые доказательства также подразумевает, что циркулирующие микроРНК связаны с раком [28-30]. Недавнее исследование показало, что микроРНК были обнаружены в плазме и стабильны при комнатной температуре и /или нескольких процессов замораживания-оттаивания [31]. Многочисленные сообщения были освещены, что полезность циркулирующих микроРНК как новых неинвазивных биомаркеров для рака, таких как колоректальный рак [32], рак молочной железы [33-34] и клеточной карциномы почек [35].
<Р> В нашем исследовании, мы методично скринингу профиль микроРНК в парных тканях и в плазме крови у пациентов GC и здоровых людей. Плазма, полученный из 5 случаев и 5 управления были смешаны вместе с образованием двух объединенных пробах и были использованы для TLDA. Этот метод объединения образцов является широко используемый метод, который, как было показано, чтобы быть надежным для профилирования [36-38]. Сравнивая анализ TLDA и результат микрочипов ткани, четыре микроРНК (микроРНК-26а, микроРНК-142-3p, микроРНК-148а и микроРНК-195) снижение в GC были выбраны.
<Р> В дальнейшем, мы определили четыре кандидатов микроРНК путем QRT-PCR в два этапа, и обнаружили, что уровни экспрессии четырех микроРНК в резко упал плазме больных ГЦ, которые находились в согласии с выражениями в тканях. ROC кривая, известная также как кривая чувствительности, получила широкое признание в качестве метода оценки диагностического теста. Кроме того, комплексный показатель, отражающий чувствительность и специфичность непрерывных переменных. В текущем исследовании, анализ показал, что РПЦ сочетание четырех микроРНК не было более эффективным, чем микроРНК-26а по отдельности. в одиночку MIR-26а может достичь хорошей диагностической эффективности в различении больных GC от здоровых с АУК 0,882 (чувствительность = 83,6% и специфичность = 81,5%). Предыдущее исследование Шнайдер и др
. отображается сывороточные уровни CEA, CA19-9 и CA72-4 в GC выяснены чувствительность 45,5% для CA19-9, 23,8% для КЭА и 60,7% для CA72-4 [39]. Они были гораздо меньше, чем чувствительность MIR-26а. Кроме того, уровень экспрессии микроРНК-26а в плазме был значительным ниже у пациентов GC и не показали никакого значения с прогрессированием GC (S3) Рис. Следовательно, микроРНК-26а имел большой потенциал в качестве диагностического плазмы биомаркера для GC.
<Р> В последние десятилетия, предыдущие исследования не подтвердили, что ли выражение микроРНК в плазме или сыворотке крови может представлять уровни ткани. По сравнению с этими исследованиями, наше исследование имело собственные функции по причинам, следующим образом. Во-первых, мы выбрали микроРНК, в которых выражалась дифференцированно как в ткани и плазме, сравнивая результаты двух микрочипов. Это привело к более широкие возможности для выявления осуществимых диагностических маркеров. Кроме того, мы обнаружили, что экспрессия микроРНК-26а значительно снижается у пациентов GC и оставалась стабильной в плазме (S3 рис).
<Р> Результаты показали, что экспрессия плазмы MIR-26а был значительным ниже у пациентов GC по сравнению со здоровыми управления ( P
&л; 0,05), который показал стабильность в GC больных с различными клиническими статусом. Понижающая регуляция экспрессии микроРНК-26а плазмы может указывать на вероятность диагностирования GC. Таким образом, микроРНК-26а может быть лучшим выбором, чтобы служить в качестве потенциального биомаркера для GC. Дэн и др
. показали, что уровни микроРНК-26а в GC тканях более заметно уменьшилось, чем в неопухолевых тканях QRT-PCR [40]. Они также показали, что микроРНК-26а ингибирует рост опухоли и метастазирование частично за счет ориентации FGF9
в естественных условиях. Они состояли с нашими результатами. Эти результаты подтвердили, что микроРНК-26а в плазме может быть потенциальным диагностическим маркером для GC.
<Р> Тем не менее, ограничения нашего исследования, что образцы для микрочипов ткани и для TLDA были не из одних и тех же пациентов, и наши размеры выборки для микрочипов были сравнительно небольшой. Дальнейший анализ микрочипов для одних и тех же пациентов, и подтверждение в увеличенном образца должны быть применены в качестве нового метода скрининга для GC в обычной клинической утилизации. Кроме того, мы не выбирали вверх регулируемых микроРНК из-за того, что там были не до регулируемых микроРНК, чьи складка изменения были ≥ 2. Мы выбрали кандидатов микроРНК, которые были обильно выраженные в плазме крови, чтобы убедиться, вероятности экспертизы в клинической практике.
Поддержка Информация
S1 данных. Экспериментальные протоколы микрочипов и QRT-PCR
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0151345.s001
(DOC)
S1 Рис. ROC кривая анализ комбинации двух микроРНК среди четырех кандидатов микроРНК.
Сочетание MIR-26а и MIR-142-3p (А), сочетание микроРНК-26а и микроРНК-148а (В), комбинация СИК-26а и микроРНК-195 (C), а также сочетание микроРНК-142-3p и микроРНК-148а (D), сочетание микроРНК-142-3p и MIR-195 (Е) и комбинация зер- 148а и микроРНК-195 (F) дает самые большие AUCs
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s002
(DOC)
S2 рис. ROC кривая анализ комбинации трех микроРНК среди четырех кандидатов микроРНК.
Сочетание MIR-26а, MIR-142-3p и микроРНК-148а (А), сочетание MIR-26а, микроРНК-142-3p и микроРНК-195 (B), сочетание MIR-26а, MIR-148а и микроРНК-195 (C) и сочетание MIR-142-3p, MIR-148а и микроРНК-195 (D) дает самые большие AUCs.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0151345.s003
(DOCX)
S3 рис. . Уровень в плазме MIR-26а в больных раком желудка, стратифицированных клинического состояния
Box участков показали плазменные уровни микроРНК-26а в 200 здоровых и 200 больных раком желудка при различных клинического состояния
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s004
(DOCX)
S1 Таблица. Клинические характеристики испытуемых тканей скрининга на человека Agilent микроРНК Microarray
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0151345.s005
(DOC)
S2 Таблица. Клинические характеристики плазменных субъектов скрининга по TLDA
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0151345.s006
(DOC)
<р> Мы глубоко признательны за участие все предметы, способствующие этому исследованию.
Растительная пища может передавать человеку устойчивые к антибиотикам супербактерии
Зачем мне нужна колоноскопия?
Бытовые дезинфицирующие средства могут повысить риск ожирения у детей
Основные моменты и ключевые выводы Бостонской конференции по бактериям 2019 г. (BBM)
Слизь в лейке для душа может содержать опасные легочные бактерии - исследование
Новая стратегия может усилить коммуникацию между кишечником и мозгом
Микробиомы кишечника и полости рта предсказывают тяжесть COVID-19
Один вопрос, который продолжает оставаться без ответа во время продолжающейся пандемии коронавирусного заболевания 2019 года (COVID-19), заключался в том, почему в тяжелом заболевании наблюдается четк
Антибиотик Х-206 эффективен против SARS-CoV-2 in vitro
Пандемия COVID-19 продолжает вызывать множество серьезных и смертельных случаев легочных заболеваний. часто заканчивается полиорганной дисфункцией и сердечно-сосудистым коллапсом. Без вакцины или пров
Кесарево сечение полезно для здоровья детей?
Недавнее исследование, опубликованное Институтом экономических исследований VATT, предполагает, что незапланированная CS, выполненная по показаниям, которых, возможно, можно было избежать, имеет причи