PLoS ONE: Tiltaget miR-204 i H. pylori-associeret mavekræft Fremmer Kræft Cell Proliferation og Invasion ved Målretning SOX4

Abstrakt

Baggrund

Den molekylære mekanisme mellem Helicobacter pylori (H. pylori) infektion og gastrisk cancer forblev stort set ukendt. I denne undersøgelse bestemt vi rollen som miRNA i H. pylori induceret mavekræft.

Metoder og Resultater

Vi fandt, at miR-204 blev reduceret i H. pylori positive væv ved qRT- PCR. Knockdown af MIR-204 forstærkede invasionen og proliferation evne gastriske cancerceller in vitro. Luciferase assay viste, at SOX4 var målgenet af MIR-204, der blev fundet opreguleret hos H. pylori positive væv. Nedregulering af miR-204 og overekspression af SOX4 fremmet epitelial-mesenkymale overgangsproces.

Konklusion

Tilsammen vores resultater viste, at miR-204 kan fungere som en tumor suppressor i H. pylori induceret gastrisk kræft ved at målrette SOX4

Henvisning:. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Nedsat miR-204 i H. pylori-associeret mavekræft Fremmer kræft Cell Proliferation og invasion ved Målretning SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10,1371 /journal.pone.0101457

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, USA

Modtaget: Marts 18, 2014 Accepteret: 5 juni 2014; Udgivet: Juli 1, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Guoxin Zhang blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (nr 81.270.476) (http://www.nsfc.gov.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform og anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Til dato har molekylære mekanismer på gastrisk cancer blevet undersøgt, har de dog ikke helt forstået [2]. Gastriske carcinomer formodes at udvikle sig efter en flertrinsproces af carcinogenese, som er stærkt forbundet med infektion med det bakterielle patogen, Helicobacter pylori
( H. Pylori
) [3]. H. pylori
, der koloniserer mave på 50% af verdens befolkning, er blevet klassificeret som et klasse I carcinogen grund af dets kausative rolle i udviklingen af ​​gastrisk cancer [4].

Det er blevet rapporteret at udviklingen og progressionen af ​​mavekræft kan tilskrives microRNA (miRNA) [5] - [8]. MiRNA er små, ikke-kodende RNA'er, der regulerer ekspressionen af ​​målgener ved translationel undertrykkelse eller messenger RNA (mRNA) nedbrydning [9]. MIR-204 afvigende ekspression blev rapporteret at associere med forskellige kræftformer [10], [11]. Men lidt om miRNA-204 funktion i mavekræft. Matsushima udført miRNA vifte studie i H. pylori positive væv og contols og fandt, at miR-204-ekspression var signifikant lavere i H. pylori positive væv [12].

Hos mennesker, sex-bestemmende region Y (SRY ) kasse familie, også henvist til SOX familien omfatter 20 højt konserverede transkriptionsfaktorer, der spiller vigtige roller i udviklingen af ​​prostatacancer [13]. Disse transskriptionsfaktorer er defineret af en konserveret signatur sekvens i høj mobilitet gruppe (HMG) DNA-bindende domæne (DBD) [14], [15]. SOX4 er en 47-kDa proteinet stærkt bevaret i hvirveldyr, og den kliniske betydning har fået stigende opmærksomhed i de senere år, med talrige rapporter tyder på, at SOX4 kan bidrage til tumorudvikling [16], [17]. Øget SOX4 ekspression findes i tumorer i blæren, prostata, og colon, og med ikke-småcellet tumorer [18] - [21]. Dereguleret ekspression af SOX4 er blevet korreleret med forøget cancercelleproliferation, celleoverlevelse, inhibering af apoptose og tumorprogression i gastrisk cancer [22]. Dens over-ekspression er også blevet relateret til dårlig prognose i klinikkerne og det er en markør til at forudsige resultatet af patienter med gastrisk cancer [23].

Men indtil for nylig, er det uklart, at uanset om H. pylori-infektion kan inducere SOX4 ekspression gennem nedregulere mIR-204. Således har vi udført vores undersøgelse for yderligere at undersøge den rolle, miR-204 og SOX4 i H. pylori induceret carcinogenese.

Materialer og metoder

kliniske prøver

Patienter med eller uden H. pylori
infektion havde gennemgået gastroscope på The First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University, Jiangsu-provinsen, Kina fra marts 2012 og december 2013. prøver taget fra de 250 patienter (150 noncancerous patienter og 100 tumor patienter) blev opsamlet, og blev identificeret positivt når hurtig urease test var positiv. Disse udvalgte patienter blev også bekræftet af ^{13C udåndingsluften. Noncancerous patienter blev klassificeret i overfladiske gastritis, atrofisk gastritis og dysplasi ifølge den patologiske klassifikation. Denne protokol blev godkendt af Etisk Komité første tilknyttede hospital af Nanjing Medical University, og hver patient havde skriftligt informeret samtykke.}

Cell kultur

SGC-7901 /MKN45 gastrisk cancer cellelinjer ( indkøbt fra ATCC) blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibico) og penicillin (100 U /ml). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO _2.

bakteriekultur og infektion model

H. pylori blev inokuleret i pladen og dyrket ved 37 ° C i en mikroaerofil atmosfære med 5% O _{2, 10% CO 2 og 85% N 2. Efter 3 dage blev den bakterielle resuspenderet i RPMI-1640-medium uden FBS og inficerede celler i en MOI på 100. Celler blev derefter høstet efter 48 timers infektion.}

Isolering af totalt RNA og kvantitativ RT-PCR

i alt RNA'er blev udvundet fra indsamlede væv og cellelinjer hjælp Trizol (Tarkara, Japan) og derefter både miRNA og mRNA blev revers transkriberet til cDNA. Revers transkription blev udført ved anvendelse af revers transkription kit (Takara, Japan). Ekspressionen af ​​modne miRNA og potentielle målgener blev målt ved QRT-PCR med SYBR Green PCR Kit (Takara) på Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System og human U6 RNA blev amplificeret som en intern kontrol. Den relative ekspression forhold af MIR-204 blev beregnet med 2 ^{-ΔΔCT metode. PCR reaktioner blev udført med følgende primere: til HSA-MIR-204, fremad, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'og for U6, fremad, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. Relative ekspressionsniveauer af SOX4 mRNA blev undersøgt ved SYBR Green real-time PCR (RT-PCR) og normaliseret til GAPDH. Primerne til SOX4 var fremadrettet, 5'AGCCATCTCGGAGGAATA 3 'og revers, 5' CAGACAACCGGCCTTTAT 3 '; og for GAPDH, fremad, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'og revers, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR blev udført ved anvendelse af ABI 7500 Fast Real-Time PCR-system (ABI, CA, USA).}

Immunhistokemi

Væv blev fikseret i 4% paraformaldehyd og skæres fra paraffin blok til 5 um tykkelse. Efter afvoksning med xylen og rehydratisering med en gradueret række af ethanol blev objektglassene opvarmes i autoklav i tre minutter under anvendelse af citrat natrium (pH 6,0) og inkuberet med antistoffet SOX4 (Cell signaling Technology) ved 4 ° C natten over. Blokering serum eller antistof fortyndingsbuffer blev anvendt som negative kontroller. De anvendte før antistoffer var de samme som for Western blot-analyse. Fotografier blev taget af microsope (Nikon, Eclipse 50i). Antallet af positive farvning af celler viser immunoreaktivitet af SOX4 i ti repræsentative mikroskopiske felter blev talt, og procentdelen af ​​positive celler blev også beregnet. Den procentvise scoring af immunoreaktive tumorceller blev beskrevet som følger: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), og 3 (> 50%). Intensiteten blev scoret som følger: 0 (negativ), 1 (svag), 2 (moderat) og 3 (kraftig). Ekspressionsniveauet af SOX4 blev målt ved at gange procentdelen og intensiteten score. Høj ekspression prøver betyder tumorer med en multipliceret score på over 4, mens de andre blev anset for at være lav ekspression.

Celleproliferation assasy

Celleproliferation blev undersøgt under anvendelse vandopløseligt tetrazoliumsalt under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). I korte, celler (1,5 x 10 ^{3 /brønd) blev podet i 96-brønds dyrkningsplader i tre eksemplarer og inkuberet i 4 dage ved 37 ° C /5% CO2 i en fugtig inkubator. Levedygtige celler blev kvantificeret ved hvert 24 timer interval ved at måle OD450 hjælp mikropladelæser. (Epoch, BioTek, Winooski, VT)}

Celler (2 × 10 ^{6) blev fikseret med 75% ethanol ved 4 ° C natten over og derefter vasket med koldt PBS og behandlet med RNaseI, efterfulgt af farvning med propidiumiodid i 30 minutter i mørke. Cellecyklusanalyse blev derefter udført ved flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, Sparks, MD).}

Celler blev trypsinbehandlet og udpladet på plader med 6 brønde (500 celler /brønd) og dyrket i 2 uger. Kolonierne blev farvet med 1% krystalviolet i 30 minutter efter fiksering med 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Antallet af kolonier, der defineres som > 50 celler /koloni blev talt. Der blev udført tre uafhængige forsøg. Dataene blev beregnet ved anvendelse parret t-test.

cellemigrationsassay (sårheling)

En sårhelende assay blev anvendt til at vurdere evnen af ​​tumorcellemotilitet. Kort beskrevet blev celler (1 * 10 ^{6 /brønd) blev podet i seks-brønds plader, dyrket natten over, og transficeret med MIR-204 efterligner eller inhibitor, pcDNA-SOX4 eller pcDNA-NC. På at nå konfluens, blev cellelaget ridset med en steril plastik spids og vasket derefter med dyrkningsmedium to gange og dyrket igen i op til 48 med serum-reduceret medium indeholdende 1% FBS. Kløften lukning blev målt, og dataene blev opsummeret baseret på sextuple analyser for hvert forsøg.}

Cell invasion assay

Cell invasion aktivitet blev vurderet ved hjælp af cellekultur indsatse belagt med basalmembran matrix (BD Biosciences , Bedford, MA) ifølge fabrikantens instruktioner. Kort fortalt blev i alt 1 x 105 celler i 0,2 ml serumfrit RPMI-1640 medium podet på en Transwell apparat. RPMI-1640 indeholdende 10% FBS (600 pi) blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubering af cellerne i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator blev cellerne på den øvre overflade af indsatsen fjernes ved aftørring med en vatpind. De celler, der invaderede til bundfladen af ​​insertet blev fikseret i 100% forkøling methanol i 30 minutter, farvet i 0,5% krystalviolet i 30 min, derefter skyllet i PBS og underkastet mikroskopisk inspektion. Celler blev talt under mikroskop i fem tilfældige felter og den relative invasion og migration blev fortolket som det gennemsnitlige antal celler ± standardafvigelse per felt.

Western blotting

Total proteiner blev fremstillet og kvantificeres ved hjælp af et protein assay (BCA-metoden, Thermo, USA). Proteiner blev fraktioneret ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) overført til polyvinyliden (PVDF) membran, blokeret i 5% tørmælk ved stuetemperatur i 1 time og immunfarvet med antistoffer ved 4 ° C natten over under anvendelse af anti-SOX4 ( 1:1000, CST, USA), anti-N-cadherin (1:1000, CST, USA) og anti-E-cadherin (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, sigma, USA) blev anvendt som en loading kontrol. Resultater blev visualiseret gennem et kemiluminescerende påvisningssystem (Pierce ECL Substrat Western blot-detektionssystemet, Thermo, Pittsburgh, PA) og derefter udsat i Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA).

Plasmidkonstruktion

Forudsigelse af miR-204 bindingssteder blev udført ved hjælp af Targetscan software (http://www.targetscan.org). 3'-UTR-sekvensen af ​​SOX4 som blev forudsagt til at interagere med MIR-204 eller en mutant sekvens med de forudsagte målsteder blev indsat i Kpnl- og Sacl-stederne i pGL3 promotor vektor (Invitrogen). De blev navngivet pGL3-SOX4 og pGL3-SOX4-mut. Cellerne blev udpladet på plader med 6 brønde og blev transficeret med 100 ng pGL3-SOX4 eller pGL3-SOX4-mut, og MIR-204 efterligner (50 nM) ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA). Vi normaliseret forskellene i transfektionseffektivitet ved co-transfektion af en Renilla luciferase vektor pRL-SV40 (5 ng).

SOX4 genet blev syntetiseret (indkøbt fra genscript, Piscataway, NJ) med restriktiv fordøjelse under anvendelse Mlu I og subklonet PLV-GFP plasmid, og navngivet PLV-GFP-SOX4. Rekombinant lentivirus blev genereret fra 293T-celler under anvendelse calciumphosphatpræcipitation. SGC-7901 cellelinier blev transfekteret med lentivirus hjælp polybren (8 ug /ml).

Luciferaseaktiviteter analyse Salg

Celler blev dyrket i plader med 24 brønde og transficeret med 0,2 ug af enten bred- type eller mutant PGL-SOX4 plasmid indeholdende ildflueluciferase, sammen med 0,01 ug af PGL-SOX4 vektor (Invitrogen) indeholdende renilla luciferase og 1 ug oligonukleotider. Transfektion blev udført ved anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Relativ luciferaseaktivitet blev beregnet 48 timer efter transfektion ved Dual Luciferase Reporter Assay (Promega). Alle transfektionsforsøg blev udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange uafhængigt af hinanden. Data er udtrykt som middelværdi ± SD.

Statistisk analyse

t-test eller envejs variansanalyse blev anvendt til statistisk analyse efter behov. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). En to-tailed værdi P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

MIR-204 er afvigende nedreguleret i H.. pylori
positive væv og celler

Ekspressionen af ​​udvalgte miRNA ifølge de foregående mikroarraydata blev påvist [10] i 75 par af H. pylori positive og negative normale væv, og 50 par H. pylori positive og negative tumorvæv ved real-time PCR. Vi fandt, at MIR-204 var en af ​​de mest betydningsfulde miRNA nedreguleres ved H. pylori infektion (figur S1A, figur 1A, B). Desuden blev MIR-204 udtrykt ved lavere niveauer i mere alvorlige gastritis (figur 1C). Vi yderligere sammenlignet dets ekspression i tumorvæv med normale væv, uanset H. pylori status og fandt, at MIR-204 blev udtrykt væsentligt lavere i tumorer (Figur S1B). Vi delte patienterne med tumor i henhold til forskellige TNM stadier og T2-T4 og M1 patienter udtrykte signifikant lavere miR-204 end T1 og M0 patienter (figur S1c, S1D). Vi undersøgte også MIR-204-ekspression i celler inficeret med H. pylori og vi fandt, at ekspressionen af ​​MIR-204 var signifikant lavere i flere H. pylori inficerede celler end kontrol (figur 1 D, fig S1E).

mIR-204 undertrykker migration /invasion og spredning af gastriske kræftceller i SGC-7901 og MKN-45 celler

Vi transficeret SGC7901 og MKN45 celler med HSA-miR-204 efterligner /inhibitor oligonukleotider og undersøgt virkningerne på cellulær proliferation og migration /invasion. For det første udførte vi QRT-PCR for at kontrollere effektiviteten af ​​transfektion, som angivet i fig. 2A, transfektion af celler med miR-204 efterligner /inhibitor viste øge /fald i miR-204-ekspression sammenlignet med deres negative kontrol (NC /INC). Sårheling assay viste, at overekspression af miR-204 kunne undertrykke celle migration, mens dens knockdown induceret cellemigration, med betydelig tættere mellemrum end kontrol (figur 2B). Konsekvent, Matrigel invasion assay viste også, at overekspression af miR-204 svækket celle invasion, mens knockdown af det kunne vende den hengivenhed (Figur 2C). Vi udførte også MTT assay og fandt, at væksten i celler transficeret med miR-204-hæmmer markant var steget i forhold til kontroller, mens celler med miR-204 efterligner blev viste forskellige (figur 3A, B). Vi undersøgte også, om cellecyklus ville blive påvirket af knockdown /overekspression af miR-204 ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse af propidium-iodid-farvede celler. Knockdown af miR-204 resulterede i en signifikant stigning i procentdelen af ​​celler i G2 faserne mens overekspression viste den modsatte effekt (figur 3C). Kolonidannelse assays viste, at inhibering af MIR-204 signifikant forøget væksthastigheden af ​​cellelinier (figur 3D). Vi sammenlignede også cellefunktioner til transfektion med MIR-204 efterligner med efterligninger og H. pylori-infektion. Vi fandt, at MIR-204 efterligner kunne undertrykke cellemigration, invasion og proliferation ved H. pylori infektion (figur S2). Disse resultater viste sammen at nedregulering af MIR-204 induceres af H. pylori-infektion fremme migration /invasion og proliferation af mavens cancercellelinie in vitro.

MIR-204 opreguleret SOX4 ekspression i gastrisk cancer

Vi identificerede de nedstrøms mål for miR-204 af beregningsmæssige forudsigelse at belyse de mekanismer, som miR-204 undertrykt mavekræft celle invasion. Blandt hundredvis af gener forudsagt af online miRNA target forudsigelse hjemmeside (starbase, http://starbase.sysu.edu.cn/), forcused vi vores opmærksomhed på SOX4. SOX4 var blevet rapporteret til at regulere mavekræft progression og EMT eller fungere som en underliggende funktionelle mål for miR-204. For at identificere forudsigelsen, gennem QRT-PCR og immunhistokemi, fandt vi, at SOX4 var opreguleret i H. pylori positive væv. Dens udtryk var også højere i KAG end CG i H. pylori positive væv. (N = 75, p < 0,05; Figur 4A-C), der omvendt var korreleret med MIR-204. Brug af Pearsons korrelationsanalyse af SOX4-MIR-204 mRNA-ekspression, opnåede vi en statistisk signifikant omvendt korrelation (fig S3A, R = -0,849, p = 0,002). Brug af immunhistokemi, vi opdagede også, at SOX4 ekspression blev signifikant associeret med gastrisk histologi (p < 0,05; tabel 1). In vitro, vi også fundet, at SOX4 mRNA og proteinniveauet blev opreguleret i gastrisk cancer celler inficeret med H. pylori (figur S3B, S3C). Vi derefter bestemmes ekspressionen af ​​SOX4 som reaktion på ændringerne i MIR-204-ekspression. Western blot og QRT-PCR-assays viste, at overekspression af MIR-204 kunne signifikant nedregulere mRNA og protein ekspression af SOX4, mens effekten af ​​knockdown af MIR-204 var modsat (figur 3D). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​EMT markører, N-cadherin og E-cadherin, blev også ændret relateret til MIR-204-ekspression (figur 4E), som antydede, at MIR-204 kunne påvirke EMT-processen.

SOX4 er en direkte målgen af ​​mIR-204 i gastriske cancerceller

Selvom SOX4 er blevet betragtet som et direkte mål for mIR-204, er det uklart, om mIR-204 direkte kan genkende 3'-UTR af SOX4 mRNA. Ifølge den forudsagte målsted fra Targetscan, klonede vi 3'-UTR fragment indeholdende forudsagte-sted i pGL3 luciferase reporter vektor (pGL3-SOX4). 3'-UTR fragment med muterede sekvens inden for den forudsagte målsted blev også klonet som en kontrol (pGL3-SOX4-mut). Resultaterne viste, at co-transfektion med MIR-204 efterligner og pGL3-SOX4 vektor faldt luciferaseaktivitet i SGC-7901 celler. Desværre fik MIR-204 efterligner ikke den virkning på luciferaseaktivitet, når cellerne blev transficeret med pGL3-SOX4-mut vektor (figur 5). Disse data antydede, at SOX4 gen var en af ​​de direkte mål for miR-204.

Over-ekspressionen af ​​SOX4 har den virkning, miR-204 om gastriske kræftceller invasion

For at bestemme SOX4 som den funktionelle effektor af miR-204 i gastrisk invasion kræft, vi overudtrykt SOX4 ved transfektion med lentivirus og undersøgt dens virkninger i gastriske cancerceller. Over-ekspression af SOX4 i cellelinjen blev bekræftet ved Western blotting (figur 6A). Vi fandt også, at E-cadherin blev nedreguleret mens N-cadherin var opreguleret efter PLV-SOX4 transfektion. Gennem sårheling og Matrigel invasion assay, så opdagede vi, at overekspression af SOX4 fremmes signifikant celler migration og invasion (figur 6B og 6C). For yderligere at demonstrere, at MIR-204 inducerede tab af SOX4 undertrykt proliferation og invasion af gastriske cancerceller blev celler transficeret med MIR-204 efterligner og SOX4 over-ekspressionsvektoren sammen og resultaterne viste, at undertrykkelsen af ​​migration, invasion og spredning af miR-204 blev svækket (figur S4).

diskussion

mavekræft er en verdensomspændende sygdom med en høj forekomst, især i Sydøstasien [21]. Den 5-årige overlevelsesrate for mavekræft er ganske lav. Nogle af de mavecancerpatienter var H. pylori relateret. Derfor er det nødvendigt at foretage en grundig undersøgelse af patogenese og udvikle nye målrettede behandlinger for H. pylori relateret mavekræft.

miRNA er en stor familie af gen regulatorer, der negativt regulerer deres mål mRNA i en sekvens-specifik måde. miRNA kan også fungere som tumor undertrykkere eller onkogener [22]. De seneste oplysninger foreslog, at miRNA spiller væsentlige roller i flere biologiske processer i forbindelse med kræft, herunder celledifferentiering, proliferation, tumorignesis, angiogenese, invasion og metastase [23]. MIR-204 er blevet rapporteret til at fungere som en tumorsuppressor og lavt niveau ekspression af MIR-204 er forbundet med en dårlig prognostisk fænotype hos patienter med cancer [24], [25]. Men var der få studier undersøger miR-204 funktion i H. pylori relateret mavekræft. Her var vi de første til at fremlægge dokumentation for, at miR-204 var signifikant nedreguleret i H. pylori positive væv (normale og tumorvæv), og at overekspression af miR-204 undertrykt SOX4 protein-ekspression og væksten af ​​celler afledt fra gastrisk tumor.

vi kvantificeret først udtryk for miR-204 i H. pylori-infektion væv og kontroller, og vi fandt, at miR-204 udtryk er betydeligt lavere i H. Pylori inficerede patienter. Vi fandt også, at udtrykket er relateret til histologi af patienterne, dvs. ekspressionen af ​​MIR-204 er betydeligt lavere i H. pylori-positive patienter med kronisk atrofisk gastritis end kronisk ikke-atrofisk gastritis. Dette ekspressionsmønster viste, at muligheden for, at MIR-204 er relateret til forskellige former for gastritis og mere alvorlige patienterne var, jo lavere ekspression af MIR-204 var. Baseret på MIR-204 ekspressionsniveauet, vi valgte SGC-7901 og MKN45 celler til efterfølgende henholdsvis gain-of-funktion og tab af funktion studier. Resultaterne antyder, at nedregulering af MIR-204 i gastrisk cancer celle er relateret til dens progression. Selv om et stort antal humane miRNA er blevet rapporteret, mange af deres mRNA-mål forbliver uidentificeret [9]. I denne undersøgelse, brugte vi en kombineret bioinformatik og eksperimenterende tilgang til at identificere, at SOX4 er den funktionelle nedstrøms mål for miR-204.

SOX4 er over-udtrykt i forskellige kræftformer og var tæt korreleret med tumor invasion og metastase [ ,,,0],16] - [19]. Det er også et af medlemmerne af EMT-transkriptionel induktorer [26]. EMT er en vigtig udviklingsmæssig program, der ofte aktiveret under cancer progression og kan fremme resistens over for terapi [27]. Zhang et al [20] viste, at overekspression af SOX4 i humane mammae epitelceller førte til erhvervelse af mesenchymale træk, og øget cellemigration og invasion. Endvidere SOX4 reguleres positivt ekspressionen af ​​kendte EMT induktorer og aktiveret TGF-β-vejen for at bidrage til EMT [28]. Til dato, EMT er et attraktivt mål for terapeutiske indgreb, giver et nyt grundlag for udviklingen af ​​karcinom i retning dedifferentierede og flere maligne tilstande [29]. Vores undersøgelse først viste, at H. pylori-infektion induceret miR-204 nedregulering kunne føre til gastrisk kræft ved EMT-processen.

For at konkludere, angivet vores dokumentation for, at miR-204 blev nedreguleret, mens SOX4 var op- reguleret i H. Pylori-infektion og gastrisk cancer. Ektopisk MIR-204-ekspression faldt SOX4 ekspression på mRNA- og proteinniveau i gastrisk cancercellelinie. Vi viste også, at MIR-204 var direkte bundet til 3'-UTR af SOX4. MIR-204-ekspression inhiberes EMT via undertrykkelse af SOX4. Endvidere kan miR-204-EMT vej, som vi identificeret udnyttes i en terapeutisk tilgang til behandling af H. pylori relaterede kræftformer.

Støtte Information
Figur S1.
(A) Ekspressionen af ​​5 miRNA i H pylori positive og negative væv blev påvist ved QRT-PCR. (B) Ekspressionsniveauerne for miR-204 i tumor og kontrol væv. (C) Ekspressionsniveauerne af MIR-204 ifølge TNM stadier. (D) Ekspressionsniveauet af MIR-204 i tre slags H. pylori inficerede celler. (* P < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF)
Figur S2. Salg Celler transficeret med MIR-204 efterligner og efterligner med H. pylori-infektion og (A) levedygtigheder blev bestemt med CCK-8 assay (B) Billederne fotograferet ved 0 timer (øvre) og 24 timer (lavere) efter sårdannelse blev vist ved forstørrelse på x200 (C) de repræsentative billeder af invasive celler i bunden af ​​membranen farvet med krystalviolet blev visualiseret som vist. (* P < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s002
(TIF)
Figur S3.
(A) Den relative mRNA-ekspression af MIR-204 og SOX4, normaliseret med U6 og GAPDH, blev vurderet i 15 enheder af H. pylori positive og negative væv ved QRT-PCR. (B) en omvendt korrelation af SOX4 og MIR-204 ekspressionsniveauer blev undersøgt (R = -0,920, p = 0,001). (C) Ekspressionen af ​​SOX4 mRNA blev bestemt ved QRT-PCR i H. pylori inficerede celler. (D) Ekspressionen af ​​SOX4 proteinniveau blev bestemt ved western blot i H. pylori inficerede celler. (* P < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s003
(TIF)
Figur S4. Salg Celler transficeret med MIR-204 efterligner og efterligner med PLV-SOX4 og (A) levedygtigheder blev bestemt med CCK-8 assay (B) De repræsentative billeder af invasive celler i bunden af ​​membranen farvet med krystalviolet blev visualiseret som vist. (C) Billederne fotograferet ved 0 timer (øvre) og 24 timer (lavere) efter sårdannelse blev vist ved forstørrelse på x200 (* p < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)

• PLoS ONE: Er tumorstørrelse forbedre nøjagtigheden af ​​Prognostiske Forudsigelser i Node-Negative Gastric Cancer (pT1-4aN0M0 Stage)
• PLoS ONE: D-Dimer: Ikke blot en indikator for venetrombose, men en Predictor af Asymptomatisk hæmatogen Metastase i Gastric kræftpatienter