PLoS ONE: sumažėjęs MIR-204 į H. pylori susijusių skrandžio vėžio Skatina vėžio ląstelių proliferaciją ir invazija Nukreipimas SOX4

Anotacija

Fonas

molekulinė mechanizmas tarp Helicobacter pylori (H. pylori) infekcijos ir skrandžio vėžio liko beveik nežinomi. Šiame tyrime mes lėmė Mirna vaidmenį H. pylori sukelta skrandžio vėžiu.

Metodai ir rezultatai

Mes nustatėme, kad Pasaulis-204 buvo sumažėjo H. pylori teigiamų audiniuose qRT- PGR. Nokdaunas miR-204 sustiprintas invazija ir platinimo galimybes skrandžio vėžio ląsteles in vitro. Liuciferazės tyrimas parodė, kad SOX4 buvo tikslinio geno miR-204, kuri buvo nustatyta iki-reguliuojamas H. pylori teigiamų audinius. Žemyn reguliavimo PPN-204 ir per išraiška SOX4 skatinamas epitelio-mezenchiminių pereinamąjį procesą.

Išvada

Kartu paėmus, mūsų išvados parodė, kad Pasaulis-204, gali veikti kaip naviko slopintuvas į H. pylori sukelta skrandžio vėžio nukreipiant SOX4

nurodomoji dalis:. Zhou x Li L, S J Zhang G (2014) Sumažėjęs MIR-204 į H. pylori susijusių skrandžio vėžio Skatina vėžio ląstelių proliferaciją ir invazija nukreipiant SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. Doi: 10,1371 /journal.pone.0101457

redaktorius: Jin K. Cheng H.Lee Moffitt Vėžys centras "& Tyrimų institutas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Kovo 18, 2014; Priėmė: Birželis 5, 2014 m Paskelbta liepos 1, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Zhou et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

Finansavimas:. Guoxin Zhang finansavo Nacionalinis gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.270.476) (http://www.nsfc.gov.cn/). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1]. Iki šiol buvo tiriami molekuliniai mechanizmai skrandžio vėžio, tačiau jie nėra visiškai suprantama [2]. Skrandžio karcinomos kurie turėtų parengti atsižvelgiant į daugiapakopį procesą kancerogenezėje, kuris yra stipriai susijusios su infekcija patogenines bakterijas, Helicobacter pylori
( h. Pylori
) [3]. h. pylori
, kuri kolonizuoja 50% pasaulio gyventojų skrandį, buvo klasifikuojamas kaip I klasės kancerogenu, nes jos priežastinio vaidmens skrandžio vėžio [4] plėtrai.

Buvo pranešta, kad vystymasis ir progresas skrandžio vėžio gali būti priskirtas prie mikro RNR (miRNAs) [5] - [8]. MiRNAs yra maži, ne kodavimo RNR, reguliuojantys tikslinių genų ekspresiją per pritaikymo represijoms ar RNR (iRNR) degradacija [9]. MIR-204 netipinė išraiška buvo pranešta susieti su įvairiomis vėžio [10], [11]. Tačiau mažai žinoma apie Mirna-204 funkcijos skrandžio vėžio. Matsushima atliekamas Mirna masyvo tyrimas H. pylori teigiamų audinius ir contols ir nustatė, kad Pasaulis-204 išraiška buvo žymiai mažesnis, H. pylori teigiamų audinius [12].

žmonėms, sekso nustatantys regionas Y (SRY ) langelis šeima, taip pat nurodė, SOX šeimoje, sudaro 20 labai konservatyvūs transkripcijos faktorius, kurie vaidina svarbų vaidmenį prostatos vėžio [13] plėtrai. Šie transkripcijos veiksniai apibrėžiami pagal konservatyvią parašo seka aukštos mobilumo grupė (HMG) DNR surišantis domenas (DBD) [14], [15]. SOX4 yra 47-kDa baltymas yra labai užkonservuotas stuburinių ir jos klinikinė reikšmė įgijo vis daugiau dėmesio pastaraisiais metais, su daugybe ataskaitų rodo, kad SOX4 gali prisidėti prie naviko progresavimo [16], [17]. Padidėjo SOX4 išraiška yra rasti navikų šlapimo pūslės, prostatos, ir storosios žarnos, ir su nesmulkiųjų ląstelių plaučių navikų [18] - [21]. Nereguliuojamoje išraiška SOX4 buvo susijęs su padidinta vėžinių ląstelių proliferaciją, ląstelių išlikimo slopinimas apoptozės ir naviko progresavimas skrandžio vėžio [22]. Jos per išraiška taip pat buvo susiję su blogos prognozės klinikose ir tai yra žymeklis prognozuoti pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu [23] rezultatus.

Tačiau iki šiol neaišku, kad tai, ar H. Helicobacter pylori infekcija gali sukelti SOX4 išraišką per apačią, reglamentuojančių MIR-204. Taigi, mes atliekame mūsų studiją toliau tirti PPN-204 vaidmenį ir SOX4 H. pylori sukeltos kancerogenezės.

Medžiagos ir metodai

klinikinius mėginius

Pacientai arba be H. pylori
infekcija buvo atlikta gastroscope pirmajame filialas ligoninės Nanjing medicinos universiteto, Jiangsu Province, Kinija nuo 2012 kovo iki gruodžio 2013 mėginių, paimtų iš 250 pacientų (150 noncancerous pacientai ir 100 naviko pacientų) buvo surinkti, ir buvo nustatyta teigiamas, kai greitas ureazės testas buvo teigiamas. Šie atrinkti pacientai taip pat patvirtino ^{13C iškvepiamo oro testu. Noncancerous pacientai buvo suskirstyti į paviršutiniškai gastritas, atrofinį gastritas ir displazija pagal patologinio klasifikacija. Šis protokolas buvo patvirtintas Etikos komiteto pirmasis filialas ligoninėje Nanjing medicinos universitete, kiekvienas pacientas buvo parašyta informuoto sutikimo.}

Mobilusis Kultūra

SGC-7901 /MKN45 skrandžio vėžio ląstelių linijas ( įsigyti iš ATCC) buvo auginamos RPMI-1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Gibico) ir penicilino V (100 V /ml). Ląstelės buvo auginamos 37 ° C drėgnoje atmosferoje 5% CO _2.

bakterijų kultūros ir infekcija modelis

H. pylori buvo inokuliuojamas į plokštės ir kultivuojamos 37 ° C temperatūroje, microaerophilic atmosferoje su 5% O _{2, 10% CO 2 ir 85% N 2. Po 3 dienų, bakterijų buvo resuspenduota RPMI-1640 terpėje be FBS ir užkrėsti ląsteles 100. Cells MOI tada buvo nuimta po 48 val infekcijos.}

Izoliacija visos RNR ir kiekybinė RT-PGR

iš viso RNR buvo paimti iš surinktų audinių ir ląstelių linijų, naudojančių Trizol (Tarkara, Japonija) ir tada abu Mirna ir iRNR buvo atvirkštinis transponuoti į kDNR. Atvirkštinio transkripcijos buvo atlikta naudojant atvirkštinę transkripciją komplektas (TAKARA, Japonija). Brandžios miRNAs ir potencialių tikslinių genų išraiška buvo matuojamas KRL-PGR su SYBR Žalioji PGR rinkinys (Takara) dėl Applied Biosystems StepOne plius realiojo laiko PGR sistema ir žmogaus U6 RNR buvo papildyta kaip vidaus kontrolė. Santykinis išraiška santykis miR-204 buvo apskaičiuojamas pagal 2 ^{-ΔΔCT metodu. PGR reakcijos buvo atliktas su šių gruntų: už HSA-miR-204, į priekį, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'ir U6, į priekį, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ". Santykiniai ekspresijos lygis SOX4 mRNR išnagrinėjo SYBR Green realiojo laiko PGR (RT-PCR) ir normalizuotas GAPDH. Už SOX4 pradmenys buvo į priekį, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3 "ir atbulinės eigos, 5' CAGACAACCGGCCTTTAT 3"; ir GAPDH, į priekį, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'ir atbulinės eigos, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. AT-PGR buvo atliekama naudojant ABI 7500 Greitas realiojo laiko PGR sistema (ABI, CA, JAV).}

imunohistocheminis

audiniai buvo nustatytas 4% paraformaldehido ir išpjauti iš parafino bloko 5 mkm storio. Po to, kai deparafinavimo su ksileno ir Rehidratacija su žymėtą serijos etanolio, skaidres buvo kaitinamas autoklave tris minutes, naudojant citrato natrio buferio (pH 6,0) ir inkubuojama su antikūnų SOX4 (Cell signalizacijos technologija), esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Blokuoja serumo arba antigeną rišantis antikūno praskiedimo buferis buvo naudojamas kaip neigiamos kontrolės. Panaudotus prieš antikūnai buvo toks pats kaip ir Vakarų blot analizė. Fotografijos ėmėsi microsope ( "Nikon Eclipse 50i). buvo skaičiuojami teigiamų dažymo ląstelių rodomi reaktyvumas iš SOX4 dešimt atstovybių mikroskopinių laukų skaičius, o teigiamų ląstelių procentas taip pat buvo apskaičiuotas. Procentinė atsakomają iš imunoreaktyviųjų vėžinių ląstelių buvo aprašytas taip: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), ir 3 (> 50%). Intensyvumas pelnytas taip: 0 (neigiamas), 1 (silpnas), 2 (vidutinio sunkumo), ir 3 (stiprus). Sąvoka lygis SOX4 buvo matuojamas procentais dauginant ir intensyvumo balas. Aukštos raiškos pavyzdžiai reiškia navikai su dauginama rezultatas didesnis kaip 4, o kiti buvo laikomi žemos išraiška.

ląstelių proliferacija assasy

ląstelių proliferacija buvo tiriama naudojant vandenyje tirpią tetrazolio druskos tyrimą naudojant ląstelių skaičiavimas KIT-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonija). Trumpai tariant, ląstelių (1,5 × 10 ^{3 /duobutėje) buvo pasėjamos į 96-šulinėlių auginimo plokščių tris kartus ir inkubuojami 4 dienas 37 ° C /5% CO2 į drėgnoje inkubatoriuje. Matomų ląstelių buvo kiekybiškai kiekvieną 24 h intervalu matuojant OD450 naudojant microplate skaitytuvą. (Epochos BioTek, WINOOSKI VT)}

Ląstelės (2 × 10 ^{6) buvo nustatytas 75% etanolio yra 4 ° C temperatūroje per naktį ir tada nuplauti šaltu PBS ir apdorojimo su RNaseI, po nudažant propidiumo jodido 30 min tamsoje. tada ląstelės ciklo analizė buvo atliekama tėkmės citometrijos (FACSCalibur; Becton Dickinson, kibirkštys, MD).}

Ląstelės buvo tripsinizuojamos ir padengtas ant 6-duobučių lėkštelėse (500 ląstelių /gerai) ir kultūringas 2 savaites. Bičių buvo tamsintas su 1% violetinei 30 min po įrašymo su 4% paraformaldehido 30 minučių. Kolonijų, kurios apibrėžiamos kaip >skaičius; buvo skaičiuojami 50 ląstelių /koloniją. Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai. Duomenys buvo apskaičiuojami naudojant suporuotas t testą.

Mobilusis migracijos tyrimas (žaizdų gijimą)

žaizdų gijimo analizė buvo naudojama, siekiant įvertinti naviko ląstelių judrumui galimybes. Trumpai tariant, ląstelės (1 * 10 ^{6 /gerai), buvo pasėjamos į šešių duobučių lėkštelėse, išauginti per naktį, ir transfektuotose Pasaulis-204 imituoja arba inhibitorių, pcDNR-SOX4 arba pcDNR-NC. Pasiekus santaką, ląstelių sluoksnis buvo subraižyti sterilų plastikinį viršūnės ir perplaunami mitybinės terpės du kartus ir kultivuojamos vėl iki 48 su serumo sumažintas terpėje, turinčioje 1% FBS. Atotrūkis uždarymas buvo matuojamas ir duomenys buvo apibendrinti remiantis Sextuple tyrimus kiekvienam eksperimentui.}

Mobilusis invazija tyrimas

Mobilusis invazija veikla buvo vertinama naudojant ląstelių kultūrą įdėklai padengtas pamatinės membranos matricos (BD biomokslai Bedford, MA), pagal gamintojo nurodymus. Trumpai tariant, iš 1 × 105 ląstelių, kad bendras 0,2 ml serumo neturinčioje RPMI-1640 terpėje buvo pasėjamos ant Transwell aparatą. RPMI-1640, kurių sudėtyje yra 10% FBS (600 pL) buvo įtraukta į apatinę kamerą. Taip inkubacija 24 h ląstelių esant 37 ° C temperatūroje, 5% CO2 inkubatoriuje, ląstelės dėl viršutinio paviršiaus intarpo buvo pašalintas nušluostydami su medvilnės tamponu. Ląstelės, kurios įsiveržė į apatinio paviršiaus intarpo buvo nustatomas atsižvelgiant į 100% iš anksto-aušinimo metanolio 30 min, nudažomi 0,5% violetinei 30 min, po to nuplauti PBS ir mikroskopiškai patikrinimą. Ląstelės buvo skaičiuojami pagal mikroskopu penkių atsitiktinių laukų ir santykinis invazija ir migracija buvo aiškinama kaip vidutinis ląstelių skaičių ± standartinis nuokrypis per lauką.

rengė imunoblotingu

Iš viso baltymai ir kiekybiškai naudojant baltymas analizė (BCA metodas Thermo, JAV). Baltymai buvo frakcionuotas natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės (SDS-PAGE) perkeliamas į polivinilideno fluorido (PVDF) membranos, užblokuotas 5% sausųjų pieno kambario temperatūroje 1 valandą ir immunostained su antikūnų, esant 4 ° C temperatūroje per naktį, naudojant anti-SOX4 ( 1:1000 CST, JAV), anti-N-cad (1:1000 CST, JAV) ir anti-E-cad (1:1000 CST, JAV). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, JAV) buvo naudojamas kaip krovimo valdymu. Rezultatai buvo ryškinamos per cheminės liuminescencijos aptikimo sistemos (Pierce "ECL Substratas Vakarų dėmė aptikimo sistema," Thermo, Pitsburgas, PA) ir po to paveikiami Molekulinės Rodymo ChemiDoc XRS sistemos (Bio-Rad, Hercules, CA).

plazmidžių statybos

Prognozė Pasaulis-204 jungimosi vietų buvo atliekama naudojant TargetScan programinė įranga (http://www.targetscan.org). 3'-UTR seka SOX4 kuri buvo prognozuojama bendrauti su miR-204 arba mutantas seka su numatomą taikinio vietų buvo įtraukta į Knpl ir SACI svetainėse pGL3 promotoriaus vektoriaus (INVITROGEN). Jie buvo pavadinti pGL3-SOX4 ir pGL3-SOX4-Mut. Ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse ir buvo pernešta su 100 ng pGL3-SOX4 ar pGL3-SOX4-Mut ir Pasaulis-204 imituoja (50 nm), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, JAV). Mes normalizuoti į transfekciją efektyvumo skirtumus, bendrai pernešimo Renilla liuciferazės vektorių PRL-SV40 (5 ng).

SOX4 genas buvo susintetinti (perkamos iš Genscript, Piscataway, NJ) su ribojamojo virškinimo naudojant Mlu I ir subklonuotas PLV-GFP plazmidės, ir pavadino PLV-GFP-SOX4. Rekombinantinis lentivirus buvo gautos iš 293T ląstelių naudojant kalcio fosfato kritulių. SGC-7901 ląstelių linijos buvo transfekuota su lentivirus naudojant polibrenui (8 ug /ml).

liuciferazės veikla analizė

Ląstelės buvo auginamos 24-duobučių lėkštelėse ir transfekuota su 0,2 mikrogramų arba plataus tipo ar mutantas PGL-SOX4 plazmidės sudėtyje yra Firefly luciferase kartu su 0,01 mikrogramų iš PGL-SOX4 vektoriaus (Invitrogen), kuriame renilla liuciferazės ir 1 mikrogramų oligonukleotidų. Transfekcijq buvo atliekama naudojant Lipofectamine 2000 reagento (Invitrogen). Santykinis liuciferazė veikla buvo apskaičiuojamas 48 valandas po transfekcijq kurį Dual liuciferazės reporterio testą (Promega). Visi transfekciją eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir kartojamas tris kartus savarankiškai. Duomenys išreikštas vidurkis ± SD.

Statistinė analizė

Stjudento t-testas arba į vieną pusę dispersinė analizė buvo naudojama statistinė analizė, jei reikia. Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 17.0 (SPSS, Čikaga, IL). Dviejų-tailed vertė P < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

MIR-204 yra nenormaliai žemyn reguliuojama H.. pylori
teigiami audiniai ir ląstelės

pasirinktų miRNAs išraiška pagal ankstesnius microarray duomenų [10] buvo aptikta 75 porų H. pylori teigiamus ir neigiamus normalius audinius, o 50 porų H. pylori teigiamas ir neigiami navikų audiniuose, realaus laiko PGR. Mes nustatėme, kad Pasaulis-204 buvo vienas iš svarbiausių miRNAs žemyn reguliuojamų nuo H. pylori infekcijos (S1A pav 1A pav B). Be to, PPN-204 buvo išreikštas žemesniuose lygmenyse Sunkesniais gastritas (1c pav). Mes taip pat palyginti savo išraišką navikų audiniuose su sveikų audinių, nepriklausomai nuo H. pylori statusą ir nustatė, kad Pasaulis-204 buvo išreikštas žymiai mažesnis navikų (S1B pav). Mes suskirstyti pacientus su naviko pagal skirtingus TNM etapus ir T2 ir T4 M1 pacientų išreiškė gerokai mažesnę MIR-204, nei T1 ir M0 pacientų (pav S1C, S1D). Mes taip pat išnagrinėjo Pasaulis-204 išraišką užsikrėtę H. pylori ląsteles ir mes nustatėme, kad miR-204 išraiška buvo žymiai mažesnis kelių H. pylori infekuotų ląstelių, nei kontrolės (pav 1D, S1E pav.)

MIR-204 slopina migracijos /invaziją ir proliferaciją skrandžio vėžio ląstelių SGC-7901 ir MKN-45 ląstelių

transfekuotos SGC7901 ir MKN45 ląsteles HSA-Pasaulis-204 mimikos /inhibitorių oligonukleotidų ir išnagrinėjo poveikį ląstelių proliferacija ir migracija /invazijos. Pirma, mes atliekamas KRL-PGR patikrinti transfekciją veiksmingumą, kaip nurodyta pav. 2A, transfekcija ląstelių su Pasaulis-204 imituoja /inhibitorių parodė gerokai padidinti miR-204 išraiškos /sumažėjimas, palyginti su jų neigiamos kontrolės (NK /INC). Žaizdų gijimą tyrimą paaiškėjo, kad per išraiškos PPN-204 gali slopinti ląstelių migraciją, o jo triuškinantis sukelta ląstelių migraciją, su gerokai arčiau tarpo nei kontrolės (2b pav.) Nuosekliai, Matrigel invazija tyrimas taip pat parodė, kad per išraiškos PPN-204 susilpnintas ląstelių invaziją, o triuškinantis tai gali pakeisti meilės (2c pav.) Mes taip pat atliekamas MTT ir nustatė, kad augimo tempas ląstelių transfektuotose Pasaulis-204 inhibitoriaus kiekis buvo daug didesnis, palyginti su kontroline grupe, o ląstelės su Pasaulis-204 imituoja buvo parodė, kad skiriasi (3A pav B). Mes taip pat išnagrinėjo, ar ląstelės ciklo būtų paveikti triuškinantis /per išraiškos PPN-204, naudojant fluorescencijos aktyvuota ląstelių rūšiavimo (FACS) analizė propidiumo jodidus-tamsintas ląsteles. Nokdaunas miR-204 lėmė gerokai padidinti ląstelių į G2 etapais procentais, o per išraiška parodė priešingą poveikį (3C pav.) Colony formavimo tyrimai parodė, kad slopinimas miR-204 žymiai padidino augimo tempą ląstelių linijas (3D pav.) Mes taip pat palyginti mobiliuosius funkcijas transfekuoja su Pasaulis-204 imituoja su imituoja ir H. pylori infekcija. Mes nustatėme, kad Pasaulis-204 imituoja gali slopinti ląstelių migracija, invazija ir proliferaciją ant H. pylori infekcijos (S2 pav.) Šie rezultatai parodė, kad kartu žemyn reguliavimo PPN-204 H. pylori infekcijos sukelta skatinti migracijos /invaziją ir proliferaciją skrandžio vėžio ląstelių linijos in vitro.

MIR-204 up-reguliuojama SOX4 raiškos skrandžio vėžio

nustatė tolesnius tikslus PPN-204 skaitiniu prognozavimas išsiaiškinti mechanizmus, kuriais Pasaulis-204 sumažėjusi skrandžio vėžio ląstelių invaziją. Tarp šimtų genų prognozavo internetinėje Mirna tikslas prognozavimo svetainėje (Starbase, http://starbase.sysu.edu.cn/~~HEAD=pobj), mes forcused mūsų dėmesį į SOX4. SOX4 buvo pranešta reguliuoti skrandžio vėžio progresavimą ir EMT arba veikti kaip pagrindinės funkcinės tikslą PPN-204. Norėdami nustatyti prognozę, per KRL-PGR ir imunohistocheminiu, mes nustatėme, kad SOX4 buvo reguliuojama H pylori teigiamų audinius. Jo išraiška taip pat buvo didesnis CAG nei CG į H. pylori teigiamų audinius. (N = 75, p < 0,05; 4A-C pav), kuris buvo atvirkščiai koreliuoja su miR-204. Naudojant Pearsono koreliacijos analizę SOX4-Pasaulis-204 iRNR išraiškos, gavome statistiškai reikšmingą atvirkštinę koreliaciją (S3A pav, R = -0.849, p = 0,002). Naudojant imunohistocheminis, mes taip pat atrado, kad SOX4 išraiška buvo reikšmingai susijęs su skrandžio histologiją (p < 0,05; 1 lentelę). In vitro, mes taip pat nustatė, kad SOX4 iRNR ir baltymų lygis buvo iki reguliuojama skrandžio vėžio ląstelių, užkrėstų H. pylori (pav S3B, S3C). Mes tada lėmė SOX4 išraišką atsako į Pasaulis-204 raiškos pokyčius. Western Blot ir KRL-PGR parodė, kad per-išraiškos miR-204 gali reikšmingai mažina reguliuoti mRNR ir baltymų ekspresijai SOX4, o triuškinantis miR-204 poveikis buvo priešingas (3D pav). Mes taip pat nustatė, kad EMT žymekliai, N-cad ir E-cad išraiška, taip pat buvo pakeistas susijusios miR-204 raiškos (4E paveikslas), kurie leidžia manyti, kad Pasaulis-204 gali turėti įtakos EMT procesą.

SOX4 yra tiesioginis taikinys genas miR-204 skrandžio vėžio ląstelių

Nors SOX4 buvo laikomas tiesioginiu tikslo miR-204, neaišku, ar Pasaulis-204 gali tiesiogiai pripažinti 3'-UTR iš SOX4 iRNR. Pagal numatomą taikinio svetainėje nuo Targetscan, mes klonuoti 3'-UTR fragmentą, kuriame yra numatoma svetainė į pGL3 liuciferazės reporteris vektoriaus (pGL3-SOX4). 3'-UTR fragmentas su mutavo seka per numatomą taikinio svetainėje taip pat buvo klonuotas kaip kontrolės (pGL3-SOX4-Mut). Rezultatai parodė, kad bendrai transfekcija su Pasaulis-204 imituoja ir pGL3-SOX4 vektoriaus sumažėjo liuciferazės veiklą SGC-7901 ląstelių. Tačiau, PPN-204 imituoja neturėjo apie liuciferazės veiklos poveikį, kai ląstelės buvo pernešta su pGL3-SOX4-Mut vektoriaus (5 paveikslas). Šie duomenys rodo, kad SOX4 genas buvo vienas iš tiesioginių tikslų PPN-204.

Per išraiška SOX4 turi PPN-204 poveikį skrandžio vėžio ląstelių invazija

Norėdami nustatyti SOX4 kaip funkcinė efektorinių miR-204 skrandžio vėžio invazijos, mes per išreiškė SOX4 iki transfekuoja su lentiviruso ir išnagrinėjo jo poveikį skrandžio vėžio ląsteles. Per-išraiškos SOX4 į ląstelių linijos buvo patvirtinta Imunoblotingo (6a paveikslas). Mes taip pat nustatė, kad El-cad buvo žemyn reguliuojama, o N-cad buvo reguliuojama po PLV-SOX4 transfekciją. Per žaizdų gijimą ir Matrigel invazijos metodu, mes tada atrado, kad per išraiška SOX4 gerokai skatinamas ląstelių migraciją ir invazija (6b pav ir 6c). Siekiant dar labiau įrodo, kad Pasaulis-204 sukelto į SOX4 slopino platinimu ir invazijos į skrandžio vėžio ląstelių nykimą, ląstelės buvo pernešta su Pasaulis-204 imituoja ir SOX4 per ekspresijos vektorius kartu ir rezultatai parodė, kad migracijos, invazijos slopinimas ir platinimu miR-204 buvo susilpnintas (S4 paveikslas).

Diskusijos

Skrandžio vėžys yra pasaulinė liga, didelis sergamumas, ypač Pietryčių Azijoje [21]. 5 metų išgyvenamumas skrandžio vėžys yra gana žemas. Kai kurie iš skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo H. pylori susiję. Todėl būtina nuodugniai ištirti patogenezę ir kurti naujus tikslinius gydymo H. pylori susijusių skrandžio vėžiu.

miRNAs esame didelė šeima genų reguliavimo, kad neigiamai reguliuoti savo tikslines iRNR sekos konkrečiai būdu. miRNAs taip pat gali veikti kaip naviko slopintuvai ar onkogenų [22]. Naujausi duomenys rodo, kad miRNAs žaisti esminius vaidmenis daugelyje biologinių procesų, susijusių su vėžio, įskaitant ląstelių diferenciacijos, dauginimosi, tumorignesis, angiogenezę, invazija ir metastazių [23]. MiR-204 buvo pranešė, kad veiktų kaip auglio slopinamojo ir žemo lygio išraiška miR-204 yra susijęs su prastos prognostiniu fenotipo vėžiu sergantiems pacientams [24], [25]. Tačiau, ten buvo keletas tyrimų tyrimą Pasaulis-204 funkcijos H. pylori susijusių skrandžio vėžiu. Čia mes buvome pirmieji pateikti įrodymų, kad Pasaulis-204 buvo gerokai žemyn reguliuojama H. ​​pylori teigiamų audinių (normalus ir navikų audiniuose), ir kad per išraiškos PPN-204 nutylėtų SOX4 baltymų ekspresijos ir ląstelių augimo, gautų iš skrandžio navikas.

pirmasis kiekybiškai PPN-204 išraišką H. pylori infekcijos audiniuose ir kontrolės, ir mes nustatėme, kad mir-204 išraiška yra žymiai mažesnis H. pylori infekuotiems pacientams. Mes taip pat nustatė, kad išraiška yra susijęs su pacientų histologiją, tai yra, miR-204 išraiška yra žymiai mažesnis H. pylori teigiamų pacientų su lėtiniu atrofinio gastrito nei lėtinio ne-atrofinio gastrito. Ši išraiška modelis parodė, kad galimybė, kad miR-204 yra susijusi su įvairių rūšių gastritas ir tuo daugiau sunkių pacientų buvo, tuo mažesnis miR-204 išraiška buvo. Remiantis Mir-204 raiškos lygį, mes pasirinkome SGC-7901 ir MKN45 ląsteles vėlesnis padidėjimas-of-funkcijos ir netekus funkcijos tyrimų, atitinkamai. Rezultatai rodo, kad down-regulation miR-204 skrandžio vėžio ląstelių yra susijusi su jo progresavimo. Nors buvo pranešta apie daug žmogaus miRNAs, daugelis jų mRNR tikslus lieka neatpažintų [9]. Šiame tyrime mes naudojome kombinuotos bioinformatikos ir eksperimentinę požiūrį nustatyti, kad SOX4 yra funkcinė pasroviui tikslas miR-204.

SOX4 yra per išreikštas įvairiomis vėžio formomis ir buvo glaudžiai koreliuoja su naviko invazijos ir metastazes [ ,,,0],16] - [19]. Tai taip pat vienas iš narių EMT-transkripcijos induktoriais [26]. EMT yra pagrindinis vystymosi programa, kuri dažnai aktyvuojamas per vėžio progresavimo ir gali skatinti atsparumą terapija [27]. Zhang et al [20] parodė, kad padidėjusią SOX4 žmogaus pieno epitelio ląstelių paskatino mezenchiminių bruožų įsigijimo ir didesnio ląstelių migracijos ir invazijos. Be to, SOX4 teigiamai reglamentuoja žinomų EMT induktoriais išraišką ir aktyvuota TGF- kelią prisidėti prie EMT [28]. Iki šiol, EMT yra patrauklus taikinys terapinių intervencijų, suteikia naują pagrindą apie karcinoma link dediferencijuotų ir daugiau piktybiniais narėse [29] progresavimą. Mūsų tyrimas pirmiausia parodė, kad H. pylori infekcijos sukelta Pasaulis-204 žemyn reguliavimas gali sukelti skrandžio vėžį EMT procese.

Taigi, mūsų duomenys rodo, jog Pasaulis-204 buvo žemyn reguliuojama, o SOX4 buvo aukštyn reglamentuoja H. pylori infekcija ir skrandžio vėžio. Negimdinis Pasaulis-204 išraiška sumažėjo SOX4 išraiška mRNR ir baltymų lygių skrandžio vėžio ląstelių linija. Mes taip pat parodė, kad Pasaulis-204 buvo tiesiogiai susietas su 3'-UTR iš SOX4. MIR-204 išraiška slopinamas EMT per represijas SOX4. Be to, Mir-204-EMT kelias, kad mes nustatyti gali būti naudojami terapinio požiūrio į H. pylori susijusių vėžio gydymui.

Pagalbinė informacija
S1 paveiksle.
(a) 5 miRNAs į H išraiška pylori teigiami ir neigiami audiniai buvo aptikta KRL-PGR. (B) ekspresijos lygis miR-204 vėžinių ir kontrolės audiniuose. (C) sąvoka lygiai miR-204 pagal TNM etapais. (D) išraiška lygis miR-204 trijų rūšių H. pylori infekuotų ląstelių. (* P < 0,05)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF)
S2 pav.
ląstelėse, transfektuotose Pasaulis-204 imituoja ir imituoja su H. pylori infekcija ir (A) viabilities buvo nustatyta su CCK-8 tyrimą (B) vaizdus nufotografuoti esant 0 h (viršutinis) ir 24 h (mažesnis) po sužeidimo buvo parodyta išdidinimas x200 (C) Reprezentacinės vaizdai invazinių ląstelių at membranos tamsintas su violetinei apačioje buvo ryškinamos kaip parodyta. (* P < 0,05)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s002
(TIF)
S3 pav.
(A), santykinė iRNR raiška miR-204 ir SOX4, normalizuotas su U6 ir GAPDH, buvo įvertintas 15 egzempliorių H. pylori teigiamus ir neigiamus audiniuose KRL-PGR. (B) atvirkštinė koreliacija SOX4 ir Pasaulis-204 raiškos lygiais buvo ištirta (R = -0,920, p = 0,001). (C) SOX4 mRNR ekspresijos nulėmė KRL PGR H. pylori infekuotų ląstelių. (D) SOX4 baltymų lygio išraiška lėmė Vakarų dėmė H. pylori infekuotų ląstelių. (* P < 0,05)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s003
(TIF)
S4 pav.
ląstelėse, transfektuotose Pasaulis-204 imituoja ir imituoja su PLV-SOX4 ir (a) viabilities buvo nustatyta su CCK-8 tyrimą (B) Reprezentacinės vaizdai invazinių ląstelių at membranos tamsintas su violetinei apačioje buvo ryškinamos parodyta. (C) vaizdai nufotografuoti esant 0 h (viršutinis) ir 24 h (mažesnis) po sužeisti buvo parodyta išdidinimas X200 (* p < 0,05)
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)

• PLoS ONE: Ar Naviko dydis Gerinti prognozinių spėjimų limfmazgius Neigiama Skrandžio vėžys (pT1-4aN0M0 etapas) tikslumas
• PLoS ONE: D-dimerai: ne tik iš venų trombozės indikatorius bet Asimptominės Hematogenous metastazių prognozuojant skrandžio vėžys Patients