PLoS ONE: Toenemend miR-204 in H. pylori-geassocieerde maagkanker Bevordert Cancer Cell proliferatie en invasie door zich te richten SOX4

De abstracte

Achtergrond

De moleculaire mechanisme tussen Helicobacter pylori (H. pylori) infectie en maagkanker bleef grotendeels onbekend. In deze studie hebben we de rol van miRNA in H. pylori veroorzaakt maagkanker.

Methoden en Resultaten

We vonden dat miR-204 was verlaagd bij H. pylori-positieve weefsels door qRT- PCR. Knockdown van miR-204 versterkte de invasie en proliferatie vermogen van maagkanker cellen in vitro. Luciferase test bleek dat SOX4 was doelwit-gen van miR-204, die up-gereguleerd in H. pylori werd gevonden positief weefsels. Down-regulatie van miR-204 en overexpressie van SOX4 bevorderd epitheliale-mesenchymale transitie proces.

Conclusie

Bij elkaar genomen, onze bevindingen toonden aan dat miR-204 kan fungeren als een tumor suppressor in H. pylori veroorzaakt maagkanker door zich te richten SOX4

Visum:. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Verminderde miR-204 in H. pylori-geassocieerde maagkanker Bevordert Cancer Cell Proliferation en Invasion door zich te richten SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10.1371 /journal.pone.0101457

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 18 maart 2014; Aanvaard: 5 juni 2014; Gepubliceerd: 1 juli 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Guoxin Zhang werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (nr 81270476) (http://www.nsfc.gov.cn/). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Tot op heden hebben moleculaire mechanismen op maagkanker onderzocht, zij zijn echter niet volledig begrepen [2]. Maagcarcinomen worden verondersteld zich volgens een werkwijze van meerdere stappen van carcinogenese, dat sterk geassocieerd met de infectie door bacteriële pathogenen, Helicobacter pylori
( H. Pylori
) [3]. H.
pylori, die de maag van 50% van de wereldbevolking koloniseert, is geclassificeerd als een klasse I carcinogeen vanwege de causatieve rol in de ontwikkeling van maagkanker [4].

Vermeld is de ontwikkeling en progressie van maagkanker kan worden toegeschreven aan microRNAs (miRNAs) [5] - [8]. MiRNAs zijn kleine niet-coderende RNA's die de expressie van doelgenen wettelijk te translationele repressie of messenger RNA (mRNA) degradatie [9]. MiR-204 afwijkende expressie werd gerapporteerd te associëren met verschillende soorten kanker [10], [11]. Er is echter weinig bekend over miRNA-204-functie bij maagkanker. Matsushima uitgevoerd miRNA array-studie bij H. pylori-positieve weefsels en contols en vonden dat miR-204 expressie was significant lager bij H. pylori-positieve weefsels [12].

Bij de mens, het geslacht bepalend gebied Y (SRY ) box familie, ook wel de familie SOX, omvat 20 sterk geconserveerde transcriptiefactoren die een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van prostaatkanker [13]. Deze transcriptiefactoren worden gedefinieerd door een geconserveerd handtekening sequentie in de hoge mobiliteit groep (HMG) DNA-bindend domein (DBD) [14], [15]. SOX4 is een 47-kDa eiwit sterk geconserveerd in vertebraten en de klinische betekenis heeft opgedaan toenemende aandacht de laatste jaren talrijke rapporten suggereren dat SOX4 kan bijdragen aan tumorprogressie [16], [17]. SOX4 verhoogde expressie in tumoren van de blaas, prostaat en colon, en met niet-kleine-cel-longtumoren [18] - [21]. Gedereguleerde expressie van SOX4 is gecorreleerd met verhoogde kankercel proliferatie, celoverleving, apoptose en remming van tumorprogressie bij maagkanker [22]. De overexpressie is ook in verband gebracht met slechte prognose in klinieken en is een marker om de resultaten van patiënten met maagkanker [23] voorspellen.

Tot voor kort, is het onduidelijk of dat H. pylori infectie kan SOX4 expressie te induceren door middel van naar beneden reguleren van miR-204. Zo hebben we ons onderzoek uitgevoerd om de rol van miR-204 en SOX4 in H. pylori geïnduceerde verder onderzoek carcinogenese.

Materialen en Werkwijzen

Klinische monsters

Patiënten met of zonder H. pylori
infectie had gastroscope in The First Affiliated Hospital van Nanjing Medical University, de provincie Jiangsu, China ondergaan van maart 2012 en december 2013 monsters genomen van de 250 patiënten (150 goedaardige tumor patiënten en 100 patiënten) werden verzameld en werden positief geïdentificeerd als een snelle urease test positief was. Deze geselecteerde patiënten werden ook bevestigd door ^{13C ademtest. Goedaardige patiënten werden ingedeeld in oppervlakkige gastritis, atrofische gastritis en dysplasie volgens de pathologische classificatie. Dit protocol werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de eerste aangesloten ziekenhuis van Nanjing Medical University, en elke patiënt had informed consent geschreven.}

Cell cultuur

SGC-7901 /MKN45 maagkanker cellijnen ( gekocht van ATCC) werden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Gibico) en penicilline (100 U /ml). Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO _2.

bacteriecultuur en infectiemodel

H. pylori werd geïnoculeerd in de plaat en gekweekt bij 37 ° C in een microaerofiele atmosfeer met 5% O _{2, 10% CO 2 en 85% N 2. Na 3 dagen werd de bacteriële geresuspendeerd in RPMI-1640 medium zonder FBS en geïnfecteerde cellen bij een MOI van 100. De cellen werden vervolgens 48 uur na infectie geoogst.}

Isolatie van totaal RNA en kwantitatieve RT-PCR

De totale RNA's werden geëxtraheerd uit verzameld weefsels en cellijnen met behulp van Trizol (Tarkara, Japan) en vervolgens zowel miRNA en mRNA werden reverse getranscribeerd naar cDNA. De reverse transcriptie werd uitgevoerd door reverse transcriptie kit (Takara, Japan). De expressie van miRNAs en volwassen potentiële doelgenen werden gemeten met qRT-PCR met SYBR Green PCR Kit (Takara) met Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System en humane U6 RNA werd geamplificeerd als een interne controle. De relatieve expressie verhouding van miR-204 werd berekend door de 2 ^{-ΔΔCT methode. PCR reacties werden uitgevoerd met de volgende primers: voor HSA-miR-204, forward, 5'- CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'en U6, voorwaarts, 5'- CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. Relatieve expressieniveaus van SOX4 mRNA werden onderzocht met SYBR Green real-time PCR (RT-PCR) en genormaliseerd op GAPDH. De primers voor SOX4 waren vooruit, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' en achteruit, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; en GAPDH, voorwaarts, 5'- CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'en reverse 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR werd uitgevoerd met behulp van de ABI 7500 Fast Real-Time PCR systeem (ABI, CA, USA).}

Immunohistochemie

De weefsels werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gesneden uit paraffine blok 5 urn dik. Na ontwassen met xyleen en rehydratie met een gegradeerde reeks van ethanol, werden objectglaasjes verhit in de autoclaaf gedurende drie minuten met behulp Natrium buffer (pH 6,0) en geïncubeerd met het antilichaam SOX4 (Cell signalering Technology) bij 4 ° C overnacht. Blokkerende serum of antilichaam verdunningsbuffer als negatieve controles. De antilichamen gebruikt voor waren hetzelfde als voor Western blot analyse. Foto's werden genomen door Microsope (Nikon Eclipse 50i). Het aantal positieve kleuring toont cellen immunoreactiviteit van SOX4 tien representatieve microscopische velden geteld en het percentage positieve cellen werd berekend. Het percentage immunoreactieve scoren van tumorcellen als volgt omschreven: 0 (0%) 1 (1-10%), 2 (11-50%) en 3 (> 50%). De intensiteit werd als volgt gewaardeerd: 0 (negatief), 1 (zwak), 2 (matig) en 3 (sterk). De expressie niveau van SOX4 werd gemeten door het percentage en de intensiteit score te vermenigvuldigen. Hoge expressie monsters betekent dat tumoren met een vermenigvuldigde score van meer dan 4, terwijl de anderen werden beschouwd als laag expressie.

proliferatie Cell assasy

Cell proliferatie werd onderzocht met behulp van in water oplosbare tetrazoliumzout test met behulp van de Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan). Kortom, de cellen (1,5 x 10 ^{3 /putje) werden geënt in 96-putjes in drievoud en gedurende 4 dagen bij 37 ° C /5% CO2 in een bevochtigde incubator. Levensvatbare cellen werden gekwantificeerd bij elke 24 uur interval door het meten van OD450 behulp microplaat reader. (Epoch; BioTek, Winooski, VT)}

Cellen (2 x 10 ^{6) werden gefixeerd met 75% ethanol bij 4 ° C geroerd en vervolgens gewassen met koude PBS en behandeld met RNaseI, gevolgd door kleuring met propidiumjodide voor 30 min in het donker. Celcyclus analyse werd vervolgens uitgevoerd door flowcytometrie (FACSCalibur; Becton Dickinson, Sparks, MD).}

Cellen werden getrypsiniseerd en uitgeplaat op 6-putjes (500 cellen /putje) en gedurende 2 weken. De kolonies werden gekleurd met 1% kristalviolet gedurende 30 minuten na fixatie met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Het aantal kolonies, gedefinieerd als > 50 cellen /kolonies werden geteld. Drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd. De gegevens werden berekend gebruikmakend van gepaarde t-test.

Celmigratie assay (wondgenezing)

A-wondgenezende assay werd gebruikt om het vermogen van de tumor celmotiliteit beoordelen. In het kort cellen (1 * 10 ^{6 /putje) werden geënt in platen met zes putjes, overnacht gekweekt en getransfecteerd met miR-204 bootst of remmer, pcDNA-SOX4 of pcDNA-NC. Bij het bereiken van confluentie werd de cellaag gekrast met een steriele plastic tip en vervolgens gewassen met kweekmedium en tweemaal opnieuw gekweekt tot 48 met verminderde serum medium dat 1% FBS. De gap closure werd gemeten en de gegevens zijn samengevat op basis van zesvoudig assays voor elk experiment.}

Mobiele invasie assay

Mobiele invasie activiteit werd gemeten met behulp van celkweek inserts gecoat met basaal membraan matrix (BD Biosciences , Bedford, MA) volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat, in totaal 1 x 105 cellen in 0,2 ml serumvrij RPMI-1640 medium werd geënt op een Transwell inrichting. RPMI-1640 bevattende 10% FBS (600 pl) werd aan de onderste kamer toegevoegd. Na incubatie van de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator, werden cellen op het bovenoppervlak van het inzetstuk verwijderd door vegen met een wattenstaafje. De cellen die binnengedrongen het onderoppervlak van het inzetstuk zijn vastgesteld in de 100% voorkoelen methanol voor 30 minuten, gekleurd met 0,5% kristalviolet gedurende 30 min, vervolgens gespoeld in PBS en onderworpen aan microscopische inspectie. Cellen werden geteld onder de microscoop in vijf willekeurige velden en de relatieve invasie en migratie aldus wordt het gemiddelde aantal cellen ± standaardafwijking per veld.

Western blotting

Totale eiwitten werden bereid en gekwantificeerd met een eiwit assay (BCA werkwijze, Thermo, USA). Eiwitten werden gescheiden met natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) overgebracht naar polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan, geblokkeerd in 5% droge melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en immunologisch gekleurd met antilichamen bij 4 ° C gedurende de nacht met behulp van anti-SOX4 ( 1:1000, CST, USA), anti-N-cadherine (1:1000, CST, USA) en anti-E-cadherine (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, USA) werd gebruikt als beladingscontrole. Resultaten werden gevisualiseerd door een chemiluminescent detectiesysteem (Pierce ECL substraat Western blot detectiesysteem, Thermo, Pittsburgh, PA) en vervolgens blootgesteld in Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA).

Plasmideconstructie

Voorspelling van miR-204-bindende plaatsen werd uitgevoerd met behulp van TargetScan software (http://www.targetscan.org). 3'-UTR sequentie SOX4 waarvan werd voorspeld om met miR-204 of een mutant sequentie met de voorspelde doelplaatsen werden in de Kpnl en Sacl plaatsen van pGL3-promotor vector (Invitrogen). Ze werden genoemd pGL3-SOX4 en pGL3-SOX4-mut. De cellen werden uitgeplaat op platen met 6 putjes en werden getransfecteerd met 100 ng pGL3-SOX4 of pGL3-SOX4-mut en miR-204 bootst (50 nM) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA). We genormaliseerd de verschillen in transfectie-efficiëntie door co-transfecteren van een Renilla luciferase vector pRL-SV40 (5 ng).

SOX4-gen werd gesynthetiseerd (gekocht van GenScript, Piscataway, NJ) met beperkende vertering met behulp van Mlul en gesubkloneerd PLV-GFP plasmide, en noemde PLV-GFP-SOX4. Recombinant lentivirus gerealiseerd met 293T cellen met behulp van calciumfosfaatprecipitatie. SGC-7901 cellijnen werden getransfecteerd met behulp van lentivirus polybreen (8 ug /ml).

Luciferase activiteiten analyse

De cellen werden gekweekt in 24-putjesplaten en getransfecteerd met 0,2 ug van hetzij breed- type of mutant pGL-SOX4 plasmide dat vuurvlieg luciferase, samen met 0,01 ug van de pGL-SOX4 vector (Invitrogen) met Renilla luciferase en 1 ug oligonucleotiden. Transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Relatieve luciferaseactiviteit werd berekend 48 uur na transfectie van de Dual Luciferase Reporter Assay (Promega). Alle transfectie-experimenten werden uitgevoerd in drievoud en driemaal herhaald onafhankelijk. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD.

Statistische analyse

t-toets of één-variantieanalyse werd gebruikt voor statistische analyse zo nodig. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Een tweezijdige waarde van P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant

Resultaten

MiR-204 is afwijkend down-gereguleerd in H.. pylori
positieve weefsels en cellen

De expressie van miRNAs geselecteerd op basis van de vorige microarray data [10] werden gedetecteerd in 75 paren van H. pylori-positieve en negatieve normale weefsels, en 50 paren van H. pylori positief en negatieve tumorweefsels door real-time PCR. We vonden dat miR-204 is een van de belangrijkste miRNAs neerwaarts gereguleerd op H. pylori infectie (Figuur S1 A, Figuur 1A, B). Daarnaast werd miR-204 tot expressie gebracht op lagere niveaus in ernstiger gastritis (figuur 1C). Verder hebben we in vergelijking tot uitdrukking in tumorweefsels met normale weefsels, ongeacht de H. pylori-status en vond dat miR-204 werd uitgedrukt significant lager in tumoren (figuur S1B). We verdeelden de patiënten met een tumor volgens verschillende TNM stadia en T2-T4 en M1 patiënten uitgedrukt significant lager miR-204 dan T1 en M0 patiënten (Figuur S1C, S1D). We onderzochten ook miR-204 expressie in cellen geïnfecteerd met H. pylori en we vonden dat de expressie van miR-204 was significant lager in meerdere H. pylori geïnfecteerde cellen dan controle (figuur 1D, Figuur S1E).

miR-204 onderdrukt de migratie /invasie en proliferatie van maagkanker cellen in SGC-7901 en MKN-45 cellen

We getransfecteerd SGC7901 en MKN45 cellen met HSA-miR-204 na te bootsen /remmer oligonucleotiden en onderzocht de effecten op cellulaire proliferatie en migratie /invasie. Eerst voerden we qRT-PCR om de effectiviteit van transfectie verifiëren, zoals in Fig. 2A, transfectie van cellen met miR-204 bootst /remmer bleek aanzienlijk verhogen /verlagen van miR-204 expressie in vergelijking met hun negatieve controle (NC /inc). Wondgenezing assay toonde aan dat overexpressie van miR-204 celmigratie kunnen onderdrukken, terwijl de knockdown geïnduceerde celmigratie, met aanzienlijke dichter gap dan controle (Figuur 2B). Consequent, Matrigel invasie test toonde ook aan dat overexpressie van miR-204 verzwakt cel invasie, terwijl knock-down ervan de genegenheid (figuur 2C) kon keren. We hebben ook uitgevoerd MTT-test en vond dat de groei van cellen die met miR-204-remmer was significant toegenomen in vergelijking met de controlegroep, terwijl cellen met miR-204 bootst werd toonde de verschillende (figuur 3A, B). We onderzocht of de celcyclus wordt beïnvloed door de knockdown /overexpressie van miR-204 met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering analyse van propidiumjodide-gekleurde cellen (FACS). Knockdown van miR-204 leidde tot een aanzienlijke toename van het percentage van cellen in de G2-fase, terwijl overexpressie vertoonde het tegengestelde effect (Figuur 3C). Kolonievorming assays aangetoond dat remming van miR-204 sterk toegenomen groei van cellijnen (Figuur 3D). We vergeleken ook celfuncties van transfecteren met miR-204 bootst met bootst en H. pylori-infectie. We vonden dat miR-204 bootst celmigratie, invasie en proliferatie van H. pylori-infectie (figuur S2) kon onderdrukken. Deze resultaten samen toonden aan dat down-regulatie van miR-204 geïnduceerd door H. pylori-infectie te bevorderen migratie /invasie en proliferatie van de maagkanker cellijn in vitro.

MiR-204 up-gereguleerd SOX4 expressie bij maagkanker

We identificeerden de downstream targets van miR-204 door computational voorspelling aan de mechanismen waarmee miR-204 onderdrukt maagkanker cel invasie. Onder de honderden genen voorspeld door online miRNA doelwit voorspelling website (sterrenbasis, http://starbase.sysu.edu.cn/), forcused we onze aandacht op SOX4. SOX4 had gemeld dat maagkanker progressie en EMT of handelen te reguleren als een onderliggende functionele doelwit van miR-204. Om de voorspelling, door middel van qRT-PCR en immunohistochemie identificeren, vonden we dat SOX4 werd up-gereguleerd in H. pylori-positieve weefsels. Haar expressie was ook hoger in CAG dan CG in H. pylori-positieve weefsels. (N = 75, p < 0,05 Figuur 4A-C), die werd omgekeerd gecorreleerd met miR-204. Met behulp van Pearson's correlatie analyse van SOX4-miR-204 mRNA expressie, verkregen we een statistisch significante inverse correlatie (Figuur S3A, R = -0,849, P = 0,002). Middels immunohistochemie, ontdekten we dat SOX4 expressie geassocieerd is met maag histologie (p < 0,05; tabel 1). In vitro, vonden we ook dat SOX4 mRNA en eiwitniveau waren opgereguleerd in maagkanker cellen geïnfecteerd met H. pylori (figuur S3B, S3C). Vervolgens bepaalden de expressie van SOX4 in reactie op de veranderingen in miR-204 expressie. Western blot en qRT-PCR-tests toonden aan dat overexpressie van miR-204 kon aanzienlijk neerwaarts reguleren het mRNA en eiwitexpressie van SOX4, terwijl het effect van het uitschakelen van miR-204 was het tegenovergestelde (Figuur 3D). We vonden ook dat de expressie van EMT markers, N-cadherine en E-cadherine, werd ook aanverwante veranderd in miR-204 expressie (Figuur 4E), die suggereerde dat miR-204 kan invloed hebben op de EMT proces.

SOX4 is een direct doelwit-gen van miR-204 bij maagkanker cellen

Hoewel SOX4 heeft als direct doelwit van miR-204 beschouwd, is het onduidelijk of miR-204 van de 3'-UTR van direct kunnen herkennen SOX4 mRNA. Volgens de voorspelde doelplaats van Targetscan, gekloneerd we de 3'-UTR fragment dat de voorspelde locatie in de pGL3 luciferase reporter vector (pGL3-SOX4). Het 3'-UTR fragment met gemuteerde sequentie in de voorspelde doelplaats werd gekloneerd als een controle (pGL3-SOX4-mut). De resultaten toonden aan dat co-transfectie met miR-204 en bootst de pGL3-vector SOX4 verminderde luciferaseactiviteit in SGC-7901 cellen. Echter, miR-204 bootst geen effect op luciferase activiteit wanneer de cellen werden getransfecteerd met pGL3-SOX4 mut-vector (Figuur 5). Deze gegevens suggereerden dat SOX4 gen was één van de directe doelstellingen van miR-204.

Over-expressie van SOX4 heeft het effect van miR-204 op maagkanker cellen invasie

Om te bepalen als SOX4 de functionele effector van miR-204 bij maagkanker invasie, we over-uitgedrukt SOX4 door transfecteren met lentivirus en de gevolgen ervan in maagkanker cellen onderzocht. Overexpressie van SOX4 in de cellijn werd bevestigd door middel van Western blotting (Figuur 6A). We vonden ook dat de E-cadherine werd down-gereguleerd, terwijl N-cadherine werd up-gereguleerd na PLV-SOX4 transfectie. Door middel van wondgenezing en de Matrigel invasie assay, we ontdekten dat de overexpressie van SOX4 aanzienlijk bevorderd cellen migratie en invasie (Figuur 6B en 6C). Om verder aan te tonen dat miR-204 geïnduceerd verlies van SOX4 onderdrukt proliferatie en invasie van maagkanker cellen, werden cellen getransfecteerd met miR-204 bootst en SOX4 overexpressie vector elkaar en de resultaten toonden dat de onderdrukking van migratie, invasie en proliferatie van miR-204 werd verzwakt (Figuur S4).

Discussie

Maagkanker is een wereldwijde ziekte met een hoge incidentie, vooral in Zuidoost-Azië [21]. De 5-jaars overlevingskans voor maagkanker is vrij laag. Enkele maagkanker patiënten H. pylori verbonden. Daarom is het noodzakelijk om grondig onderzoek naar de pathogenese en nieuwe doelgerichte behandelingen voor H. pylori verband maagkanker.

MiRNAs zijn een grote familie van genen die een negatieve regulatoren hun doelwit mRNA reguleren op een sequentiespecifieke wijze. miRNAs kan eveneens als tumor suppressors of oncogenen [22]. Recent bewijs suggereerde dat miRNAs spelen een essentiële rol in verschillende biologische processen in verband met kanker, met inbegrip van celdifferentiatie, proliferatie, tumorignesis, angiogenese, invasie en metastase [23]. MiR-204 is beschreven om als een tumorsuppressor en lage expressie van miR-204 is geassocieerd met een slechte prognose fenotype bij patiënten met kanker [24], [25]. Echter, er waren maar weinig studies die miR-204 functie in de H. pylori-gerelateerde maagkanker. Hier, we waren de eerste om bewijsmateriaal te presenteren dat miR-204 was significant down-gereguleerd in H. pylori-positieve weefsels (de normale en tumor weefsels) en dat overexpressie van miR-204 onderdrukt SOX4 eiwitexpressie en de groei van cellen afkomstig van maag tumor.

we hebben eerst kwantificeren van de expressie van miR-204 in H. pylori-infectie weefsels en controles en we vonden dat de miR-204 expressie significant lager in H. pylori geïnfecteerde patiënten. We vonden ook dat de expressie verband houdt met de histologie van de patiënt, dat wil zeggen de expressie van miR-204 is significant lager bij H. pylori-positieve patiënten met chronische atrofische gastritis dan chronische niet-atrofische gastritis. Dit expressiepatroon toonde deze mogelijkheid dat miR-204 heeft betrekking op verschillende gastritis en hoe ernstiger de patiënten, hoe lager de expressie van miR-204 was. Op basis van de miR-204 expressie niveau, kozen we SGC-7901 en MKN45 cellen voor de respectievelijk daaropvolgende gain-of-functie en verlies-van-functie studies,. De resultaten suggereren dat neerwaartse regulatie van miR-204 bij maagkanker cel hangt samen met de progressie. Hoewel een groot aantal menselijke miRNAs gemeld, veel van hun mRNA targets blijven ongeïdentificeerd [9]. In deze studie hebben we een gecombineerde bioinformatica en experimentele benadering te identificeren dat SOX4 de functionele stroomafwaarts doelwit van miR-204.

SOX4 is tot overexpressie gebracht bij verschillende kankersoorten en is nauw gecorreleerd met tumorinvasie en metastase [ ,,,0],16] - [19]. Het is ook een van de leden van EMT-transcriptie induceren [26]. EMT is een belangrijke ontwikkelingsprogramma die vaak tijdens kankervooruitgang geactiveerd en kan therapieresistentie [27] bevorderen. Zhang et al [20] blijkt dat overexpressie van SOX4 in menselijke mammaire epitheelcellen geleid tot het verkrijgen van mesenchymale eigenschappen en verbeterde celmigratie en invasie. Bovendien SOX4 positief gereguleerde expressie van EMT bekende inductoren en geactiveerd TGF-β pathway bijdragen tot EMT [28]. Tot op heden, EMT is een aantrekkelijk doelwit voor therapeutische interventie, verschaft een nieuwe basis van de progressie van carcinoma richting gededifferentieerde en kwaadaardige toestanden [29]. Onze studie in de eerste plaats is gebleken dat H. pylori-infectie veroorzaakte miR-204 naar beneden regulering zou kunnen leiden tot maagkanker door EMT proces.

Tot slot, ons bewijsmateriaal aangegeven dat miR-204 werd down-gereguleerd, terwijl SOX4 was up- geregeld in H. pylori-infectie en maagkanker. Buitenbaarmoederlijke miR-204 expressie daalde SOX4 uitdrukking aan het mRNA en eiwit niveaus in de maagkanker cellijn. We hebben ook aangetoond dat miR-204 werd direct gebonden aan de 3'-UTR van SOX4. MiR-204 expressie geremd EMT via onderdrukking van SOX4. Bovendien kan de miR-204-EMT traject dat we geïdentificeerd worden benut in een therapeutische benadering voor de behandeling van H. Pylori kankers.

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
(A) De expressie van 5 miRNAs in H pylori positieve en negatieve weefsels werd gedetecteerd door qRT-PCR. (B) De expressieniveaus van miR-204 in de tumor en controle weefsel. (C) De expressieniveaus van miR-204 volgens TNM stadia. (D) De expressie niveau van miR-204 in drie soorten H. pylori geïnfecteerde cellen. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF)
Figuur S2.
Cellen getransfecteerd met miR-204 bootst en bootst met H. pylori-infectie en (A) de levensvatbaarheid werden bepaald met CCK-8 assay (B) De beelden gefotografeerd bij 0 uur (boven) en 24 uur (onderste) na de verwonding werden bij een vergroting van x200 (C) de representatieve beelden van invasieve cellen aan de onderkant van het membraan gekleurd met kristalviolet werden zichtbaar zijn. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s002
(TIF)
Figuur S3.
(A) De relatieve mRNA-expressie van miR-204 en SOX4, genormaliseerd met U6 en GAPDH, werd in 15 exemplaren van H. pylori-positieve en negatieve weefsel met qRT-PCR. (B) Een inverse correlatie van SOX4 en miR-204 expressie werd onderzocht (R = -0,920, P = 0,001). (C) De expressie van SOX4 mRNA werd bepaald met qRT-PCR in H. pylori geïnfecteerde cellen. (D) De expressie van SOX4 eiwitgehalte werd bepaald met Western blot H. pylori geïnfecteerde cellen. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s003
(TIF)
figuur S4.
Cellen getransfecteerd met miR-204 bootst en bootst met PLV-SOX4 en (A) de levensvatbaarheid werden bepaald met CCK-8 assay (B) De representatieve beelden van invasieve cellen aan de onderkant van het membraan gekleurd met kristalviolet werden gevisualiseerd weergegeven. (C) De beelden gefotografeerd bij 0 h (boven) en 24 uur (onder) na de verwonding werden getoond bij een vergroting van x200 (* p < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)

• PLoS ONE: Heeft tumorgrootte verbetering van de nauwkeurigheid van Voorspellende Voorspellingen in kliernegatieve maagkanker (pT1-4aN0M0 Stage)
• PLoS ONE: D-dimeer: ​​Niet alleen een indicator van veneuze trombose, maar een Predictor van asymptomatische hematogene metastase bij maagkanker Patients