PLOS ONE: Diminuição do miR-204 em H. pylori-Associated Câncer Gástrico promove a proliferação de células cancerosas e invasão por Segmentação SOX4

Abstract

Fundo

O mecanismo molecular entre Helicobacter pylori (H. pylori) infecção e câncer gástrico permaneceu desconhecida. Neste estudo, determinou-se o papel de miRNA em H. pylori induzida câncer gástrico.

Métodos e Resultados

Nós descobrimos que miR-204 foi diminuída em H. pylori tecidos positivos por qRT- PCR. Knockdown de miR-204 melhorou a capacidade de invasão e proliferação de células de cancro gástrico in vitro. ensaio de luciferase foi revelado que SOX4 gene alvo de miR-204, que foi encontrado sobre-regulada em H. pylori tecidos positivos. A sub-regulação de miR-204 e a sobre-expressão de SOX4 promovido processo de transição epitelial-mesenquimal.

Conclusão

Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstraram que o miR-204 pode actuar como um supressor tumoral em H. pylori induzida câncer gástrico, visando SOX4

Citation:. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Diminuição do miR-204 em H. pylori-Associated câncer gástrico promove a proliferação de células cancerosas e Invasion ao direcionar SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10.1371 /journal.pone.0101457

editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Março, 2014; Aceito: 05 de junho de 2014; Publicação: 01 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Guoxin Zhang foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.270.476) (http://www.nsfc.gov.cn/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum e segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Até à data, os mecanismos moleculares em cancro gástrico têm sido investigados, no entanto, eles ainda não estão totalmente compreendidos [2]. carcinomas gástricos são supostamente para desenvolver de acordo com um processo de várias etapas da carcinogênese, que está fortemente associada com a infecção pelo patógeno bacteriano, Helicobacter pylori
( H. pylori
) [3]. H. pylori
, que coloniza o estômago de 50% da população mundial, tem sido classificado como um carcinógeno de classe I por causa do seu papel causador no desenvolvimento do cancro gástrico [4].

Tem sido relatado que o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico pode ser atribuída a microARNs (miARNs) [5] - [8]. MiRNAs são pequenos RNAs, não-codificante que regulam a expressão de genes alvo através da repressão de RNA mensageiro ou de translação (ARNm) degradação [9]. expressão aberrante miR-204 foi relatado para associar com vários cancros [10], [11]. No entanto, pouco se sabe sobre a função miRNA-204 em câncer gástrico. Matsushima realizado estudo matriz miRNA em H. pylori tecidos e contols positivos e descobriram que a expressão de miR-204 foi significativamente menor em H. pylori tecidos positivos [12].

Nos seres humanos, a região determinante do sexo Y (SRY ) a família de caixa, também se referiu à família SOX, dispõe de 20 fatores de transcrição altamente conservadas que desempenham papéis importantes no desenvolvimento do câncer de próstata [13]. Estes factores de transcrição são definidos por uma sequência de assinatura de domínio conservado no grupo de alta mobilidade (HMG) de ligação a DNA (DBD) [14], [15]. SOX4 é uma proteína de 47 kDa é altamente conservada em vertebrados e a sua importância clínica tem vindo a ganhar cada vez mais atenção nos últimos anos, com numerosos relatos sugerindo que SOX4 pode contribuir para a progressão tumoral [16], [17]. O aumento da expressão SOX4 é encontrada em tumores da bexiga, da próstata, do cólon e, e com tumores do pulmão de não-pequenas células-[18] - [21]. expressão desregulada de SOX4 tem sido correlacionada com o aumento da proliferação de células de cancro, a sobrevivência da célula, a inibição da progressão tumoral e apoptose no cancro gástrico [22]. Sua sobre-expressão também tem sido relacionada com mau prognóstico nas clínicas e é um marcador para prever o resultado de pacientes com câncer gástrico [23]
.

No entanto, até recentemente, não está claro que se H. pylori pode induzir a expressão SOX4 através baixo regulação miR-204. Assim, realizamos nosso estudo para investigar o papel de miR-204 e SOX4 em H. pylori carcinogênese induzida.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

Os pacientes com ou sem H. pylori
tinha sofrido gastroscópio no primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica de Nanjing, província de Jiangsu, na China a partir de Março de 2012 e dezembro de 2013. as amostras retiradas dos 250 pacientes (150 pacientes não cancerosos e 100 pacientes com tumor) foram recolhidos e foram identificados positivo quando o teste rápido da urease foi positivo. Estes pacientes selecionados também foram confirmados por ^{teste de 13C respiração. pacientes não cancerosos foram classificados em gastrite superficial, gastrite atrófica e displasia de acordo com a classificação patológica. Este protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética do primeiro hospital afiliada da Universidade Médica de Nanjing, e cada paciente havia consentimento informado por escrito.}

cultura celular

SGC-7901 /MKN45 linhas celulares de cancro gástrico ( adquirido a partir de ATCC) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibico) e penicilina (100 U /ml). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO _2.

cultura e infecção bacteriana modelo

H. pylori foi inoculada em placa e cultivados a 37 ° C numa atmosfera microaerofílica com 5% de O _{2, 10% de CO 2 e 85% N 2. Após 3 dias, o bacteriano foi ressuspenso em meio RPMI-1640 sem FBS e as células infectadas em um MOI de 100. As células foram então colhidas após 48 horas de infecção.}

Isolamento de ARN total e RT-PCR quantitativo

Os ARNs totais foram extraídos a partir de tecidos recolhidos e linhas celulares utilizando Trizol (Tarkara, Japão) e então ambos miARN e ARNm foram transcritos modo reverso para ADNc. A transcrição reversa foi realizada utilizando o kit de transcrição reversa (Takara, Japão). A expressão de miARNs maduros e genes alvo potenciais foram medidos por qRT-PCR com o Kit de SYBR Green PCR (Takara) de Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System e ARN U6 humano foi amplificada como um controlo interno. A proporção relativa de expressão de miR-204 foi calculada pelo método -ΔΔCT 2 ^{. As reacções de PCR foram realizadas com os seguintes iniciadores: para HSA-miR-204, para a frente, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'e para U6, para a frente, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. os níveis de expressão relativa de ARNm SOX4 foram examinadas por SYBR Green PCR em tempo real (RT-PCR) e normalizadas para GAPDH. Os iniciadores para a frente SOX4 foram, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' e inverso, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; e para GAPDH, para a frente, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'e inverso, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR foi realizada utilizando o ABI 7500 rápido Tempo Real-sistema de PCR (ABI, CA, EUA).}

A imuno-histoquímica

Os tecidos foram fixados em paraformaldeído a 4% e cortados a partir de blocos de parafina de 5 um de espessura. Depois de desparafinagem com xileno e re-hidratação com uma série graduada de etanol, as lâminas foram aquecidos em autoclave durante três minutos, utilizando tampão de citrato de sódio (pH 6,0) e incubadas com o anticorpo SOX4 (tecnologia de sinalização celular) a 4 ° C durante a noite. Tampão de bloqueio de soro ou de diluição de anticorpo foi utilizado como controlo negativo. Os anticorpos utilizados antes foram as mesmas que para a análise de Western blot. As fotografias foram tiradas por microsope (Nikon, o Eclipse 50i). O número de células coradas positivamente mostrando imunorreactividade de SOX4 em dez campos microscópicos representativos foram contadas, e a percentagem de células positivas também foi calculada. A percentagem de células tumorais de pontuação imunorreactivas foi descrito como se segue: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), e 3 (> 50%). A intensidade foi pontuado como se segue: 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderada), e 3 (forte). O nível de SOX4 expressão foi medida multiplicando a percentagem ea pontuação intensidade. amostras alta expressão significa tumores com uma pontuação multiplicada superior a 4, enquanto os outros foram considerados baixos expressão.

A proliferação celular assasy

A proliferação celular foi examinada utilizando um ensaio de sal de tetrazólio solúvel em água usando o celular contando Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão). Em resumo, células (1,5 x 10 ^{3 /poço) foram semeadas em placas de cultura de 96 cavidades, em triplicado, e incubadas durante 4 dias a 37 ° C /5% de CO2 num incubador humidificado. As células viáveis ​​foram quantificadas em cada intervalo de 24 h através da medição OD450 utilizando leitor de microplacas. (Epoch; BioTek, Winooski, VT)}

As células (2 x 10 ^{6) foram fixadas com 75% de etanol a 4 ° C durante a noite e, em seguida, lavou-se com PBS frio e tratou-se com RNaseI, seguido por coloração com iodeto de propídio durante 30 min no escuro. análise do ciclo celular foi, então, realizada por citometria de fluxo (FACSCalibur; Becton Dickinson, Sparks, MD).}

As células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 6 poços (500 células /poço) e cultivadas durante 2 semanas. As colónias foram coradas com violeta de cristal a 1% durante 30 min após fixação com paraformaldeído a 4% durante 30 minutos. O número de colónias, definida como > 50 células /colónias foram contadas. Foram realizados três experimentos independentes. Os dados foram calculados por meio do teste t pareado.

ensaio de migração celular (cicatrização de feridas)

Um ensaio de cicatrização foi utilizado para avaliar a capacidade da motilidade de células tumorais. Resumidamente, as células (1 * 10 ^{6 /po) foram semeadas em placas de seis poços, cultivadas durante a noite, e transfectadas com miR-204 imita ou inibidor, pcDNA-SOX4 ou pcDNA-NC. Em atingindo a confluência, a camada de células foi riscada com uma ponta de plástico estéril e depois lavou-se duas vezes com meio de cultura e cultivadas novamente durante até 48 com forma reduzida de soro contendo 1% de FBS. O fechamento do gap foi medido e os dados foram resumidas com base em ensaios sêxtuplo para cada experimento.}

invasão celular ensaio

atividade celular invasão foi avaliada através de inserções de cultura de células revestidas com matriz de membrana basal (BD Biosciences , Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, um total de 1 × 105 células em 0,2 ml de meio isento de soro RPMI-1640 foram semeadas num aparelho Transwell. RPMI-1640 contendo FBS a 10% (600 ul) foi adicionada à câmara inferior. A seguir à incubação das células durante 24 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%, as células sobre a superfície de topo do inserto foram removidos por limpeza com uma mecha de algodão. As células que invadiram para a superfície inferior do inserto foram fixadas em metanol a pré-arrefecimento de 100% durante 30 minutos, coradas com violeta de cristal a 0,5% durante 30 min, em seguida, lavadas em PBS e sujeitas a uma inspecção microscópica. As células foram contadas sob o microscópio em cinco campos aleatórios ea invasão relativa e migração foram interpretados como o número médio de células ± desvio padrão por campo.

foram preparados Ocidental blotting

Total de proteínas e quantificadas usando um ensaio de proteína (método BCA, Thermo, EUA). As proteínas foram fraccionadas através de sulfato de electroforese de sódio dodecil em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana, bloqueados em leite em pó a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora e imunocoradas com anticorpos a 4 ° C durante a noite utilizando anti-SOX4 ( 1:1000, CST, EUA), anti-N-caderina (1:1000, CST, EUA) e anti-e-caderina (1:1000, CST, EUA). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, EUA) foi usada como um controlo de carga. Os resultados foram visualizados por meio de um sistema de detecção quimioluminescente (sistema de detecção de mancha de Pierce ECL Substrato Ocidental, Thermo, Pittsburgh, PA) e, em seguida, expostos em Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules, CA).

construção do plasmídeo

Previsão de locais de ligação de miR-204 foi realizada utilizando software TargetScan (http://www.targetscan.org). sequência 3'UTR do SOX4 que foi previsto para interagir com miR-204 ou uma sequência mutante com os locais alvo previstos foram inserido nos locais KpnI e SacI do vector de promotor pGL3 (Invitrogen). Eles foram nomeados pGL3-SOX4 e-pGL3-SOX4 Mut. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços e foram transfectadas com 100 ng de pGL3-SOX4 ou pGL3-SOX4-mut, e miR-204 imita (50 nm) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., CA, EUA). Nós normalizou as diferenças na eficiência de transfecção por co-transfecção de um vector de luciferase de Renilla pRL-SV40 (5 ng).

SOX4 gene foi sintetizado (adquirido a partir de Genscript, Piscataway, NJ) com a digestão restritiva usando Mlu I e subclonado plasmídeo PLV-GFP, e nomeado PLV-GFP-SOX4. lentivírus recombinante foi gerado a partir de células 293T usando a precipitação com fosfato de cálcio. linhas celulares de SGC-7901 foram transfectadas com lentivírus com polibreno (8 ug /ml).

actividades de luciferase análise

As células foram cultivadas em placas de 24 cavidades e foram transfectadas com 0,2 ug de qualquer wide tipo de mutante ou plasmídeo pGL-SOX4 contendo a luciferase do pirilampo, juntamente com 0,01 ug do vector pGL-SOX4 (Invitrogen) contendo luciferase de Renilla e 1 ug oligonucleótidos. A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 reagente (Invitrogen). a actividade de luciferase relativa foi calculada 48 h pós-transfecção pelo duplo de Luciferase Reporter Assay (Promega). Todas as experiências de transfecção foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes, independentemente. Os dados são expressos como a média ± SD.

A análise estatística

t de Student ou análise de uma via de variância foi utilizada para análise estatística, quando apropriado. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Um valor de duas caudas de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

miR-204 é aberrante regulada para baixo em H.. pylori
tecidos e células positivas

A expressão de miARN seleccionados de acordo com os dados de microarray anteriores [10] foram detectados em 75 pares de H. pylori tecidos normais positivos e negativos, e 50 pares de H. pylori positiva e tecidos tumorais negativas por PCR em tempo real. Descobrimos que o miR-204 foi uma das mais significativas miARNs sub-regulada sobre a infecção por H. pylori (Figura S1A, Figura 1A, B). Além disso, o miR-204 foi expressa em níveis inferiores na gastrite mais grave (Figura 1C). Nós ainda comparado a sua expressão em tecidos tumorais com tecidos normais, independentemente do status H. pylori e descobriram que miR-204 foi expressa significativamente menor nos tumores (Figura s1b). Dividimos os pacientes com tumor de acordo com diferentes estágios TNM e pacientes T2-T4 e M1 expressa significativamente menor miR-204 do que os pacientes T1 e M0 (Figura S1C, S1D). Examinámos também o miR-204 a expressão em células infectadas com H. pylori e verificou-se que a expressão de miR-204 foi significativamente menor em múltiplos H. pylori células do que o controlo (Figura 1D, Figura S1E) infectados.

miR-204 suprime a migração /invasão e proliferação de células cancerosas gástricas em SGC-7901 e MKN-45 células

Nós transfectadas células SGC7901 e MKN45 com HSA-miR-204 mímicos /oligonucleotídeos inibidor e examinou os efeitos sobre proliferação celular e migração /invasão. Em primeiro lugar, foi realizado de qRT-PCR para verificar a eficácia de transfecção, conforme indicado na Fig. 2A, a transfecção de células com miR-204 imita /inibidor mostrou aumentar significativamente /diminuição de miR-204 expressão em comparação com o controle negativo (NC /INC). Wound healing ensaio mostrou que a sobre-expressão de miR-204 poderia suprimir a migração celular, enquanto que a sua knockdown induziu a migração de células, com diferença significativa mais perto do que o controlo (Figura 2B). Consistentemente, ensaio de invasão de Matrigel também mostrou que a sobre-expressão de miR-204 atenuada invasão de células, ao passo que knockdown de que poderia reverter a alteração (Figura 2C). Nós também realizado um ensaio MTT e descobriram que a taxa de crescimento das células transfectadas com o miR-204 inibidor foi significativamente aumentada em comparação com os controlos, enquanto as células com miR-204 foi imita mostrou a diferente (Figura 3A, B). Nós também examinado se o ciclo celular seria afectada pela knockdown /sobre-expressão de miR-204 utilizando células activadas por fluorescência (FACS) de células de propídio-iodeto-coradas. Knockdown de miR-204 resultou num aumento significativo nas percentagens de células nas fases G2 enquanto que a sobre-expressão mostrou o efeito oposto (Figura 3C). Os ensaios de formação de colónias revelou que a inibição de miR-204 aumentou significativamente a taxa de crescimento das linhas celulares (Figura 3D). Também comparamos as funções das células de transfecção com o miR-204 imita com imita e infecção por H. pylori. Descobrimos que miR-204 imita poderia suprimir a migração celular, invasão e proliferação após infecção por H. pylori (Figura S2). Estes resultados em conjunto mostrou que a sub-regulação de miR-204 induzida por infecção por H. pylori promover a migração /invasão e proliferação da linha celular de cancro gástrico in vitro.

miR-204 sobre-regulado SOX4 expressão em cancro gástrico

Foram identificados os alvos a jusante de miR-204 por previsão computacional para elucidar os mecanismos pelos quais o miR-204 suprimiram a invasão de células do cancro gástrico. Entre centenas de genes preditos pela linha miRNA website previsão alvo (Base Estelar, http://starbase.sysu.edu.cn/), nós forcused nossa atenção em SOX4. SOX4 tinha sido relatado para regular a progressão do cancro gástrico e EMT ou agir como um alvo funcional subjacente de miR-204. Para identificar a predição, por meio de qRT-PCR e imuno-histoquímica, descobrimos que SOX4 foi regulado para cima em H. pylori tecidos positivos. Sua expressão também foi maior no CAG de CG em H. pylori tecidos positivos. (N = 75, p < 0,05; Figura 4A-C), que foi correlacionada inversamente com o miR-204. Usando a análise de correlação de Pearson da expressão de mRNA SOX4-miR-204, obteve-se uma correlação inversa estatisticamente significativa (Figura S3A, R = -0,849, P = 0,002). Usando imunohistoquímica, também descobrimos que a expressão SOX4 foi significativamente associada com histologia gástrica (p < 0,05; Tabela 1). In vitro, também descobrimos que mRNA SOX4 e nível de proteína foram regulados positivamente em células cancerosas gástricas infectados por H. pylori (Figura S3B, S3C). Em seguida, determinou-se a expressão de SOX4 em resposta às alterações na expressão de miR-204. Western blot e ensaios de qRT-PCR mostrou que a sobre-expressão de miR-204 poderia significativamente regular negativamente a expressão de mRNA e proteína de SOX4, enquanto o efeito de knockdown de miR-204 foi o oposto (Figura 3D). Nós também descobrimos que a expressão dos marcadores de EMT, N-caderina e E-caderina, também foi mudada relacionado com miR-204 de expressão (Figura 4E), o que sugeriu que o miR-204 poderia afectar o processo de TEM.

SOX4 é um gene alvo directo de miR-204 em células de cancro gástrico

SOX4 Embora tenha sido considerada como um alvo directo de miR-204, não é claro se o miR-204 pode reconhecer directamente o 3'-UTR mRNA SOX4. De acordo com o local de destino previsto a partir TargetScan, que clonado o fragmento 3'-UTR, contendo o local previsto para o vector repórter de luciferase pGL3 (pGL3-SOX4). O fragmento 3'-UTR com a sequência mutada no local alvo previsto também foi clonado como um controlo (pGL3-SOX4-mut). Os resultados mostraram que a co-transfecção com o miR-204 e imita o vector pGL3-SOX4 diminuiu a actividade da luciferase em células de SGC-7901. No entanto, o miR-204 imita não tem efeito sobre a actividade de luciferase quando as células foram transfectadas com o vector pGL3-SOX4-mut (Figura 5). Estes dados sugerem que o gene SOX4 foi um dos alvos diretos de miR-204.

Sobre-expressão de SOX4 tem o efeito de miR-204 em células de câncer gástrico invasão

Para determinar SOX4 como efetor funcional do miR-204 na invasão câncer gástrico, nós SOX4 sobre-expressos por transfecção com lentivírus e examinou seus efeitos nas células cancerosas gástricas. A sobre-expressão de SOX4 na linha celular foi confirmada por Western blotting (Figura 6A). Nós também descobrimos que a E-caderina foi regulada para baixo, enquanto N-caderina foi regulada após transfecção PLV-SOX4. Através de cicatrização de feridas e o ensaio de invasão de Matrigel, em seguida, nós descobrimos que a sobre-expressão de SOX4 promoveu significativamente células migração e invasão (Figura 6B e 6C). A fim de demonstrar ainda que o miR-204 induziu a perda de proliferação SOX4 suprimida e a invasão de células de cancro gástrico, as células foram transfectadas com o miR-204 imita e SOX4 sobre-expressão de vector em conjunto e os resultados mostraram que a supressão da migração, invasão e proliferação de miR-204 foi atenuada (Figura S4).

Discussão

O câncer gástrico é uma doença em todo o mundo com uma incidência elevada, especialmente no Sudeste Asiático [21]. A taxa de sobrevida em 5 anos para o câncer gástrico é bastante baixa. Alguns dos pacientes com câncer gástrico foram H. pylori relacionado. Portanto, é necessário investigar minuciosamente a patogênese e desenvolver novos tratamentos direcionados para o H. pylori relacionada ao câncer gástrico.

miRNAs são uma grande família de genes reguladores que regulam negativamente seus mRNAs alvo de uma forma específica de sequência. miARN pode também funcionar como supressores de tumores ou oncogenes [22]. Evidências recentes sugerem que miARNs desempenham papéis essenciais em vários processos biológicos relacionados com cancro, incluindo a diferenciação celular, proliferação, tumorignesis, angiogénese, invasão e metástase [23]. MiR-204 tem sido relatado para funcionar como um supressor tumoral e a expressão de baixo nível de miR-204 está associada a um fenótipo de prognóstico pobre em doentes com cancro [24], [25]. No entanto, havia poucos estudos que investigam miR-204 em função de H. pylori relacionada ao câncer gástrico. Aqui, nós foram os primeiros a apresentar provas de que o miR-204 foi significativamente regulada em H. pylori tecidos positivos (tecidos normais e tumorais) e que a sobre-expressão de miR-204 expressão da proteína SOX4 suprimida e o crescimento de células derivadas de tumor gástrico.

em primeiro lugar, quantificada a expressão de miR-204 em tecidos de infecção por H. pylori e controles e descobrimos que a expressão de miR-204 é significativamente menor em H. Pylori pacientes infectados. Nós também descobrimos que a expressão está relacionado com a histologia dos pacientes, isto é, a expressão de miR-204 é significativamente mais baixa em pacientes positivos para H. pylori com gastrite atrófica crónica do que a gastrite atrófica crónica não. Este padrão de expressão mostraram que a possibilidade de que o miR-204 está relacionado com diferentes tipos de gastrite e quanto mais grave a pacientes eram, menor a expressão de miR-204 foi. Com base no nível de expressão de miR-204, nós escolhemos células MKN45 SGC-7901 e para o subsequente ganho-de-função e estudos de perda de função, respectivamente. Os resultados sugerem que a sub-regulação de miR-204 em células de cancro gástrico está relacionada com a sua progressão. Embora um grande número de miARNs humanos têm sido relatados, muitos dos seus alvos de ARNm permanecem não identificados [9]. Neste estudo, foi utilizado um bioinformática combinado e abordagem experimental para identificar que SOX4 são o alvo a jusante funcional do miR-204.

SOX4 é sobre-expresso em vários tipos de câncer e estava estreitamente correlacionada com a invasão tumoral e metástase [ ,,,0],16] - [19]. É também um dos membros de indutores EMT-transcricional [26]. EMT é um programa de desenvolvimento chave que muitas vezes é ativado durante a progressão do câncer e pode promover a resistência à terapia [27]. Zhang et al [20] demonstraram que a sobre-expressão de SOX4 em células epiteliais mamárias humanas levou à aquisição de características mesenquimais, e a migração de células e reforçada invasão. Além disso, SOX4 regulada positivamente a expressão de indutores conhecidos EMT e activada a via de TGF-β contribuir para EMT [28]. Até à data, EMT é um alvo atractivo para a intervenção terapêutica, fornece uma nova base de progressão do carcinoma em direcção estados malignas indiferenciadas e mais [29]. Nosso estudo mostrou que, em primeiro lugar infecção por H. pylori induzida miR-204 para baixo regulamentação pode levar a câncer gástrico pelo processo de EMT.

Para concluir, a nossa prova indicaram que miR-204 foi regulada para baixo, enquanto SOX4 foi para cima regulada na infecção por H. pylori e câncer gástrico. Ectópica expressão de miR-204 diminuiu a expressão SOX4 nos níveis de ARNm e de proteína na linha celular de cancro gástrico. Também demonstramos que o miR-204 foi directamente ligado ao 3'-UTR de SOX4. expressão de miR-204 inibiu EMT via repressão da SOX4. Além disso, a via de miR-204-EMT que identificamos podem ser explorados em uma abordagem terapêutica para o tratamento do H. pylori cancros relacionados.

Informações de Apoio
Figura S1.
(A) A expressão de 5 miARNs em H pylori tecidos positivos e negativos foi detectada por qRT-PCR. (B) Os níveis de expressão de miR-204 em tecidos de tumor e de controlo. (C) Os níveis de expressão de miR-204 de acordo com as fases TNM. (D) O nível de expressão de miR-204 em três tipos de H. pylori células infectadas. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF)
Figura S2.
As células transfectadas com o miR-204 imita e imita com infecção por H. pylori e viabilidades (A) foram determinados com CCK-8 ensaio (B) As imagens fotografadas em 0 h (superior) e 24 h (inferior) após o ferimento foram mostrados com uma ampliação de x200 (C) as imagens representativas de células invasivas na parte inferior da membrana coradas com violeta de cristal foram visualizados como mostrado. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s002
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Figura S3.
(A) A expressão de ARNm relativa de miR-204 e SOX4, normalizada com U6 e GAPDH, foi avaliada em 15 amostras de tecidos de H. pylori positivos e negativos por qRT-PCR. (B) uma correlação inversa de SOX4 e miR-204 níveis de expressão foi examinada (R = -0,920, P = 0,001). (C) A expressão de ARNm SOX4 foi determinada por qRT-PCR em H. pylori células infectadas. (D) A expressão do nível de proteína SOX4 foi determinado por western blot em H. pylori células infectadas. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s003
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Figura S4.
As células transfectadas com o miR-204 imita e imita com viabilidades (A) PLV-SOX4 e foram determinados com CCK-8 ensaio (B) As imagens representativas de células invasivas na parte inferior da membrana coradas com violeta de cristal foram visualizados como mostrando. (C) As imagens fotografadas em 0 h (superior) e 24 h (inferior) após o ferimento foram mostrados na ampliação de x200 (* p < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s004
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