PLOS ONE: Diminution de miR-204 à H. pylori-Associated cancer gastrique Favorise Cancer Cell prolifération et l'invasion par ciblage SOX4

Résumé

Contexte

Le mécanisme moléculaire entre Helicobacter pylori (H. pylori) et le cancer gastrique est resté largement inconnu. Dans cette étude, nous avons déterminé le rôle des miARN dans H. pylori induite par le cancer gastrique.

Méthodes et résultats

Nous avons constaté que miR-204 a diminué chez H. pylori tissus positifs par qRT- PCR. Knockdown de miR-204 a amélioré la prolifération et l'invasion capacité des cellules de cancer gastrique in vitro. dosage de la luciférase a été révélé que SOX4 gène cible de miR-204, qui a été trouvée régulée à la hausse dans les tissus positifs à H. pylori. La régulation de miR-204 et surexpression de SOX4 promu processus de transition épithéliale-mésenchymateuse.

Conclusion

Dans l'ensemble, nos résultats ont démontré que miR-204 peut agir comme un suppresseur de tumeur dans H. pylori induit le cancer gastrique en ciblant SOX4

Citation:. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Diminution de miR-204 à H. pylori-Associated cancer gastrique Favorise cancer Cell prolifération et Invasion en ciblant SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10.1371 /journal.pone.0101457

Editeur: Jin Cheng Q., H.Lee Moffitt Cancer Center & Institut de recherche, Etats-Unis d'Amérique

Reçu le 18 Mars 2014; Accepté 5 Juin 2014; Publié: 1 Juillet, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Zhou et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement:. Guoxin Zhang a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81270476) (http://www.nsfc.gov.cn/). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause principale de décès liés au cancer dans le monde [1]. À ce jour, les mécanismes moléculaires sur le cancer gastrique ont été étudiés, cependant, ils ne sont pas pleinement compris [2]. Les carcinomes gastriques sont censés se développer selon un processus en plusieurs étapes de la cancérogenèse, qui est fortement associée à l'infection par la bactérie pathogène, Helicobacter pylori
( H. pylori
) [3]. H. pylori
, qui colonise l'estomac de 50% de la population mondiale, a été classé comme une classe I carcinogène en raison de son rôle causal dans le développement du cancer gastrique [4].

Il a été rapporté que le développement et la progression du cancer de l'estomac peuvent être attribués à microARN (miARN) [5] - [8]. MiRNAs sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression des gènes cibles par la répression ou l'ARN messager de la traduction (ARNm) dégradation [9]. MiR-204 expression aberrante a été signalé à associer à divers cancers [10], [11]. Cependant, on sait peu sur la fonction miRNA-204 dans le cancer gastrique. Matsushima effectué miRNA étude de tableau dans H. pylori tissus positifs et contols et a constaté que l'expression de miR-204 était significativement plus faible chez H. pylori tissus positifs [12].

Chez l'homme, la région de détermination du sexe Y (SRY ) la famille de la boîte, également appelée la famille SOX, comprend 20 facteurs de transcription hautement conservées qui jouent un rôle important dans le développement du cancer de la prostate [13]. Ces facteurs de transcription sont définis par une séquence de signature conservée dans le groupe de haute mobilité (HMG) domaine de liaison à l'ADN (DBD) [14], [15]. SOX4 est une protéine de 47 kDa est hautement conservée chez les vertébrés et de son importance clinique a gagné une attention croissante au cours des dernières années, de nombreux rapports suggérant que SOX4 peut contribuer à la progression tumorale [16], [17]. Une expression accrue de SOX4 se trouve dans les tumeurs de la vessie, de la prostate et du côlon, et non à petites cellules du poumon tumeurs [18] - [21]. l'expression dérégulée de SOX4 a été corrélée à une prolifération cellulaire accrue du cancer, la survie cellulaire, l'apoptose et l'inhibition de la progression tumorale dans le cancer gastrique [22]. Sa surexpression a également été liée à un mauvais pronostic dans les cliniques et il est un marqueur pour prédire les résultats des patients atteints de cancer gastrique [23]
.

Cependant, jusqu'à récemment, on ne sait pas que si H. infection pylori peut induire l'expression de SOX4 par régulation négative miR-204. Ainsi, nous avons réalisé notre étude pour étudier davantage le rôle de miR-204 et SOX4 dans H. pylori carcinogenèse induite.

Les Matériaux et méthodes Echantillons cliniques

Les patients avec ou sans H. infection pylori
avaient subi gastroscope à The First Affiliated Hospital de l'Université médicale de Nanjing, province du Jiangsu, en Chine à partir de Mars 2012 et Décembre 2013. les échantillons prélevés sur les 250 patients (150 patients non cancéreux et 100 patients atteints de tumeurs) ont été recueillis, et ont été identifiés positifs lorsque le test rapide à l'uréase était positive. Ces patients sélectionnés ont également été confirmées par ^{Test 13C souffle. patients non cancéreuses ont été classés en gastrite superficielle, la gastrite atrophique et la dysplasie selon la classification pathologique. Ce protocole a été approuvé par le Comité d'éthique du premier hôpital affilié de l'Université médicale de Nanjing, et chaque patient avait écrit le consentement éclairé.}

culture
Cell

SGC-7901 /MKN45 lignées cellulaires de cancer gastrique ( achetées auprès de l'ATCC) ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) (Gibico) et de la pénicilline (100 U /ml). Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO _2.

culture et de l'infection bactérienne modèle

H. pylori a été inoculé dans la plaque et mises en culture à 37 ° C dans une atmosphère microaérophile avec 5% d'O _{2, 10% de CO 2 et 85% N 2. Au bout de 3 jours, le bactérien est remis en suspension dans du milieu RPMI-1640 sans FBS et les cellules infectées dans une MOI de 100. Les cellules ont ensuite été récoltées après 48 h d'infection.}

Isolement de l'ARN total et RT-PCR quantitative

les ARN totaux ont été extraits de tissus prélevés et des lignées cellulaires en utilisant du Trizol (Tarkara, Japon) et puis les deux miARN et l'ARNm ont été transcrites en ADNc inverse. La transcription inverse a été réalisée en utilisant le kit de transcription inverse (Takara, Japon). L'expression des miARN matures et les gènes cibles potentiels ont été mesurés par qRT-PCR avec le kit SYBR Green PCR (Takara) sur le système Applied Biosystems StepOne-Plus PCR en temps réel et de l'ARN U6 humain a été amplifié en tant que contrôle interne. Le rapport relatif d'expression de miR-204 a été calculé par la 2 ^{-ΔΔCT procédé. Les réactions de PCR ont été réalisées avec les amorces suivantes: pour hsa-miR-204, vers l'avant, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'et U6, avant, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. les niveaux d'expression relatifs des ARNm SOX4 ont été examinés par SYBR Green PCR en temps réel (RT-PCR) et normalisé à la GAPDH. Les amorces pour SOX4 étaient en avant, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' et inverse, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; et pour GAPDH, en avant, CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA 5'-3 'et inverse, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR a été réalisée en utilisant le système ABI 7500 rapide PCR en temps réel (ABI, CA, USA).}

immunohistochimie

Tissues ont été fixés à 4% de paraformaldehyde et coupé du bloc de paraffine 5 um d'épaisseur. Après déparaffinage avec du xylène et la réhydratation avec une série graduée d'éthanol, les lames ont été chauffées dans l'autoclave pendant trois minutes en utilisant un tampon citrate de sodium (pH 6,0) et incubées avec le SOX4 d'anticorps (Cell Technology signalisation) à 4 ° C pendant une nuit. un tampon de dilution du sérum ou de l'anticorps de blocage a été utilisé comme témoin négatif. Les anticorps utilisés auparavant étaient les mêmes que pour l'analyse par transfert de Western. Les photographies ont été prises par microsope (Nikon, ECLIPSE 50i). Le nombre de cellules à coloration positive montrant une immunoréactivité de SOX4 dans dix champs microscopiques représentatifs a été compté, et le pourcentage de cellules positives a également été calculé. Le pourcentage de pointage des cellules tumorales immunoréactives a été décrite comme suit: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) et 3 (> 50%). L'intensité a été marqué comme suit: 0 (négatif), 1 (faible), 2 (modérée), et 3 (forte). Le niveau de SOX4 d'expression a été mesurée en multipliant le pourcentage et le score d'intensité. échantillons élevés d'expression signifie tumeurs avec un score multiplié supérieur à 4 tandis que les autres ont été considérés comme une faible expression.

La prolifération cellulaire assasy

La prolifération cellulaire a été examiné en utilisant un dosage de sel de tétrazolium soluble dans l'eau en utilisant la cellule comptage Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japon). En bref, les cellules (1,5 x 10 ^{3 /puits) ont été ensemencées dans 96 puits des plaques de culture en triple exemplaire, et incubé pendant 4 jours à 37 ° C /5% de CO2 dans un incubateur humidifié. Les cellules viables ont été quantifiés à chaque intervalle de 24 h en mesurant DO450 en utilisant un lecteur de microplaques. (Epoch; BioTek, Winooski, VT)}

Les cellules (2 x 10 ^{6) ont été fixés à 75% d'éthanol à 4 ° C pendant une nuit, puis lavé avec du PBS froid et on traite avec RNaseI, suivie par coloration à l'iodure de propidium pendant 30 min dans l'obscurité. L'analyse du cycle cellulaire a ensuite été réalisée par cytométrie de flux (FACSCalibur, Becton Dickinson, Sparks, MD).}

Les cellules ont été trypsinisées et étalées sur des plaques de 6 puits (500 cellules /puits) et cultivées pendant 2 semaines. Les colonies ont été colorées avec du cristal violet à 1% pendant 30 minutes après fixation avec 4% de paraformaldehyde pendant 30 minutes. Le nombre de colonies, définies comme > 50 cellules /colonie ont été comptées. Trois expériences indépendantes ont été réalisées. Les données ont été calculées en utilisant le test t apparié.

test de migration cellulaire (guérison des plaies)

Un test de cicatrisation a été utilisé pour évaluer la capacité de la motilité des cellules tumorales. En bref, les cellules (1 * 10 ^{6 /puits) ont été ensemencées dans des plaques à six puits, cultivées pendant la nuit, et transfectées avec miR-204 imite ou inhibiteur, pcDNA-SOX4 ou pcDNA-NC. En arrivant à confluence, la couche cellulaire a été gratté avec un embout en plastique stérile, puis lavé avec un milieu de culture à deux reprises et on les cultive à nouveau pendant jusqu'à 48 avec un milieu de sérum réduit contenant 1% de FBS. La fermeture de l'écart a été mesurée et les données ont été basées succincts sur les essais de sextuples pour chaque expérience.}

invasion cellulaire test

L'activité de l'invasion des cellules a été évaluée en utilisant des inserts de culture cellulaire enrobées de matrice de membrane basale (BD Biosciences , Bedford, MA) selon les instructions du fabricant. En bref, un total de 1 x 105 cellules dans 0,2 ml sans sérum milieu RPMI-1640 ont été ensemencées sur un appareil Transwell. RPMI-1640 contenant 10% de FBS (600 ul) a été ajouté à la chambre inférieure. Après l'incubation des cellules pendant 24 h à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2, les cellules sur la surface supérieure de l'insert ont été éliminées par essuyage avec un coton-tige. Les cellules qui avaient envahi la surface inférieure de l'insert ont été fixées dans le methanol prérefroidissement 100% pendant 30 minutes, colorées dans 0,5% de cristal violet pendant 30 minutes, puis on rince dans du PBS et soumis à une inspection au microscope. Les cellules ont été comptées au microscope dans cinq champs aléatoires et l'invasion relative et la migration ont été interprétés comme le nombre moyen de cellules ± écart type par champ.

Western blot

Les protéines totales ont été préparés et quantifiés à l'aide un dosage de protéines (méthode BCA, Thermo, États-Unis). Les protéines ont été fractionnées par le sodium dodécyl sulfate sur gel de Polyacrylamide (SDS-PAGE) transférée au fluorure de polyvinylidène (PVDF) à membrane, bloqué dans 5% de lait sec à la température ambiante pendant 1 heure et à une immunocoloration avec des anticorps à 4 ° C pendant une nuit en utilisant l'anti-SOX4 ( 1:1000, CST, USA), anti-N-cadhérine (1:1000, CST, USA) et anti-E-cadhérine (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, sigma, USA) a été utilisé comme un contrôle de chargement. Les résultats ont été visualisés grâce à un système de détection chimioluminescent (Pierce ECL système de détection de blot Substrat Western, Thermo, Pittsburgh, PA), puis exposée dans Molecular Imager système ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Hercules, CA).

Construction de plasmide

Prédiction de sites de liaison miR-204 a été réalisée en utilisant le logiciel TargetScan (http://www.targetscan.org). la séquence 3 'UTR de SOX4 qui a été prévu pour interagir avec miR-204 ou une séquence mutante avec les sites cibles prédites ont été insérés dans les sites Kpnl et Sacl du vecteur du promoteur pGL3 (Invitrogen). Ils ont été nommés pGL3-SOX4 et pGL3-SOX4-mut. Les cellules ont été étalées sur des plaques de 6 puits et ont été transfectées avec 100 ng de pGL3-SOX4 ou pGL3-SOX4-mut, et miR-204 imite (50 nM) en utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA). Nous avons normalisé les différences dans l'efficacité de transfection par co-transfection d'une luciférase de vecteur de Renilla pRL-SV40 (5 ng).

gène SOX4 a été synthétisé (acheté auprès Genscript, Piscataway, NJ) à une digestion restrictive à l'aide Mlu I et sous-cloné pLV-GFP plasmide, et nommé pLV-GFP-SOX4. lentivirus recombinant a été généré à partir de cellules 293T en utilisant la précipitation au phosphate de calcium. des lignées de cellules CGT-7901 ont été transfectées avec l'aide d'un lentivirus polybrène (8 ug /ml).

activités luciferase analyse

Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 24 puits et transfectées avec 0,2 pg de soit généralisée type ou mutant pGL-SOX4 plasmide contenant la luciférase de luciole, avec 0,01 pg du vecteur pGL-SOX4 (Invitrogen) contenant Renilla luciférase et 1 ug d'oligonucléotides. La transfection a été réalisée en utilisant de la Lipofectamine 2000 réactif (Invitrogen). activité luciférase relative a été calculée à 48 h après la transfection par le double Reporter Assay Luciferase (Promega). Toutes les expériences de transfection ont été effectuées en trois exemplaires et répétées trois fois de façon indépendante. Les données sont exprimées en moyenne ± SD.

L'analyse statistique

test t de Student ou d'une analyse de variance a été utilisée pour l'analyse statistique, le cas échéant. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Une valeur à deux queues de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

Résultats

miR-204 est aberrantly régulée à la baisse dans les H.. les tissus et les cellules positives de pylori

L'expression de miARN sélectionnés selon les données de puces à ADN précédentes [10] ont été détectés dans 75 paires de H. pylori tissus normaux positifs et négatifs, et 50 paires de H. pylori positif et des tissus de tumeur négatives par PCR en temps réel. Nous avons constaté que miR-204 est l'un des plus importants miARN régulés à la baisse sur l'infection à H. pylori (Figure S1A, Figure 1A, B). En outre, miR-204 a été exprimé à des niveaux inférieurs à la gastrite plus sévère (figure 1C). En outre, nous avons comparé l'expression dans les tissus tumoraux avec des tissus normaux, indépendamment de la présence de H. pylori et a constaté que miR-204 a été exprimée dans des tumeurs significativement plus faible (figure S1B). Nous avons divisé les patients avec une tumeur selon différents stades TNM et patients T2-T4 et M1 exprimé significativement plus faible miR-204 que les patients T1 et M0 (Figure S1C, S1D). Nous avons également examiné miR-204 expression dans les cellules infectées par H. pylori et nous avons constaté que l'expression de miR-204 était significativement plus faible dans plusieurs H. pylori cellules que le contrôle (figure 1D, Figure S1E) infectés.

miR-204 supprime la migration /invasion et la prolifération des cellules de cancer gastrique dans SGC-7901 et MKN-45 cellules

Nous cellules transfectées SGC7901 et MKN45 avec hsa-miR-204 /miment inhibiteur oligonucléotides et examiné les effets sur la prolifération cellulaire et la migration /invasion. Tout d'abord, nous avons effectué qRT-PCR afin de vérifier l'efficacité de la transfection, comme il est indiqué sur la Fig. 2A, la transfection de cellules avec miR-204 imite /inhibiteur montré une augmentation significative /diminution de miR-204 expression par rapport à leur contrôle négatif (NC /Ine). Cicatrisation test a montré que la surexpression de miR-204 pourrait supprimer la migration des cellules, tandis que son effet de choc induit la migration des cellules, avec un espace plus proche significatif que le contrôle (figure 2B). Constamment, Matrigel test d'invasion a également montré que la surexpression de miR-204 atténué l'invasion des cellules, alors que knockdown de celui-ci pourrait inverser l'affection (figure 2C). Nous avons également effectué un test MTT et a constaté que le taux de cellules transfectées avec miR-204 inhibiteur de la croissance a été considérablement augmenté par rapport aux témoins tandis que les cellules avec miR-204 a été montré imite les différents (figure 3A, B). Nous avons également examiné si le cycle cellulaire serait affectée par l'effet de choc /surexpression de miR-204 en utilisant les cellules activées par fluorescence (FACS) l'analyse des cellules propidium iodure colorées. Knockdown de miR-204 a entraîné une augmentation significative du pourcentage des cellules dans les phases G2 tandis que la surexpression a montré l'effet inverse (figure 3C). Des dosages de formation de colonies ont révélé que l'inhibition de miR-204 a augmenté significativement le taux de lignées cellulaires (Figure 3D) de croissance. Nous avons également comparé les fonctions cellulaires de transfection avec miR-204 imite avec imite et l'infection à H. pylori. Nous avons constaté que miR-204 imite pourraient supprimer la migration cellulaire, l'invasion et la prolifération sur l'infection à H. pylori (Figure S2). Ces résultats ensemble ont montré que la régulation de miR-204 induite par l'infection à H. pylori promouvoir la migration /invasion et la prolifération de la lignée cellulaire de cancer gastrique in vitro.

miR-204 régulés à la hausse l'expression de SOX4 dans le cancer gastrique

Nous avons identifié les cibles en aval de miR-204 par prédiction de calcul pour élucider les mécanismes par lesquels miR-204 supprimée gastrique invasion des cellules cancéreuses. Parmi des centaines de gènes prédits par ligne miRNA site de prédiction cible (STARBASE, http://starbase.sysu.edu.cn/), nous forcused notre attention sur SOX4. SOX4 avait été rapporté pour réguler la progression du cancer gastrique et EMT ou agir comme une cible fonctionnelle sous-jacente de miR-204. Pour identifier la prédiction, par qRT-PCR et immunohistochimie, nous avons constaté que SOX4 était régulée à la hausse dans H. pylori tissus positifs. Son expression était également plus élevé dans l'ACG que CG chez H. pylori tissus positifs. (N = 75, p < 0,05; figure 4A-C), qui est en corrélation inverse avec miR-204. En utilisant l'analyse de corrélation de Pearson de SOX4-miR-204 expression de l'ARNm, nous avons obtenu une corrélation inverse statistiquement significative (Figure S3A, R = -0,849, P = 0,002). Utilisation de l'immunohistochimie, nous avons également découvert que l'expression de SOX4 était significativement associée à l'histologie gastrique (p < 0,05; tableau 1). In vitro, nous avons également constaté que SOX4 ARNm et des protéines ont été régulés à la hausse dans les cellules de cancer gastrique infectés par H. pylori (Figure S3B, S3C). Nous avons ensuite déterminé l'expression de SOX4 en réponse aux changements dans l'expression de miR-204. Western blot et des tests qRT-PCR ont montré que la surexpression de miR-204 peut réguler vers le bas de manière significative l'ARNm et l'expression des protéines de SOX4, tandis que l'effet du knock-down de miR-204 est à l'opposé (figure 3D). Nous avons également constaté que l'expression de marqueurs EMT, N-cadhérine et E-cadhérine, a également été modifiée liée à miR-204 expression (Figure 4E), qui a suggéré que miR-204 pourrait affecter le processus de EMT.

SOX4 est un gène cible directe de miR-204 dans des cellules de cancer gastrique

Bien que SOX4 a été considéré comme une cible directe de miR-204, il est difficile de savoir si miR-204 peut directement reconnaître la 3'-UTR de SOX4 ARNm. Selon le site cible prédite à partir Targetscan, on a clone le fragment 3 'UTR contenant le site prévu dans le vecteur rapporteur de luciférase pGL3 (pGL3-SOX4). Le fragment 3 'UTR de la séquence mutée dans le site cible prédite a également été clone sous la forme d'une commande (pGL3-SOX4-mut). Les résultats ont montré que la co-transfection avec miR-204 mimétiques et le vecteur pGL3-SOX4 diminution de l'activité luciférase dans les cellules CGT-7901. Cependant, miR-204 imite n'ont pas eu l'effet sur l'activité luciférase lorsque les cellules ont été transfectées avec le vecteur pGL3-SOX4-mut (Figure 5). Ces données suggèrent que le gène de SOX4 était l'une des cibles directes de miR-204.

surexpression de SOX4 a pour effet de miR-204 sur les cellules cancéreuses gastriques invasion

Pour déterminer SOX4 que l'effecteur fonctionnel de miR-204 dans l'invasion du cancer gastrique, nous avons surexprimé SOX4 par transfection avec des lentivirus et a examiné ses effets dans les cellules cancéreuses gastriques. Surexpression de SOX4 dans la lignée cellulaire a été confirmée par transfert de type western (figure 6A). Nous avons également constaté que la E-cadhérine a été régulée à la baisse tandis que la N-cadhérine était régulée à la hausse après la transfection pLV-SOX4. Grâce à la cicatrisation des plaies et l'analyse d'invasion de Matrigel, nous avons découvert que la surexpression de SOX4 significativement favorisée la migration des cellules et de l'invasion (figure 6B et 6C). Afin de mieux démontrer que miR-204 a induit la perte de SOX4 supprimé la prolifération et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques, les cellules ont été transfectées avec miR-204 mimiques et SOX4 surexpression vecteur ensemble et les résultats ont montré que la suppression de la migration, l'invasion et prolifération par miR-204 a été atténuée (figure S4).

Discussion

Le cancer gastrique est une maladie dans le monde avec une incidence élevée, notamment en Asie du Sud-est [21]. Le taux de survie à 5 ans pour le cancer gastrique est assez faible. Certains des patients atteints de cancer gastrique étaient H. pylori connexes. Par conséquent, il est nécessaire d'étudier à fond la pathogenèse et de développer de nouveaux traitements ciblés pour H. pylori liée au cancer gastrique.

MiRNAs sont une grande famille de régulateurs de gènes qui régulent négativement leurs ARNm cibles d'une manière spécifique à la séquence. miARN peuvent également fonctionner en tant que suppresseurs de tumeur ou oncogènes [22]. Une preuve récente suggère que les miARN jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques liés au cancer, y compris la différenciation cellulaire, la prolifération, tumorignesis, l'angiogenèse, l'invasion et les métastases [23]. MiR-204 a été rapporté pour fonctionner comme un suppresseur de tumeur et l'expression de faible niveau de miR-204 est associée à un phénotype de mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer [24], [25]. Cependant, il y avait quelques études portant sur miR-204 fonction H. pylori liée au cancer gastrique. Ici, nous avons été les premiers à présenter des preuves que miR-204 était significativement régulée à la baisse dans H. pylori tissus positifs (tissus normaux et tumoraux) et que la surexpression de miR-204 supprimé expression de la protéine SOX4 et la croissance des cellules provenant de tumeur gastrique.

Nous avons d'abord quantifié l'expression de miR-204 dans les tissus et les contrôles d'infection H. pylori et nous avons trouvé que l'expression de miR-204 est significativement plus faible chez H. pylori chez les patients infectés. Nous avons également constaté que l'expression est liée à l'examen histologique des patients, qui est, l'expression de miR-204 est significativement plus faible chez les patients positifs à H. pylori gastrite atrophique chronique que la gastrite atrophique chronique non. Ce schéma d'expression a montré que la possibilité que miR-204 est en relation avec les différents types de gastrites et les plus graves, les patients étaient le plus faible de l'expression de miR-204 a été. Sur la base du niveau d'expression de miR-204, nous avons choisi SGC-7901 et les cellules MKN45 pour respectivement ultérieure gain de fonction et des études de perte de fonction,. Les résultats suggèrent que la régulation de miR-204 dans la cellule d'un cancer gastrique est liée à sa progression. Bien qu'un grand nombre de miARN humains ont été signalés, la plupart de leurs ARNm cibles restent non identifiés [9]. Dans cette étude, nous avons utilisé un combiné bioinformatique et approche expérimentale pour identifier que SOX4 sont la cible en aval fonctionnelle de miR-204.

SOX4 est surexprimé dans divers cancers et a été étroitement corrélée avec l'invasion tumorale et les métastases [ ,,,0],16] - [19]. Il est également l'un des membres de l'EMT-transcriptionnel Inducteurs [26]. EMT est un programme clé du développement qui est souvent activée lors de la progression du cancer et peuvent favoriser la résistance à la thérapie [27]. Zhang et al [20] ont montré que la surexpression de SOX4 dans les cellules épithéliales mammaires humaines a conduit à l'acquisition de caractéristiques mésenchymateuses et la migration cellulaire améliorée et l'invasion. En outre, SOX4 régulée positivement l'expression des inducteurs EMT connus et activé la voie TGF-β pour contribuer à EMT [28]. À ce jour, EMT est une cible attrayante pour des interventions thérapeutiques, fournit une nouvelle base de la progression du cancer vers des états malins dédifférenciées et plus [29]. Notre étude a montré que tout d'abord l'infection H. pylori induit miR-204 régulation à la baisse pourrait conduire à un cancer gastrique par le processus EMT.

Pour conclure, nos éléments de preuve a indiqué que miR-204 a été régulée à la baisse, tandis que SOX4 était amont réglementé dans l'infection par H. pylori et le cancer gastrique. Ectopique expression miR-204 diminution de l'expression de SOX4 aux niveaux d'ARNm et de protéine dans la lignée cellulaire de cancer gastrique. Nous avons également démontré que miR-204 est directement lié à l'extrémité 3 'UTR de SOX4. expression miR-204 a inhibé EMT via la répression des SOX4. En outre, la voie miR-204-EMT que nous avons identifié peut être exploitée dans une approche thérapeutique pour le traitement des cancers liés H. pylori.

Informations complémentaires
Figure S1.
(A) L'expression de 5 miARN dans H pylori tissus positifs et négatifs a été détectée par qRT-PCR. Les niveaux d'expression de miR-204 dans des tissus tumoraux et de contrôle (B). (C) Les niveaux d'expression de miR-204 selon les étapes TNM. (D) Le niveau d'expression de miR-204 dans les trois types de cellules infectées par H. pylori. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF)
Figure S2.
cellules transfectées avec miR-204 imite et imite avec une infection à H. pylori et (A) viabilités ont été déterminées avec CCK-8 test (B) Les images photographiées à 0 h (supérieures) et 24 h (inférieure) après la blessure ont été montrées à un grossissement de x200 (C) les images représentatives des cellules invasives dans le bas de la membrane colorées avec du cristal violet ont été visualisés comme illustré. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s002
(TIF)
Figure S3.
(A) L'expression d'ARNm relative de miR-204 et SOX4, normalisé par U6 et GAPDH, a été évalué dans 15 spécimens de H. pylori tissus positifs et négatifs par qRT-PCR. (B) Une corrélation inverse de miR-204 niveaux d'expression et SOX4 a été examinée (R = -0,920, P = 0,001). (C) L'expression de l'ARNm SOX4 a été déterminée par qRT-PCR dans les cellules infectées par H. pylori. (D) L'expression du taux de protéine SOX4 a été déterminée par Western Blot dans les cellules infectées par H. pylori. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s003
(TIF)
Figure S4.
cellules transfectées avec miR-204 mimiques et mimétiques avec pLV-SOX4 et (A) viabilités ont été déterminées par dosage CCK-8 (B) Les images représentatives des cellules invasives dans le bas de la membrane colorées avec du cristal violet ont été visualisées sous forme de illustré. (C) Les images photographiées à 0 h (supérieures) et 24 h (inférieure) après la blessure ont été présentés à un grossissement de x200 (* p < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)

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