Фон
<р> молекулярный механизм между Helicobacter Pylori (H.) инфекции и рака желудка оставалась неизвестной. В данном исследовании мы определили роль микроРНК в H. Pylori индуцированного рака желудка.
Введение клинические образцы Пациенты с или без H. пилори SGC-7901 /MKN45 желудка линий раковых клеток ( приобретены у АТСС) культивировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Gibico) и пенициллина (100 Ед /мл). Клетки культивировали при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO <суб> 2. Всего РНК экстрагировали из собранных тканей и клеточных линий с использованием тризола (Tarkara, Япония), а затем как микроРНК и мРНК были обратной транскрипции в кДНК. Обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскрипции комплект (Takara, Japan). Выражение зрелых микроРНК и потенциальных генов-мишеней были измерены с помощью QRT-PCR с SYBR Green PCR Kit (Takara) на Applied Biosystems StepOne-Plus ПЦР в реальном времени системы и РНК U6 человек амплифицировали в качестве внутреннего контроля. Относительное соотношение экспрессии микроРНК-204 рассчитывалась по методу -ΔΔCT 2 . ПЦР-реакции проводили с помощью следующих праймеров: для HSA-MIR-204, вперед, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'и U6, вперед, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. Относительные уровни экспрессии мРНК SOX4 были исследованы SYBR Green ПЦР в реальном времени (RT-PCR) и нормированы на GAPDH. Праймеры для SOX4 были вперед, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' и обратный, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; и для GAPDH, вперед, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'и обратный, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. ОТ-ПЦР проводили с помощью быстрого ПЦР в реальном времени системы ABI 7500 (ABI, CA, USA). пролиферации клеток assasy Всего белков были получены и количественно с использованием проводили анализ протеина (метод BCA, Thermo, США). Белки фракционировали с помощью додецилсульфата электрофореза в полиакриламидном геле с натрия (SDS-PAGE), переданные в поливинилиденфторида (PVDF) мембрану, блокированной в 5% сухого молока при комнатной температуре в течение 1 ч и подвергали иммунному окрашиванию с антителами при 4 ° С в течение ночи с использованием анти-SOX4 ( 1:1000, CST, США), анти-N-кадгерина (1:1000, CST, США) и анти-Е-кадгерин (1:1000, CST, США). Анти-GAPDH (1:5000, Sigma, США) использовали в качестве контроля загрузки. Результаты были визуализированы с помощью хемилюминесцентной системы обнаружения (Система обнаружения блот Pierce СТЭК Субстрат Западная, Thermo, Питтсбург, штат Пенсильвания), а затем облучают в молекулярной системе Imager ChemiDoc РРС (Bio-Rad, Hercules, CA). люциферазы деятельность анализ Результаты MIR-204 аберрантно вниз регулируется в Н.. Pylori Обсуждение В заключение, наши данные показали, что микроРНК-204 был вниз регулируется, в то время как SOX4 был вверх регулируется в H. Pylori инфекции и рака желудка. Эктопическая экспрессия микроРНК-204 снижение экспрессии SOX4 на уровне мРНК и белка в желудочном линии раковых клеток. Мы также показали, что микроРНК-204 был непосредственно связан с 3'-UTR из SOX4. Выражение MIR-204 ингибирует EMT через репрессии SOX4. Кроме того, путь микроРНК-204-EMT, которые мы определили, могут быть использованы в качестве терапевтического подхода для лечения H. Pylori связанных видов рака.
<р> рак желудка является четвертым наиболее распространенной формой рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире [1]. На сегодняшний день, молекулярные механизмы, связанные с раком желудка были исследованы, тем не менее, они не полностью изучены [2]. Желудочный карцинома должны развиваться в соответствии с многоступенчатого процесса канцерогенеза, который прочно связан с инфекцией бактериальной патогена, хеликобактерной
( H. Пилори
) [3]. H. пилори
, которая колонизирует желудок 50% мирового населения, была классифицирована как класс I канцерогена из-за его причинную роль в развитии рака желудка [4].
<р> Сообщалось что развитие и прогрессирование рака желудка может быть связано с микроРНК (миРНК) [5] - [8]. МикроРНК малые, некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов-мишеней через трансляционной репрессии или матричной РНК (мРНК) деградации [9]. аберрантное экспрессия микроРНК-204 было сообщено ассоциировать с различных видов рака [10], [11]. Тем не менее, мало известно о функции микроРНК-204 при раке желудка. Matsushima проводили исследование микроРНК массива в H.pylori, положительные ткани и contols и обнаружили, что экспрессия микроРНК-204 была значительно ниже в антихеликобактерную положительных тканей [12].
<Р> У людей, область пола определения Y (SRY ) коробка семьи, также называют семейства SOX, включает в себя 20 высоко консервативных транскрипционных факторов, которые играют важную роль в развитии рака предстательной железы [13]. Эти факторы транскрипции определяются консервативную последовательность сигнатуры в ДНК-связывающего домена группы с высокой подвижностью (HMG) (DBD) [14], [15]. SOX4 представляет собой белок 47-кДа высоко консервативен у позвоночных и его клиническое значение приобрела все большее внимание в последние годы, с многочисленными сообщениями о том, что SOX4 может способствовать опухолевой прогрессии [16], [17]. Повышенная экспрессия SOX4 обнаруживается в опухолях мочевого пузыря, предстательной железы и толстой кишки, а также с немелкоклеточного клеток опухолей легких [18] - [21]. Дерегулированы экспрессия SOX4 коррелирует с пролиферацией раковых клеток увеличилось, выживание клеток, ингибирование апоптоза и прогрессирования опухоли при раке желудка [22]. Его избыточная экспрессия также связано с плохим прогнозом в клиниках и является маркером, чтобы предсказать исход больных раком желудка [23]
. <Р> Тем не менее, до недавнего времени, пока неясно, что ли H. инфекция может пилори индуцируют экспрессию SOX4 через вниз регулирующего MIR-204. Таким образом, мы провели наше исследование для дальнейшего изучения роли микроРНК-204 и SOX4 в хеликобактерной канцерогенез.
Материалы и методы
инфекция подверглась гастроскоп при первой филиал больницы Нанкин медицинского университета, провинция Цзянсу, Китай с марта 2012 года по декабрь 2013 года образцов, взятых у 250 пациентов (150 доброкачественное пациентов и 100 пациентов с опухолями) были собраны, и были определены положительными, когда быстрое уреазный тест был положительным. Эти отобранные пациенты также были подтверждены тест 13С дыхания. Доброкачественное пациенты были разделены на поверхностный гастрит, атрофический гастрит и дисплазией согласно патологической классификации. Этот протокол был одобрен Комитетом по этике первой филиал больницы Нанкин медицинского университета по, и каждый пациент письменное информированное согласие.
Культура клеток
Бактериальная культура и инфекция модель
<р> Н. пилори высевали в пластину и культивировали при 37 ° С в микроаэрофильной атмосфере, с 5% O <суб> 2, 10% CO <югу> 2 и 85% N <к югу> 2. После 3-х дней, бактериальный ресуспендировали в среде RPMI-1640 без FBS и инфицированных клеток в MOI 100. Затем клетки собирали через 48 ч инфекции.
Выделение тотальной РНК и количественного ОТ-ПЦР
Immunohistochemistry
<р> Ткани фиксировали в 4% параформальдегида и вырезают из парафина блока 5 мкм толщиной. После депарафинизации с ксилолом и регидратации с серии градуированных этанола, слайды нагревают в автоклаве в течение трех минут с использованием цитрата натрия буфера (рН 6,0) и инкубировали с SOX4 антителом (Signaling Technology Cell) при 4 ° С в течение ночи. Блокирование сыворотки или разбавление антитела буфера использовали в качестве отрицательного контроля. Антитела, используемые до этого были такими же, как для Вестерн-блот-анализа. Фотографии были сделаны microsope (Nikon, ECLIPSE 50i). Число положительных окрашивания клеток, показывающих иммунореактивность SOX4 в десяти представительных микроскопических полей подсчитывали, и процент положительных клеток была также рассчитана. Процент тонировка иммунореактивного опухолевых клеток была описана следующим образом: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), и 3 (> 50%). Интенсивность оценивали следующим образом: 0 (отрицательный), 1 (слабое), 2 (умеренное), и 3 (сильный). Уровень экспрессии SOX4 измеряли путем умножения процент и оценка интенсивности. Образцы высокой экспрессии означает опухолей с умноженной счетом, превышающей 4, а остальные считались низкая экспрессия.
<р> пролиферации клеток исследовали с помощью анализа тетразолиевую водорастворимой соли с использованием клеточной Counting Kit-8 (Dojindo, Кумамото, Япония). Короче говоря, клетки (1,5 × 10 3 /лунку) засевали в 96-луночные культуральные планшеты в трех экземплярах и инкубировали в течение 4 дней при 37 ° C /5% CO2 в увлажненном инкубаторе. Жизнеспособные клетки были количественно определены в каждом 24 часового интервала путем измерения OD450 с использованием микропланшет-ридер. (Эпохи, Биотек, Winooski, VT),
<р> Клетки (2 × 10 6) фиксировали 75% -ным этанолом при 4 ° с в течение ночи и затем промывали холодным PBS и обрабатывали RNaseI, с последующим окрашиванием пропидийиодидом в течение 30 мин в темноте. Анализ клеточного цикла Затем был проведен с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur; Becton Dickinson, Sparks, MD).
<р> Клетки обрабатывали трипсином и высевали на 6-луночные планшеты (500 клеток /лунку) и культивировали в течение 2-х недель. Колонии окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым в течение 30 мин после фиксации 4% параформальдегидом в течение 30 минут. Число колоний, определяемых как > 50 клеток /колоний подсчитывали. были проведены три независимых эксперимента. Данные рассчитаны с помощью парного критерия Стьюдента.
Миграция клеток анализ (ранозаживляющие)
<р> ранозаживляющего анализ использовали для оценки способности опухолевых клеток моторики. Вкратце, клетки (1 * 10 6 /лунку) высевают в шесть-луночные планшеты, культивировали в течение ночи, и трансфицированных микроРНК-204 мимике или ингибитора, pcDNA-SOX4 или pcDNA-NC. При достижении сплошности, клеточный слой поцарапан со стерильным пластиковым наконечником, а затем промывали культуральной средой дважды и снова выращивались в течение до 48 с-сывороткочного среде, содержащей 1% FBS. Замыкание зазор измерялась и данные суммировались основаны на анализах шестеричный для каждого эксперимента.
инвазии клеток анализ
<р> инвазии клеток активность оценивали с использованием клеточной культуры Вставки с износостойким покрытием с базальной мембраны матрицы (BD Biosciences , Bedford, MA) в соответствии с инструкцией изготовителя. Если коротко, то в общей сложности 1 × 105 клеток в 0,2 мл бессывороточной среды RPMI-1640, засевают в аппарате Transwell. Среду RPMI-1640, содержащей 10% FBS (600 мкл) добавляли в нижнюю камеру. После инкубации клеток в течение 24 ч при 37 ° С в инкубаторе с 5% CO2, клетки на верхней поверхности пластины были удалены путем протирания с помощью ватного тампона. Клетки, которые захватившие к нижней поверхности вкладыша были зафиксированы в 100% предварительного охлаждения метанола в течение 30 мин, окрашивают в 0,5% кристаллическим фиолетовым в течение 30 мин, а затем промывали в PBS и подвергали микроскопическому инспекции. Клетки подсчитывали под микроскопом в пяти случайных полей и относительное инвазия и миграция интерпретировались как среднее число клеток ± стандартное отклонение для каждого поля.
вестерн-блоттинга
строительство Плазмида
<р> Прогнозирование сайтов связывания микроРНК-204 была выполнена с использованием программного обеспечения TargetScan (http://www.targetscan.org). 3'-UTR последовательность SOX4 предсказанный взаимодействовать с MIR-204 или мутантной последовательности с предсказанным сайтов-мишеней были вставлены в сайты KpnI и SacI из pGL3 промотора вектора (Invitrogen). Они были названы pGL3-SOX4 и pGL3-SOX4-Мут. Клетки высевали на 6-луночные планшеты и трансфицировали 100 нг pGL3-SOX4 или pGL3-SOX4-Mut, и микроРНК-204 мимике (50 нм) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA). Мы нормализовал разницу в эффективности трансфекции путем совместной трансфекции люциферазы вектор Renilla PRL-SV40 (5 нг).
<Р> ген SOX4 был синтезирован (приобретенный у GenScript, Piscataway, NJ) с ограничительным переваривания с использованием БЗ I и субклонировали PLV-GFP плазмида, и названный PLV-GFP-SOX4. Рекомбинантный лентивирусов был создан из клеток 293Т с использованием осаждения фосфатом кальция. Линии СГК-7901-клеток, трансфицированных лентивирусов с использованием полибрен (8 мкг /мл).
<р> Клетки культивировали в 24-луночных планшетах и трансфецировали 0,2 мкг либо широко типа или мутантный плазмида PGL-SOX4 содержащий люциферазу светляка, вместе с 0,01 мкг PGL-SOX4 вектора (Invitrogen), содержащей рениллы люциферазы и 1 мкг олигонуклеотиды. Трансфекция проводили с использованием Липофектамин 2000 реагента (Invitrogen). Относительная активность люциферазы рассчитывалась 48 ч после трансфекции с помощью двойного люциферазы анализа (Promega). Все эксперименты по трансфекции были проведены в трех повторах и повторяли три раза независимо друг от друга. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение.
Статистический анализ
<р> Т-тест Стьюдента или один дисперсионный анализ был использован для статистического анализа, когда это необходимо. Все статистические анализы проводились с использованием программы SPSS 17.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс). Два хвостами значение P < 0,05 считалось статистически значимым
положительные ткани и клетки
<р> Выражение выбранных микроРНК в соответствии с предыдущими данными микрочипов [10] были обнаружены в 75 пар H.pylori, положительные и отрицательные нормальные ткани, и 50 пар антихеликобактерной положительный и отрицательные ткани опухоли путем ПЦР в реальном времени. Мы обнаружили, что микроРНК-204 был одним из самых значительных микроРНК понижающей регуляции при инфекции H.pylori (рис S1A, 1А, Б). Кроме того, была выражена микроРНК-204 на более низких уровнях в более тяжелых гастритов (рис 1C). Мы также сравнил его экспрессию в опухолевых тканях с нормальными тканями, независимо от статуса H. пилори и обнаружили, что микроРНК-204 было выражено значительно ниже в опухолях (рис s1b). Мы разделили пациентов с опухолью по различным стадиям TNM и Т2-Т4 и M1 пациентов выразили значительно более низкую MIR-204, чем у пациентов Т1 и М0 (рис S1C, S1D). Мы также исследовали экспрессию микроРНК-204 в клетках, инфицированных H. Pylori, и мы обнаружили, что экспрессия микроРНК-204 была значительно ниже в нескольких H. Pylori инфицированных клеток, чем контроль (Рисунок 1D, Рисунок S1E).
MIR-204 подавляет миграцию /инвазию и пролиферацию клеток рака желудка в SGC-7901 и MKN-45 клеток
<р> Мы трансфи- SGC7901 и MKN45 клетки с HSA-микроРНК-204 мимических /ингибитор олигонуклеотиды и исследовали влияние на клеточной пролиферации и миграции /вторжения. Во-первых, мы провели QRT-PCR, чтобы проверить эффективность трансфекции, как показано на рис. 2А, трансфекции клеток с микроРНК-204 /ингибитор имитирует, показал значительно увеличение /уменьшение экспрессии микроРНК-204, по сравнению с их отрицательным контролем (NC /МСО). Заживлении раны анализ показал, что избыточная экспрессия микроРНК-204 может подавлять миграцию клеток, в то время как его нокдаун индуцированной миграции клеток, со значительным более близкого разрыва, чем контроль (Фигура 2В). Последовательно, Матригель нашествие анализ также показал, что избыточная экспрессия микроРНК-204 ослабляется вторжения клеток, в то время как нокдаун это могло обратить любовь (рис 2С). Мы также проводили МТТ и обнаружили, что скорость роста клеток, трансфицированных с ингибитором микроРНК-204 был значительно увеличен по сравнению с контрольной группой в то время как клетки с микроРНК-204 подражает был показан разный (рис 3А, В). Мы также исследовали, будет ли клеточный цикл будет зависеть от нокдауна /избыточная экспрессия микроРНК-204 с использованием флуоресцентного активированного сортировки клеток (FACS) анализ пропидий-йодо-окрашенных клеток. Нокдаун MIR-204 приводит к значительному увеличению процентного содержания клеток в фазах G2 в то время как избыточная экспрессия показал противоположный эффект (фиг.3С). Анализы образования колоний показали, что ингибирование микроРНК-204 значительно увеличило скорость роста клеточных линий (рис 3D). Мы также сравнили функции клеточные трансфекцию с микроРНК-204 имитаторов с мимикой и инфекции H. Pylori. Мы обнаружили, что микроРНК-204 подражает может подавлять миграцию клеток, инвазию и пролиферацию при пилори инфекции H. (рис S2). Эти результаты показали, что вместе с понижением регулирования микроРНК-204, индуцированный хеликобактерной инфекции способствуют миграции /инвазии и пролиферации желудочном линии раковых клеток в пробирке.
MIR-204 до регулируемой экспрессии SOX4 при раке желудка
<р> Мы определили цели вниз по течению от MIR-204 с помощью вычислительного прогнозирования для выяснения механизмов, с помощью которых микроРНК-204 подавленные желудка вторжение раковых клеток. Среди сотен генов, предсказанных онлайн микроРНК целевой сайт прогнозирования (StarBase, http://starbase.sysu.edu.cn/~~HEAD=pobj), мы forcused наше внимание на SOX4. SOX4 было сообщено регулируют прогрессирование рака желудка и EMT или выступать в качестве основной функциональной мишени микроРНК-204. Для того, чтобы определить прогноз, через QRT-ПЦР и иммуногистохимии, мы обнаружили, что SOX4 был повышающей регуляции в H.pylori, положительные ткани. Его выражение было также выше в CAG, чем CG в H. Pylori положительные ткани. (П = 75, р ≪ 0,05; Фиг.4А-С), который был обратно пропорционален MIR-204. Использование корреляционного анализа Пирсона экспрессии мРНК SOX4-микроРНК-204, мы получили статистически значимую обратную корреляцию (рис S3A, R = -0.849, P = 0,002). С помощью иммуногистохимии, мы также обнаружили, что экспрессия SOX4 была в значительной степени связано с желудочным гистологии (р &ЛТ; 0,05; таблица 1). В пробирке, мы также обнаружили, что SOX4 мРНК и уровень белка были повышающей регуляции в желудочном раковых клеток, инфицированных H. Pylori (рис S3B, S3C). Затем мы определили экспрессию SOX4 в ответ на изменения в экспрессии микроРНК-204. Вестерн-блот и анализы QRT-PCR показали, что избыточная экспрессия микроРНК-204 может значительно понижающей регуляции мРНК и экспрессии белка SOX4, в то время как эффект нокдауна MIR-204 было наоборот (рис 3D). Мы также обнаружили, что экспрессия маркеров ЕМТ, N-кадгерина и Е-кадгерина, был также изменен, связанные с микроРНК-204 выражении (рис 4д), который предположил, что микроРНК-204 может влиять на процесс ЕМТ.
SOX4 является прямой целевой ген микроРНК-204 в клетках рака желудка
<р> Хотя SOX4 было расценено как прямой мишенью MIR-204, то неясно, будет ли микроРНК-204 может непосредственно распознавать 3'-UTR из мРНК SOX4. В соответствии с предсказанной целевой сайт из TargetScan, мы клонировали фрагмент 3'-UTR, содержащий предсказанную сайт в люциферазы вектор репортер pGL3 (pGL3-SOX4). Фрагмент 3'-UTR с мутантным последовательности в предсказанном сайте-мишени также клонировали в качестве контроля (pGL3-SOX4-MUT). Результаты показали, что Котрансфекция с микроРНК-204 мимике и вектор pGL3-SOX4 снизилась активность люциферазы в СГК-7901 клеток. Тем не менее, микроРНК-204 подражает не имеют влияния на активность люциферазы, когда клетки трансфицировали pGL3-SOX4-мут вектора (рисунок 5). Эти данные свидетельствуют о том, что ген SOX4 был одним из прямых целей микроРНК-204.
Сверхэкспрессия SOX4 имеет эффект MIR-204 на раковых клетках желудка вторжение
<р>, чтобы определить, как SOX4 функциональная эффектор микроРНК-204 в желудочном инвазии рака, мы сверхвыражен SOX4 трансфекцией с лентивирусов и исследовали его эффекты в желудочном раковых клеток. Избыточная экспрессия SOX4 в клеточной линии была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга (6А). Мы также обнаружили, что Е-кадгерин был вниз регулируется в то время как N-кадгерин был вверх после того, как регулируется PLV-SOX4 трансфекцией. Через заживление ран и вторжение анализа Матригель, мы потом обнаружили, что избыточная экспрессия SOX4 значительно способствовали клеток миграции и инвазии (рисунок 6В и 6С). Для того чтобы дополнительно продемонстрировать, что микроРНК-204 индуцирует потерю SOX4 подавлено пролиферации и инвазии клеток рака желудка, клетки трансфицировали микроРНК-204 мимике и SOX4 сверхэкспрессии вектора вместе, и результаты показали, что подавление миграции, инвазии и пролиферации микроРНК-204 был ослаблен (рис S4).
<р> рак желудка является заболеванием во всем мире с высоким уровнем заболеваемости, особенно в Юго-Восточной Азии [21]. Уровень 5-летней выживаемости при раке желудка является довольно низким. Некоторые из больных раком желудка были антихеликобактерную связаны между собой. Поэтому необходимо тщательно исследовать патогенез и разработать новые целевые методы лечения H. Pylori, связанных с раком желудка.
<Р> микроРНК большое семейство регуляторов генов, которые отрицательно регулируют их мРНК мишеней в порядке последовательности конкретных. микроРНК может также функционировать в качестве супрессоров опухолей или онкогенов [22]. Последние данные свидетельствуют о том, что микроРНК играют существенную роль во многих биологических процессах, связанных с раком, в том числе клеточной дифференцировки, пролиферации, tumorignesis, ангиогенез, инвазию и метастазирование [23]. MIR-204 было сообщено, чтобы функционировать в качестве супрессора опухоли и экспрессия низкого уровня микроРНК-204 связано с плохим прогностическим фенотипа у больных с раком [24], [25]. Тем не менее, было несколько исследований с целью микроРНК-204 в функции H. Pylori, связанных с раком желудка. Здесь мы были первыми, чтобы представить доказательства того, что микроРНК-204 был значительно понижающей регуляции в хеликобактерной положительных тканях (нормальных и опухолевых тканей) и что избыточная экспрессия микроРНК-204 подавленной экспрессии SOX4 белка и роста клеток, полученных из желудка опухоль.
<р> мы сначала количественно экспрессию микроРНК-204 в тканях инфекции H. Pylori и контроля, и мы обнаружили, что экспрессия микроРНК-204 значительно ниже у H. Pylori-инфицированных больных. Мы также обнаружили, что выражение связано с гистологическим пациентов, то есть выражение микроРНК-204 значительно ниже у пациентов, положительных H. Pylori с хроническим атрофическим гастритом, чем хронические не атрофический гастрит. Это выражение модели показали, что вероятность того, что микроРНК-204 связана с различными видами гастрита и более тяжелых пациентов были, тем ниже выражение микроРНК-204 был. На основании уровня экспрессии микроРНК-204, мы выбрали SGC-7901 и клетки MKN45 для последующего усиления из-функции и с потерей функции исследований, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что понижающую регуляцию MIR-204 в клетку рака желудка связана с его прогрессирования. Хотя большое количество человеческих микроРНК сообщалось, многие из их мРНК мишеней остаются неопознанными [9]. В данном исследовании мы использовали комбинированные биоинформатики и экспериментальный подход, чтобы определить, что SOX4 являются функционально нижестоящей мишенью микроРНК-204.
<Р> SOX4 сверхэкспрессируется в различных раковых заболеваний и тесно коррелируют с опухолевой инвазии и метастазирования [ ,,,0],16] - [19]. Он также является одним из членов ЕМТ-транскрипционный индукторов [26]. ЕМТ является ключевым программа развития, которая часто активируется во время прогрессирования рака и может способствовать развитию устойчивости к терапии [27]. Чжан и др [20] показали, что избыточная экспрессия SOX4 в эпителиальных клеток молочных желез человека привело к приобретению мезенхимальных признаков, а также усиленной миграции клеток и вторжения. Кроме того, SOX4 положительно регулирует экспрессию известных ЕМТ индукторов и активировал TGF-бета путь, чтобы внести свой вклад в EMT [28]. На сегодняшний день ЕМТ является привлекательной мишенью для терапевтических вмешательств, обеспечивает новую основу прогрессирования рака к дедифференцированных и более злокачественных состояний [29]. Наше исследование показало, что, во-первых инфекции H.pylori индуцированных микроРНК-204 вниз регулирование может привести к раку желудка процессом ЕМТ.
Поддержка информации Рисунок S1 изображения.
(А) Выражение 5 микроРНК в Н H.pylori, положительные и отрицательные ткани был обнаружен QRT-PCR. (Б) Уровни экспрессии микроРНК-204 в опухолевых тканях и управления. (C) Уровни экспрессии микроРНК-204 в соответствии с TNM стадий. (D) Уровень экспрессии микроРНК-204 в трех видов хеликобактерной инфицированных клеток. (* Р &л; 0,05)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF) Рисунок S2
.
Клетки, трансфицированные микроРНК-204 подражает и мимике с инфекцией H. пилори и (А) viabilities определяли с ССК-8 анализа (B) изображений, отснятых при 0 ч (вверху) и 24 ч (ниже) после ранив было показано при увеличении х200 (C) Типичные изображения инвазивных клеток в нижней части мембраны окрашивали кристаллическим фиолетовым визуализировали, как показано на рисунке. (* Р &л; 0,05)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s002
(TIF) Рисунок S3
.
(А) Относительную экспрессию мРНК микроРНК-204 и SOX4, нормализованного с U6 и GAPDH, оценивали в 15 образцах антихеликобактерной положительных и отрицательных тканей QRT-PCR. (B) обратная корреляция SOX4 и уровней экспрессии микроРНК-204 был рассмотрен (R = -0,920, p = 0,001). (С) Экспрессия мРНК SOX4 определяли с помощью QRT-PCR в H.pylori, инфицированные клетки. (D) экспрессии уровня SOX4 белка определяли с помощью Вестерн-блоттинга в H.pylori, инфицированные клетки. (* Р &л; 0,05)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s003
(TIF) Рисунок S4
.
Клетки, трансфицированные микроРНК-204 подражает и мимике с PLV-SOX4 и (а) viabilities определяли с ССК-8 анализа (B) Типичные изображения инвазивных клеток в нижней части мембраны окрашивали кристаллическим фиолетовым визуализировали, как показано на рисунке. (C) Изображения, сфотографированные в 0 ч (вверху) и 24 ч (ниже) после ранения были показаны при увеличении х200 (* р &ЛТ; 0,05)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s004 <бр> (TIF)
Исследование:микробы, вызывающие сердечные приступы
Дырявый кишечник и микробный дисбактериоз могут способствовать цитокиновому шторму в тяжелых случаях COVID-19
Добавление короткоцепочечных жирных кислот улучшает восстановление после инсульта,
Хронический кашель можно облегчить с помощью нового препарата
Анализ крови на микробную ДНК может предупредить о раке
Будут ли диеты на основе ДНК и персонализированные лечебные продукты - будущее для похудения?
Как массовые обследования помогли выявить больше случаев глютеновой болезни у детей
Новая программа массового обследования детей школьного возраста в Италии показала, что общая распространенность целиакии почти удвоилась за последние 25 лет. Инфографика целиакии. Кредит
Кишечные бактерии связаны с метаболическими изменениями и аутизмом в новом исследовании
Исследователи из Калифорнийского технологического института сделали важное открытие, которое может объяснить, как кишечные бактерии могут способствовать поведению, схожему с аутизмом. Команда обнару
Коронавирусам человека необходимы органические материалы для эффективного переноса между поверхностями
Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) быстро заразил более 191 миллиона человек во всем мире с момента своего появления в конце декабря 2019 года. Вирус вызывает COVID-19