Plos ONE: Zmanjšano Mir-204 v H. pylori-želodca, povezanih z rakom Spodbuja Rak celično proliferacijo in invazijo s ciljanje SOX4

Povzetek

Ozadje

molekularni mehanizem med Helicobacter pylori (H. pylori), okužbe in raka želodca ostala v veliki meri neznan. V tej študiji smo ugotovili vlogo miRNA pri H. pylori povzroča raka na želodcu.

Metode in rezultati

Ugotovili smo, da je bil miR-204 zmanjšalo na H. pylori pozitivnih tkiva s qRT- PCR. Rasklapanje miR-204 povečala invazijo in proliferacije sposobnost želodčne rakavih celic in vitro. Luciferaza testa so pokazali, da je bila SOX4 ciljni gen miR-204, ki je bilo ugotovljeno up-urejena v H. pylori pozitivnih tkiva. Dol-ureditev miR-204 in več, izraz SOX4 spodbuja epitelne-mezenhimskih procesu tranzicije.

Zaključek

Če povzamemo, naše ugotovitve so pokazale, da lahko miR-204 deluje kot supresorski tumorja v H. pylori povzroča raka na želodcu z usmerjanjem SOX4

Navedba. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) zmanjšana MIR-204 v H. pylori-želodca, povezanih z rakom Spodbuja Rak celično proliferacijo in Invasion z usmerjanjem SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10,1371 /journal.pone.0101457

Urednik: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Združene države Amerike

Prejeto: March 18, 2014; Sprejeto: 5. junij 2014; Objavljeno: 1. julij 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga:. avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. Guoxin Zhang je financirala National Natural Science Foundation Kitajske (št 81270476) (http://www.nsfc.gov.cn/). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. Do danes so preiskovali molekularni mehanizmi za rakom želodca, vendar pa niso v celoti razumeli [2]. Želodčni karcinomi naj bi razvili glede na večstopenjski proces karcinogeneze, ki je tesno povezan z okužbo, ki ga bakterijam, Helicobacter pylori
( H. Pylori
) [3]. H. pylori
, ki colonizes želodec 50% svetovnega prebivalstva, je bil razvrščen v razred I rakotvorne snovi zaradi njene vzročnega vlogo pri razvoju raka želodca [4].

To je bila prijavljena da se razvoj in napredovanje raka želodca lahko pripišemo microRNAs (miRNAs) [5] - [8]. MiRNAs so majhne, ​​nekodiran RNA, ki uravnavajo izražanje ciljnih genov s translacijskih represijo ali RNK (mRNA) degradacija [9]. MIR-204 abnormalnih so poročali, da povezati z različnimi vrstami raka [10], [11]. Vendar pa je le malo znanega o funkciji miRNA-204 raka želodca. Matsushima izvedli miRNA študija niz v H. pylori pozitivnih tkiva in contols in ugotovil, da je miR-204 izraz bistveno nižja v H. pylori pozitivnih tkiva [12].

Pri človeku je sex regijo, ki določa Y (Sry ) box družina, imenovan tudi družini SOX, vsebuje 20 visoko ohranjene transkripcijske faktorje, ki igrajo pomembno vlogo pri razvoju raka na prostati [13]. Ti transkripcijski faktorji so opredeljeni s ohranjene zaporedje podpis v skupino visoko mobilnost (HMG) domeno DNK veže (DBD) [14], [15]. SOX4 je 47-kDa protein je zelo ohranjena v vretenčarjev in njegov klinični pomen je pridobil več pozornosti v zadnjih letih, s številnimi poročila, ki nakazujejo, da SOX4 lahko prispeva k tumorja napredovanja [16], [17]. Povečana ekspresija SOX4 najdemo v tumorjev mehurja, prostate in debelega črevesa, in pljučnih tumorjev nemajhnih celic [18] - [21]. Deregulacije izraz SOX4 je povezano s povečano rak celično proliferacijo, preživetje celic, inhibicijo apoptoze in napredovanje tumorjev pri raku želodca [22]. Njegova preveč izraz je bil prav tako povezan s slabo prognozo v klinikah in je označevalec napovedati izid bolnikov z rakom želodca [23].

Vendar, do pred kratkim, je jasno, da to, ali H. okužba pylori lahko povzroči SOX4 izražanje skozi navzdol ureja MIR-204. Tako smo izvedli našo študijo, da bi še dodatno raziskati vlogo miR-204 in SOX4 v H. pylori inducirano rakotvornost.

Materiali in metode

kliničnih vzorcih

Bolniki z ali brez H. pylori
okužba so prestali gastroskop na prvi odvisnimi bolnišnici Nanjing Medical University, Jiangsu province, Kitajska od marca 2012 do decembra 2013. Vzorci so bili odvzeti iz 250 bolnikov (150 noncancerous bolniki in 100 bolnikov s tumorjem) so bili zbrani in so bili ugotovljeni pozitivni, ko je bil hitri test ureaze pozitiven. Ti izbrani bolniki so potrdili tudi s testom 13C v izdihanem zraku ^{. Noncancerous bolniki so bili razvrščeni v površinskem gastritis, atrofični gastritis in displazija po patološki klasifikaciji. Ta protokol je odobrila etični odbor prvega povezana bolnišnici Nanjing Medical University, in vsak bolnik je napisal privolitev.}

celične kulture

SGC-7901 /MKN45 želodca rakave celične linije ( kupljene od ATCC) smo kultivirali v RPMI-1640 medij z dodatkom 10% fetalni goveji serum (FBS) (Gibico) in penicilin (100 U /ml). Celice smo gojili pri 37 ° C v navlaženi atmosferi s 5% CO _2.

Bakterijska kultura in okužba modela

H. pylori smo inokulirali v ploščo in gojimo pri 37 ° C v mikroaerofilnih atmosferi s 5% O _{2, 10% CO 2 in 85% N 2. Po 3 dneh smo bakterijski resuspendirali v RPMI-1640 medij brez FBS in okuženih celic v MOI 100. Celice so bile nato poberemo po 48 h infekcije.}

Izolacija celotne RNA in kvantitativne RT-PCR

Skupaj RNA so pridobljeni iz zbranih tkiv in celičnih linij z uporabo TRIzola (Tarkara, Japonska) in nato tako miRNA in mRNA so reverzno prepisana na cDNA. Obratno prepisovanje smo izvedli z reverzno transkripcijo kit (Takara, Japonska). Izraz zrelih miRNAs in potencialnih ciljnih genov so bile izmerjene z QRT-PCR z SYBR Green PCR Kit (Takara) na Applied Biosystems StepOne-Plus PCR v realnem času sistema in človeških U6 RNA je bila dopolnjena kot notranji nadzor. Relativna izraz razmerje miR-204 je bila izračunana po -ΔΔCT metodo 2 ^{. PCR reakcije smo izvedli z naslednjimi primerji: za HSA-miR-204, naprej, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'in za U6, naprej, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. Relativne vrednosti izraz za SOX4 mRNA je pregledal SYBR Green PCR v realnem času (RT-PCR) in normaliziran GAPDH. Primerji za SOX4 bilo naprej, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' in nazaj, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; in GAPDH, naprej, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'in obratno, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR smo izvedli s pomočjo ABI 7500 Fast PCR v realnem času sistem (ABI, CA, ZDA).}

Imunohistokemija

Robčki so bile določene v 4% paraformaldehid in narežemo iz parafinskega blok 5 um debeline. Po razvoskanjem s ksilenom in rehidraciji s stopenjski seriji etanola smo drsi segrevamo v avtoklavu tri minute z uporabo citratnega pufra natrijev (pH 6,0) ter inkubiramo s SOX4 protiteles (signalna Technology Cell) pri 4 ° C preko noči. Blokiranje serum ali redčenje protiteles pufer smo uporabili kot negativni kontroli. Protitelesa izkoriščena, preden so bili enaki kot pri Western blot analizo. Fotografije so bile posnete s microsope (Nikon, ECLIPSE 50i). preštejemo število pozitivnih obarvanje celic, ki kažejo radioinkorporacijo od SOX4 v desetih reprezentativnih mikroskopskih polj, in je bila izračunana tudi odstotek pozitivnih celic. Odstotek točkovanje imunoreaktivnih tumorskih celic je opisal takole: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) in 3 (> 50%). Intenzivnost je dosegel takole: 0 (slabo), 1 (šibko), 2 (zmeren) in 3 (močan). Nivo izražanja SOX4 bila izmerjena z množenjem odstotek in rezultat intenzivnosti. Visoke izraz vzorci pomeni tumorje z multiplicirano rezultatom več kot 4 ostali pa so menili, da je nizka izraz.

proliferacijo celic assasy

Cell širjenje bila preučena s testom tetrazolijevega soli vodotopne pomočjo Cell štetje Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska). Na kratko, celice (1,5 x 10 ^{3 /jamico) smo posejali v kulturi ploščah s 96 vdolbinami v treh izvodih in inkubirali 4 dni pri 37 ° C /5% CO2 v vlažnem inkubatorju. Živih celic so bile količinsko na vsakem intervalu 24 h z merjenjem OD450 uporabo mikroploščnega bralca. (Epoch; BioTek, WINOOSKI, VT)}

Cells (2 x 10 ^{6), so bile določene z 75% etanolom pri 4 ° C preko noči in nato sprali s hladnim PBS in obdelamo z RNaseI, čemur sledi obarvanje s propidijevim jodidom v 30 min v temi. Analiza celični cikel je nato izvaja citometrije pretoka (FACSCalibur; Becton Dickinson, Sparks, MD).}

Celice tripsiniziramo in nanese na 6 vdolbinami (500 celic /dobro) in kultivirani 2 tedna. Kolonije smo obarvali z 1% kristal vijoličnim 30 minut po posnetka s 4% paraformaldehida v 30 minutah. Število kolonij, ki so opredeljene kot > 50 celic /kolonije so bili prešteti. Tri neodvisne poskuse smo izvedli. Podatki so bili izračunani s pomočjo seznanjenih t test.

Cell migracije test (rane-ran)

A-celjenje ran test smo uporabili za oceno sposobnosti tumorskih celic gibljivost. Na kratko, celice (1 * 10 ^{6 /dobro) smo posejali v šestih vdolbinami, kultivirani čez noč, in transfekciji z miR-204 posnema ali inhibitor, pcDNA-SOX4 ali pcDNA-NC. O doseganju sotočje je bila celična plast opraskan s sterilno plastično konico in nato speremo z gojišča dvakrat gojimo še do 48 s pomočjo seruma zmanjša mediju, ki vsebuje 1% FBS. Zaprtje Vrzel smo merili in podatki, ki so temeljili povzeta na Šestposteljna testih za vsak poskus.}

Cell invazija test

Cell invazija aktivnost je bila ocenjena s pomočjo celične kulture vložke prevlečeni s kleti membransko matrico (BD Biosciences Bedford, MA), v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko smo skupaj z 1 x 105 celicami v 0.2 ml seruma RPMI-1640 medij zasejemo na aparatu Transwell. RPMI-1640, ki vsebuje 10% FBS (600 ul) dodamo k spodnji komori. Po inkubaciji celic za 24 ur pri 37 ° C v 5% CO2 inkubatorju smo celice na zgornji površini vložka odstranimo z brisanjem z bombažno krpico. Celice, ki napadel na spodnji strani vložka bile določene v 100% predhodno hladilnega metanola 30 minut, obarvane v 0,5% kristal vijoličnim 30 minut, nato pa sprali v PBS in izpostavljeni mikroskopskem pregledu. Celice smo prešteli pod mikroskopom v petih naključnih področjih in relativno invazija in migracije so bile razlagati tako, da je povprečno število celic ± standardni odklon na tem področju.

smo pripravili Western blot

Skupaj beljakovine in količinsko, z uporabo protein test (metoda BCA, Thermo, ZDA). Proteine ​​smo frakcionirali z natrijevim dodecil sulfat poliakrilamidom gelsko elektroforezo (SDS-PAGE), prenese na poliviniliden fluorid (PVDF) membrano, blokirana v 5% suhe mleku pri sobni temperaturi 1 uro in imunoreaktivnosti s protitelesi pri 4 ° C preko noči z uporabo anti-SOX4 ( 1:1000, SU, ZDA), anti-N-kadherina (1:1000, SU, ZDA) in anti-E-kadherina (1:1000, SU, ZDA). Anti-GAPDH (1:5000, sigma, ZDA) smo uporabili kot kontrolo obremenitve. Rezultate smo prikazali skozi kemiluminescenčni sistem za zaznavanje (Pierce ECL Podlaga Western sistem za zaznavanje blot, Thermo, Pittsburgh, PA), nato pa so izpostavljeni v molekularno tipala ChemiDoc XRS sistema (Bio-Rad, Hercules, CA).

gradbeni plazmida

Napoved miR-204 vezavnih mest je bila izvedena z TargetScan programska oprema (http://www.targetscan.org). 3'-UTR zaporedje SOX4 ki je bilo napovedano za interakcijo z miR-204 ali mutanta zaporedja s predvidenih ciljnih območij so bile vstavljene v mestih Kpnl in SACI v pGL3 promotorja vektorja (Invitrogen). Imenovali so ga pGL3-SOX4 in pGL3-SOX4-mut. Celice smo nanesli na 6 vdolbinami in smo transfektirali z 100 ng pGL3-SOX4 ali pGL3-SOX4-Mut in miR-204 posnema (50 nm) z Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, ZDA). normalizirali smo razlike v učinkovitosti transfekcije s sočasno transfekcijo Renilla luciferazno vektor PRL-SV40 (5 ng).

SOX4 gena smo sintetizirali (kupljene od Genscript, Piscataway, NJ) z omejevalno prebavo uporabo Mlul in subklonirali PLV-GFP plazmid, in ga poimenovali PLV-GFP-SOX4. Rekombinantni lentivirusni smo ustvarili s 293T celic, ki uporabljajo kalcijev fosfat padavin. celične linije SGC-7901 smo transfektirali z lentivirusni uporabo polybrene (8 ug /ml).

luciferazne aktivnosti analiza

Celice smo gojili v 24-vdolbinami in transfektirali z 0,2 ig bodisi širokim Tip ali mutant PGL-SOX4 plazmidov vsebuje Firefly luciferazo, skupaj z 0,01 ug s PGL-SOX4 vektorju (Invitrogen), ki vsebuje renilla luciferazo in 1 ug oligonukleotidov. Transfekciji smo izvedli s pomočjo Lipofectamine 2000 reagenta (Invitrogen). Relativna luciferazno aktivnost je bila izračunana 48 h post-transfekciji jih Dual luciferazni Reporter Vsebnost (Promega). Vse transfekcijske poskuse smo izvedli v treh izvodih ponovili trikrat neodvisno. Podatki so izraženi kot povprečje ± SD.

Statistična analiza

t-test in enosmerna analiza variance je za statistično analizo, uporablja, kadar je to primerno. Vse statistične analize smo opravili s pomočjo SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Dve zimsko vrednost P < 0.05 smo imeli statistično značilno

Rezultati

MIR-204 je odklonsko navzdol urejeno v H.. pylori
pozitivne tkiva in celice

Izraz izbranih miRNAs po predhodnih podatkih mikromrež [10] so bile ugotovljene v 75 parov H. pylori pozitivnih in negativnih normalnih tkiv ter 50 parov H. pylori pozitivno in negativni tumorskih tkiv s PCR v realnem času. Ugotovili smo, da je miR-204 eden izmed najpomembnejših miRNAs navzdol reguliranih na okužbo s H. pylori (slika S1A, slika 1A, B). Poleg tega je bila miR-204, izraženo na nižjih ravneh v več hudo gastritis (slika 1C). Nadaljevali smo primerjali svoj izraz v tumorskih tkivih z normalno tkivo, ne glede na status H. pylori in ugotovil, da je bil miR-204 izražena precej nižja v tumorjih (Slika S1B). smo razdelili bolnike s tumorjem po različnih stopnjah TNM in T2, T4 in M1 bolnikov izrazil precej nižjo MIR-204 kot T1 in M0 bolnikov (Slika S1C, S1D). Pregledali smo tudi miR-204 ekspresijo v celicah, okuženih z bakterijo H. pylori in smo ugotovili, da je bil izraz miR-204 bistveno nižji pri multipli H. pylori okuženih celic kot kontrolo (Slika 1D, slika S1E).

MIR-204 zavira migracije /invazijo in širjenje želodčnih rakavih celic v SGC-7901 in podjetja MKN 45 celic

transfekcirajo SGC7901 in MKN45 celice z HSA-miR-204 mimičnih /zaviralci oligonukleotidov in preverila učinke na celične proliferacije in migracije /invazija. Najprej smo izvedli QRT-PCR, da se preveri učinkovitost transfekcije, kot je prikazano na sliki. 2A, transfekcija celic z miR-204 posnema /zaviralcem pokazale znatno povečanje /zmanjšanje miR-204 izražanja v primerjavi z njihovo negativne kontrole (NK /Inc). Celjenje ran testa so pokazali, da bi prekomerno ekspresijo miR-204 zatiranje migracijo celic, medtem ko je njegov rasklapanje inducirane celične migracije, z znatnim tesnejše vrzel kot kontrolo (slika 2B). Dosledno, poskus vdora v Matrigel je tudi pokazala, da je prekomerno ekspresijo miR-204 oslabljen celično invazijo, ker bi lahko rasklapanje njega obrne naklonjenost (slika 2C). Prav tako smo izvedli MTT testom in ugotovili, da je bila stopnja rasti celic transfekciji z miR-204 zaviralec znatno povečal v primerjavi s kontrolno skupino, medtem ko so celice z miR-204 posnema pokazala drugačna (slika 3A, B). tudi preučili bomo, ali bo celični cikel vpliva na rasklapanje /prekomerno izražanje miR-204 z uporabo-fluorescence aktivira celice sortirna analiza (FACS) od propidijevim-jodid-obarvanih celic. Rasklapanje miR-204 za posledico znatno povečanje odstotkov celic v fazi G2, ko prekomerno ekspresijo pokazala ravno nasproten učinek (slika 3C). Colony formation testi so pokazali, da zaviranje miR-204 znatno povečala stopnjo rasti celičnih linij (slika 3D). Primerjali smo tudi funkcije celične transfektiranje z miR-204 posnema z mimiko in okužbo s H. pylori. Ugotovili smo, da bi lahko miR-204 posnema zavirajo migracijo celic, invazijo in širjenje na H. pylori okužbe (Slika S2). Ti rezultati skupaj pokazali, da dol ureditev miR-204, ki ga okužbe H. pylori povzroča spodbujati migracije /invazijo in širjenju linije želodca rakave celice in vitro.

MIR-204 up urejene SOX4 izražanja v raka želodca

opredeljene cilje nižji stopnji mir-204, ki ga računsko napoved za pojasnitev mehanizmov, s katerimi miR-204 potlačene želodčni rak celic invazijo. Med več sto genov, ki jih spletni miRNA spletni ciljna napoved (starBase, http://starbase.sysu.edu.cn/~~HEAD=pobj) predvideti, smo forcused našo pozornost na SOX4. SOX4 so bili predloženi za uravnavanje želodčne napredovanje raka in EMT ali delujejo kot osnovno funkcionalno cilj miR-204. Za identifikacijo napovedi, s QRT-PCR in imunohistokemijo, smo ugotovili, da je SOX4 up-urejena v H. pylori pozitivnih tkiva. Njen izraz je bila višja tudi v OAS, kot CG v H. pylori pozitivnih tkiva. (N = 75, p 0.05; Slika 4A-C), ki je bila obratno povezana z miR-204. Uporaba analize korelacije Pearson je v SOX4-miR-204 ekspresijo mRNA, smo dobili statistično značilno inverzno povezanost (slika S3A, R = -0.849, P = 0,002). Uporabi imunohistokemično smo tudi ugotovili, da je SOX4 izraz značilno povezana z želodčno histologijo (p < 0,05; tabela 1). In vitro, smo tudi ugotovili, da so bile SOX4 mRNA in raven beljakovin up-urejena v želodčnih rakavih celic, okuženih s H. pylori (slika S3B, S3C). Nato smo določili ekspresijo SOX4 odziv na spremembe v miR-204 ekspresijo. Western blot in QRT-PCR testi so pokazali, da prekomerno ekspresijo miR-204 lahko bistveno navzdol regulacijo mRNA in proteina izražanje SOX4, medtem ko je bil učinek rasklapanje Mir-204 obratno (slika 3D). Prav Ugotovili smo, da je izražanje EMT markerjev, N-kadherina in E-kadherina, se je spremenila tudi povezana z miR-204 ekspresijo (slika 4E), ki nakazujejo, da bi miR-204 vpliva na proces EMT.

SOX4 je neposreden cilj gen miR-204 v želodčnih rakavih celic

Čeprav je bil SOX4 obravnavati kot neposreden cilj miR-204, ni jasno, ali lahko miR-204 neposredno priznavajo 3'-UTR za SOX4 mRNA. Glede na predvideno ciljno stran od Targetscan smo klonirali fragment 3'-UTR vsebuje predvideno mesto v pGL3 luciferazno reporter vektorja (pGL3-SOX4). 3'-UTR fragment z mutiranim sekvence v predvidenem ciljnem mestu smo klonirali tudi kot kontrolo (pGL3-SOX4-Mut). Rezultati so pokazali, da so-transfekciji z miR-204 mimike in pGL3-SOX4 vektorja zmanjšala luciferazno aktivnost v SGC-7901 celic. Vendar, miR-204 posnema ni imela učinka na luciferazno aktivnost, ko so celice transficirane z pGL3-SOX4-Mut vektorja (slika 5). Ti podatki kažejo, da je bila SOX4 gen eden od neposrednih ciljev miR-204.

ima Prekomerno izražanje SOX4 učinek miR-204 na želodcu rakavih celic invazija

Če želite ugotoviti, SOX4 kot funkcionalna efektor miR-204 želodčnega invazije raka, smo preveč izražen SOX4 s transfekcijo z lentivirusom in preučiti njegove učinke v želodčnih rakavih celic. Prekomerno izražanje SOX4 v celični liniji smo potrdili z western blot analiza (slika 6A). Prav Ugotovili smo, da je E-kadherina navzdol regulirano medtem ko je N-kadherina navzgor regulirano po PLV-SOX4 transfekciji. Preko celjenje ran in poskusu vdora v Matrigel smo nato odkrili, da je prekomerno izražanje SOX4 bistveno spodbuja celice migracije in invazije (slika 6B in 6C). Da bi še dodatno dokazuje, da miR-204 povzroča izgubo SOX4 zatreti orožja in invazije želodca rakavih celic, so bile celice transfekciji s miR-204 mimike in SOX4 prekomerno ekspresijo vektor skupaj, in rezultati so pokazali, da je zatiranje migracije, invazije in orožja, ki ga miR-204 je bil oslabljen (Slika S4).

Pogovor

rak želodca je svetovni bolezen z visoko incidenco, predvsem v jugovzhodni Aziji [21]. Stopnja preživetja 5 let za raka želodca, je precej nizka. Nekateri bolniki želodca z rakom je bila H. pylori povezani. Zato je treba temeljito raziskati patogenezo in razviti nove ciljne zdravljenja za H. pylori, povezane z rakom želodca.

MiRNAs so velika družina genov regulatorjev, ki negativno uravnavajo svoje ciljne mRNK v sekvenčno specifično način. miRNAs lahko deluje tudi kot tumorskih razbijal ali onkogeni [22]. Nedavni dokazi kažejo, da miRNAs igrajo bistveno vlogo v številnih bioloških procesih, povezanih z rakom, vključno s celično diferenciacijo, proliferacijo, tumorignesis, angiogenezo, invaziji in metastaz [23]. MIR-204 so poročali, da deluje kot je zaviralnih in izražanje nizko stopnjo miR-204, povezano s slabim prognostičnih fenotipa pri bolnikih z rakom [24], [25]. Vendar pa je bilo nekaj proučevali miR-204 funkcije v H. pylori, povezanih z rakom želodca. Tukaj smo bili prvi, ki predstavi dokaze, da je bil miR-204 občutno navzdol urejeno v H. pylori pozitivnih tkiv (normalne in tumor tkiva), in da prekomerno ekspresijo miR-204 zatreti izražanje SOX4 beljakovin in rast celic, pridobljenih iz želodčni tumor.

najprej smo kvantitativno izražanje miR-204 v H. pylori okužbe tkiv in nadzora in smo ugotovili, da je izraz miR-204 bistveno nižja v H. pylori bolnikih, okuženih. Prav tako smo ugotovili, da je izraz, povezan s histologijo bolnikov, torej izraz miR-204, je bistveno nižja v H. pylori pozitivnih bolnikih s kronično atrofičnega gastritisa, kot kroničnega ne-atrofični gastritis. Ta izraz vzorec je pokazala, da je bila možnost, da se miR-204, povezane z različnimi vrstami gastritis in bolj resnih bolnikov, je bila nižja izraz miR-204. Glede na stopnjo izražanja miR-204, smo se odločili SGC-7901 in MKN45 celice za naknadno oziroma dobiček-of-funkcijo in izguba-of-funkcijo študij,. Rezultati kažejo, da je navzdol regulacijo miR-204 v želodčnem rakave celice povezan z njegovo napredovanje. Čeprav so bili opisani številni človeških miRNAs, mnogi njihovi mRNA cilji ostajajo neznani [9]. V tej študiji smo uporabili kombiniran bioinformatiko in eksperimentalni pristop, da prepoznajo, da SOX4 so ciljna funkcionalno navzdol miR-204.

SOX4 je preveč izražena v različnih rakavih obolenj in je bila tesno povezana s tumorsko invazijo in metastaz [ ,,,0],16] - [19]. Prav tako je eden izmed članov EMT-transkripcijski induktorjev [26]. EMT je ključni razvojni program, ki se pogosto vključi pri napredovanju raka in lahko prispevajo k odpornosti na zdravljenje [27]. Zhang et al [20] je pokazala, da čezmernim SOX4 v mlečnih epitelijskih celic človeških pripeljala do pridobitve mezenhimskih lastnosti in večji celični migraciji in invazijo. Poleg tega SOX4 pozitivno regulirano ekspresijo znanih EMT induktorjev in aktivira TGF-beta pot je, da prispeva k EMT [28]. Do danes, EMT je privlačen cilj za terapevtskih posegov, določa novo podlago za napredovanje raka do dediferencirane in več malignih držav [29]. Naša raziskava je najprej pokazala, da okužba s H. pylori povzroča miR-204 navzdol bi ureditev vodi do raka želodca, ki ga EMT procesa.

Za zaključek naše dokazi pokazali, da je bila miR-204 navzdol urejeno, medtem ko je bil SOX4 navzgor urejeno pri okužbi z bakterijo H. pylori in raka želodca. Zunajmaternična miR-204 izraz zmanjšala SOX4 izraz na ravni mRNA in proteinov, v rakave celice linije želodca. Prav Pokazali smo, da je bila miR-204 neposredno vezan na 3'-UTR od SOX4. MIR-204 izraz zaviral EMT z zatiranjem SOX4. Poleg tega lahko miR-204-EMT pot, da smo ugotovili, je treba izkoristiti v terapevtski pristop za zdravljenje rakavih obolenj, povezanih H. pylori.

Podpora Informacije
Slika S1.
(A) Z izrazom 5 miRNAs v H pylori pozitivnih in negativnih tkiva odkril QRT-PCR. (B) Ravni izraz Mir-204 v tumorskih in nadzora tkivih. (C) Ravni izraz Mir-204 po TNM fazah. (D) Raven izražanja miR-204 v treh vrste H. pylori okužene celice. (* P < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s001
(IOD)
Slika S2.
celice transficirane z miR-204 mimike in posnema z okužbo pylori H. in (A) je viabilnost so bile določene z CCK-8 testom (b) slike fotografirane pri 0 h (zgornji) in 24 h (nižji) po poškodbi so bili prikazani na povečavi X200 (C) reprezentativne slike invazivnih celic na dnu membrane obarvanih s kristal vijoličnim smo prikazali kot je prikazano. (* P < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s002
(IOD)
Slika S3.
(A) Relativni mRNA izraz miR-204 in SOX4, normalizirane z U6 in GAPDH, je bila ugotovljena v 15 vzorcih H. pylori pozitivnih in negativnih tkiva s QRT-PCR. (B) inverzna korelacija SOX4 in miR-204 stopnjah izražanja je bila preučena (R = -0,920, P = 0,001). (C) Izraz SOX4 mRNA smo določili s QRT-PCR v H. pylori okužene celice. (D) Izraz stopnje SOX4 proteina smo določili z Western blot v H. pylori okužene celice. (* P < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s003
(IOD)
Slika S4.
celice transficirane z miR-204 mimike in posnema z PLV-SOX4 in (A) je viabilnost so bile določene z CCK-8 testom (B) Reprezentativne slike invazivnih celic na dnu membrane obarvanih s kristal vijoličnim smo prikazali kot prikazani. (C) Slike, fotografirane pri 0 h (zgornji) in 24 h (nižji) po poškodovanje so bili prikazani na povečavi x200 (* p < 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)

• Plos ONE: Ali Tumor Velikost izboljša natančnost prognostičnih predvidevanja v Node-Negative želodca raka (pT1-4aN0M0 faza)
• Plos ONE: D-Dimer: ne samo pokazatelj venske tromboze, ampak Predictor asimptomatičnega hematogenim metastaz želodčnega raka Patients